全长骨桥蛋白体外活化树突状细胞的方法与流程

文档序号:11145047
全长骨桥蛋白体外活化树突状细胞的方法与制造工艺

本发明涉及细胞生物工程领域,具体为一种骨桥蛋白活化树突状细胞的方法。



背景技术:

全长骨桥蛋白(osteopontin,OPN)作为带负电的非胶原性骨基质糖蛋白,广泛的分布于多种组织和细胞中,其相对分子质量约为44kDa,约含300个氨基酸残基,骨桥蛋白多肽链的二级结构中包括8个α螺旋和6个β折叠结构,高度保守的RGD基元两端各有一个β折叠结构,分子中心部位是a螺旋结构。全长骨桥蛋白中包括凝血酶裂解位点:RGD序列结构中有RS位点,位于RGD序列羧基端第6位氨基酸残基所形成的肽键,是凝血酶的裂解位点,可将其裂解成45kD及24kD两个片断。其中45kD片断更能刺激细胞的黏附和迁移。

OPN广泛的分布于多种组织和细胞中,能够参与组织修复,自身代谢等功能。正常情况下其表达甚微的细胞,如巨噬细胞、SMC、T淋巴细胞、成纤维细胞等在一些诱导因素下可以大量表达OPN,包括:(1)高血压,(2)高血糖,(3)低氧,(4)干扰素,(5)成纤维细胞生长因子,(6)其他因素。

OPN可表达于各种组织里,不同细胞类型也能表达OPN,如骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞(SMC)、活化的T细胞、MФ和自然杀伤细胞(NK)细胞亚群;OPN也存在正常体液里,如血清、乳汁、尿液,胆汁。病理状态(免疫性疾病、炎症和肿瘤)OPN表达增强,如大肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌及各种转化细胞系亦能高水平表达OPN。

外周血单个核细胞,PBMC(peripheral blood mononuclear cell),指外周血中具有单个核的细胞,包含淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。树突状细胞(Dendritic cells,DC),因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名,是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC),它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原,未成熟树突状细胞具有较强的迁移能力,成熟树突状细胞能有效激活初始型T细胞,处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。

树突状细胞自身具有免疫刺激能力,是目前发现的惟一能激活未致敏的初始型T细胞的APC。人体内大部分树突状细胞处于非成熟状态,表达低水平的共刺激因子和粘附因子,体外激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低,但未成熟树突状细胞具有极强的抗原吞噬能力,在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时即分化为成熟树突状细胞,而成熟的树突状细胞表达高水平的共刺激因子和粘附因子。树突状细胞在成熟的过程中,由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官,与T细胞接触并激发免疫应答。

T细胞的有效活化需要两个信号的参与,即需要抗原肽-MHC复合物与TCR-CD 3结合提供第1信号,以及共刺激分子介导的第2信号。最基本的共刺激信号由抗原递呈细胞表达的CD80、CD86分子与T细胞上表达的相应受体提供。

树突状细胞作为目前发现的功能最强的APC,能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)生成。近年来研究表明,应用肿瘤相关抗原或抗原多肽体外冲击致敏树突状细胞,回输或免疫接种于载瘤宿主,可诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应。

树突状细胞与肿瘤的发生、发展有着密切关系,大部分实体瘤内浸润的树突状细胞数量多则患者预后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答,CD8+T细胞的活化需要树突状细胞递呈抗原的过程,此过程中CD80、CD86等共刺激分子发挥了重要作用,这也是树突状细胞作为免疫治疗手段的基础。

树突状细胞在成熟的过程中,由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官,与T细胞接触并激发免疫应答。树突状细胞作为目前发现的功能最强的APC,能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)生成。近年来研究表明,应用肿瘤相关抗原或抗原多肽体外冲击活化树突状细胞,回输或免疫接种于载瘤宿主,可诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应。其抗肿瘤的机制如下:①树突状细胞可以高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子,MHC分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合,形成肽-MHC分子复合物,并递呈给T细胞,从而启动MHC-I类限制性CTL反应和MHC-Ⅱ类限制性的CD4+Thl反应。同时,树突状细胞还通过其高表达的共刺激分子(CD80/、CD86/、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号,启动了免疫应答。②树突状细胞与T细胞结合可大量分泌IL-12、IL-18激活T细胞增殖,诱导CTL生成,主导Th1型免疫应答,利于肿瘤清除;激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用;③树突状细胞分泌趋化因子(Chemotactic Cytokines,CCK)专一趋化初始型T细胞促进T细胞聚集,增强了T细胞的激发。保持效应T细胞在肿瘤部位长期存在,可能通过释放某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。上述CCK进一步以正反馈旁分泌的方式活化树突状细胞,上调IL-12及CD80、CD86的表达;同时树突状细胞也直接向CD8+T细胞呈递抗原肽,在活化的CD4+T细胞辅助下使CD8+T细胞活化,CD4+和CD8+T细胞还可以进一步通过分泌细胞因子或直接杀伤,增强机体抗肿瘤免疫应答。

流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法。它集中了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。利用流式细胞仪可以对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观、多参数相关的检测。流式细胞仪的基本原理是采用流体动力学聚焦以保证细胞按同一方式逐一通过激光束(检测区)。当样本流中的细胞经过流动室中的检测区时,椭圆形的激光束即可检测到细胞信号。包括细胞的散射光以及细胞上标有的荧光染料发出的激光。

T细胞及树突状细胞细胞是肿瘤免疫的重要效应细胞,是宿主抵抗肿瘤细胞生长的第一道防线。机体正常的免疫机制有赖于辅助性T细胞与抑制性T细胞比值的协调,故树突状细胞、T淋巴细胞及其亚群能够直接反映机体细胞免疫的状态。

活化血液中树突状细胞非常重要:首先树突状细胞功能的强弱与机体免疫功能密切相关,发病初期如果树突状细胞诱导T细胞活化功能较弱,可预测患者可能预后不佳,肿瘤侵袭度高;其次,肿瘤、感染等疾病患者树突状细胞功能降低,树突状细胞功能的强弱与疾病的预后密切相关。

现有技术中,尚不能有效体外活化树突状细胞,而达到增强免疫,增加抗肿瘤作用的目的。因此现急需发明一种活化树突状细胞的方法以解决活化T细胞、抗肿瘤的作用。



技术实现要素:

本发明要解决的技术问题是提供一种采用骨桥蛋白体外活化血液中树突状细胞的方法。

为了解决上述技术问题,本发明提供一种全长骨桥蛋白体外活化树突状细胞的方法:在外周血单个核细胞(PBMC)悬液中加入浓度为5g/ml的全长骨桥蛋白(OPN)稀释液,放入37℃、5%CO2的细胞培养箱培养48±2小时,从而实现对外周血单个核细胞(PBMC)中的树突状细胞(DC)的活化;

所述外周血单个核细胞(PBMC)悬液与全长骨桥蛋白(OPN)稀释液的用量比为:1ml/(50±5)ul。

作为本发明的全长骨桥蛋白体外活化树突状细胞的方法的改进:外周血单个核细胞(PBMC)悬液的制备方法为:

将PBMC用改进型RPMI 1640培养液(即,含10%FBS、100IU/L青霉素、100g/L链霉素的RPMI 1640培养液)稀释成1×106/L~2×107/L,然后于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养48±2小时;

上述改进型RPMI 1640培养液(即,含10%FBS、100IU/L青霉素、100g/L链霉素的RPMI 1640培养液)的配制方法为:取常规的RPMI 1640培养基1000ml,加入0.1L的FBS(胎牛血清)、100IU青霉素、100g链霉素,均匀混合。

在本发明中,全长骨桥蛋白(OPN)稀释液采用PBS缓冲液(pH7.2~7.4)进行稀释。

本发明利用OPN活化外周血PBMC中树突状细胞的检测方法,可按照以下步骤进行:

(1)从大肠癌患者外周血全血中分离出外周血单个核细胞,即PBMC;

(2)通过流式细胞术检测PBMC中DC细胞的表达量;

(3)在健康成年人中,当CD80、CD86占PBMC中DC的比例分别为(8.5±1.01)%和(34.4±1.08)%(是指P<0.05,该数值有统计学意义),表示外周血单个核细胞中DC细胞的活性处于正常范围;同时,在大肠癌患者中,当CD80、CD86占PBMC中DC的比例分别低于(8.5±1.01)%和(34.4±1.08)%时,表示外周血单个核细胞中DC细胞处于免疫抑制状态,树突状细胞诱导的抗肿瘤功能受到了抑制。采用本发明方法OPN刺激后大肠癌患者、健康成人的PBMC中,CD80、CD86占PBMC中DC的比例分别升高,表示外周血单个核细胞中DC被OPN活化,抗大肠癌活性更强。

本发明通过检测外周血液内DC的表达量来指示患者DC抗大肠癌活性的能力,能够更直观精准地提示患者DC的活性,进而更明确的说明在是否有OPN刺激时,DC细胞抗肿瘤细胞的活性的不同强度。

本发明方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。

综上所述,本发明发现骨桥蛋白可以体外诱导树突状细胞的活化,在OPN干预过程中,患者DC细胞表面活化标志物的增加表明OPN可以活化DC细胞,以达到增加抗肿瘤的作用的效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为流式细胞仪检测,健康成年人未经或经OPN活化的外周血分离的DC细胞中CD80、CD86以及大肠癌患者DC细胞上CD80、CD86的表达水平图;

图1中,HC代表健康成年人,对照组为加入BSA,活化组为添加OPN。

具体实施方式

下面结合具体实施进一步阐述本发明,应理解,以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

本发明实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。

图像处理软件:Image Pro Plus6.0。

统计学方法:采用SPSS19.0统计分析软件分析,各样本均数的比较采用Student t test分析。

全血样本来自于浙江大学第一医院肝胆外科大肠癌患者血液样本,以及浙大一院检验科的健康成年人的血液样本。CD80及CD86、BDCA1等单抗购自美国BD公司以及美国Biolegend公司,流式细胞仪为美国贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter,Inc.)的cantoII型号。离心管和离心机购自Thermo公司,淋巴细胞分离液,购自天津市TBD生物技术有限公司产品,淋巴细胞冻存液等生化试剂均购自上海盛兆生物科技有限公司及上海达科为生物技术有限公司。荧光显微镜购自Olympus。

实施例1:

在OPN(全长骨桥蛋白)的刺激下,一种通过流式细胞仪检测CD80、CD86表达量来评估DC细胞(树突状细胞)在健康成年人中OPN是否可以活化树突状细胞,包括以下步骤:

(1)从健康成年人外周血全血中分离出外周血单个核细胞PBMC;

该步骤具体包括:该步骤具体包括:

A、健康成年人血的收集:

由浙一医院国际健康保健中心提供健康体检人体的外周血全血58例。

B、健康成年人PBMC的分离:

将收集到的全血样本,置于离心机中3000rpm离心5分钟。吸出血浆后,将剩余血细胞液加入到已放入等体积PBS的15毫升离心管中充分混匀。将混匀后的液体沿离心管壁缓慢加入到已放入与PBS缓冲液(pH7.2~7.4)等体积的人淋巴细胞分离液(例如为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司生产的货号LTS1077N),注意不要与人淋巴细胞分离液混合。上述操作完成后,将离心管置入离心机2000rpm离心20分钟(备注说明:离心后会形成由上至下细胞分四层。第一层为胎牛血清液层。第二层;为环状乳白色淋巴细胞。第三层;为透明分离液层。第四层;为红细胞层),收集第二层细胞放入PBS4~5毫升的试管中,充分混匀后,以1500-2000转/分离心5分钟。沉淀经反复洗2次即得所需细胞。

(2)应用流式细胞仪检测DC细胞中CD80,CD86的表达量:

该步骤具体包括:

A、细胞膜上免疫荧光直接标记法:将收集的PBMC用改进型RPMI 1640培养液(即,含10%FBS、100IU/L青霉素、100g/L链霉素的RPMI 1640培养液)稀释成2×107/L,细胞悬液分别加入48孔板中,每孔500ul体积,每孔细胞数为1*104个/well,在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养48小时;得PBMC悬液;

①、对照组;BSA刺激48小时组;即,在1ml健康成年人PBMC悬液中加入50ul BSA稀释液(BSA浓度为5g/ml)进行刺激(为OPN刺激对照),放入细胞培养箱中于37℃、5%CO2培养48小时后收集细胞;

②、OPN(骨桥蛋白)刺激48小时组;即,在1ml健康成年人PBMC悬液中加入50ul OPN稀释液(OPN浓度为5g/ml)进行刺激,放入细胞培养箱中于37℃、5%CO2培养48小时后收集细胞。

上述BSA稀释液、OPN稀释液均采用PBS缓冲液(pH7.2~7.4)进行稀释。

B、上述温箱中孵育48h后,配成PBMC浓度为2×107/ml的细胞悬液(可采用改进型RPMI 1640培养液进行浓度的调节),取1ml的细胞悬液离心后去培养上清,将细胞打散后,用PBS(pH7.2~7.4)洗一遍,后将细胞打散,加入流式细胞仪专用的鞘液(例如为Beckman coulter公司生产的8546733型号/货号)100μl重悬,混匀于室温中静置1分钟以上,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应,做多标染色,把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入。标记有不同荧光素的抗体具体为BDCA1(PE)、CD80(V450)、CD86(FITC),用量分别为5ug、10ug、5ug。

C、流式细胞仪上观察细胞分子标记物CD80,CD86占PBMC的百分比,分析流式图,处理数据。

(3)健康成年人对照组,细胞培养后经过流式细胞仪检测后,CD80,CD86细胞占DC细胞的比例范围在(8.5±1.01)%和(12.8±1.08)%(指P<0.05,该数值有统计学意义)时,表示外周血单个核细胞中的DC细胞的CD80,CD86表达量处于正常范围;OPN刺激48小时后,CD80,CD86占外周血单个核细胞PBMC中DC细胞的比例高于(8.5±1.01)%和(12.8±1.08)%,该比例分别为(34.56±1.20)%和(30.75.±1.40)%(指P<0.05,该数值有统计学意义)时,表示外周血单个核细胞中DC细胞的活性被激活或者增强。

实施例2:

一种通过流式细胞仪检测CD80、CD86表达量来评估OPN是否能活化DC增强抗癌活性的方法:

将实施例1步骤(1)中的“健康成年人的外周血全血”改成“大肠癌患者外周血全血”,即,从从大肠癌患者外周血中(患者已通过年龄,症状,病理切片金标准,影像学诊断等指标及根据临床表现评估的TNM分期的评分明确诊断患有大肠肿瘤)全血分离出外周血单个核细胞PBMC;

其余等同于实施例1。

所得结果如下:

健康成人中DC细胞的CD80、CD86的表达量的正常范围为(8.5±1.01)%和(12.8±1.08)%,大肠癌患者的DC细胞中的CD80、CD86的表达量低于正常范围,分别为(6.95±1.22)%和(8.09±1.28)%(是指P<0.05,该数值有统计学意义)。说明大肠癌患者有免疫功能的缺陷,DC细胞上的CD80,CD86低于正常范围,存在功能缺陷;经过OPN刺激后的大肠癌患者与未经刺激的大肠癌患者相比较,CD80、CD86占外周血的DC细胞的比例高于(6.95±1.22)%和(8.09±1.28)%(是指P<0.05,该数值有统计学意义)时,分别为(19.67±1.14)%和(14.58±0,98)%,表示经过OPN刺激后大肠癌患者的DC功能得到恢复和提高,可以进一步诱发抗大肠癌的活性的激活或者增强。

该案例中据以判断的数据来源是:从2014年10月到2015年12月共收集肝胆外科患者共58例,两组群体年龄呈正态分布,实验比较,组间特异性指标后归纳总结得出大肠癌患者的CD80.CD86的表达量是低于正常范围均值的(8,5±1.01)%和(12.8±1.08)%(是指P<0.05,该数值有统计学意义),而用OPN刺激后的大肠癌患者的DC细胞上CD80、CD86的表达量是高于正常范围均值的。被视为DC细胞的抗大肠癌活性被激活,抗大肠癌活性增强。健康成年人的DC细胞上的CD80、CD86的表达量也在正常范围内。

应用实施1:

采用实施例1的操作步骤,收集浙大一院国际体检中心的健康体检者20例。经检测,健康成年人患者的外周血单个核细胞的DC细胞中CD80,CD86表达量的均值为(7.49±0.96)%和(10.27±1.28)%,其数据显著低于OPN活化后健康成年人的DC细胞中CD80、CD86的表达量的均值(34.56±1.20)%和(30.75.±1.40)%这一数据。

基于该分析结论,可以对OPN是否可以活化健康成年人的DC细胞加以判断,为后续OPN能否活化DC细胞提供量化依据。

应用实施2:

该实施例采用具体实施例2的操作步骤,收集浙江大学医学院附属第一医院肝胆外科就诊大肠癌患者(未经任何治疗后)20例全血样本以及浙大一院国际体检中心的健康体检者20例血液样本。经检测,药物治疗前的大肠癌患者的外周血单个核细胞的DC细胞中CD80、CD86表达量均值分别为分别为(6.95±1.22)%和(8.09±1.28)%,其数据低于健康成年人的DC细胞中的CD80、CD86的表达量均值的正常范围,但经过OPN刺激后,大肠癌患者的PBMC中DC细胞中CD80,CD86的表达量分别为(19.67±1.14)%和(14.58±0,98)%,比例明显高于未应用OPN刺激的大肠癌患者的血样。

被视为DC细胞的抗大肠癌活性被激活,抗大肠癌活性增强。但与健康成年人相比,大肠癌患者被OPN激活的活性不如健康成年人强,健康成年人被激活后,PBMC中DC细胞比例分别为(34.56±1.20)%和(30.75.±1.40)%(指P<0.05,该数值有统计学意义)。所以应用健康成年人被OPN激活的DC细胞抗肿瘤的效果更加明显有效。

基于上述分析结论,本发明根据健康成年人以及大肠癌患者的PBMC,检测健康成年人的DC是否可以被OPN刺激后,活化,通过流式细胞仪检测DC(BDCA1标记)细胞上的分子标记物CD80、CD86;如可以活化,则可以通过异体移植健康成年人的DC细胞到肿瘤病人血液内,以此来对抗肿瘤病人的DC细胞的免疫缺陷,来对抗肿瘤的增值和生长转移,为肿瘤的进一步治疗提供一种方法。

对比例1、将实施例1和实施例2中的全长骨桥蛋白(OPN)稀释液的用量由“50ul”改成“30ul”,其余等同,所得结果为:该用量的OPN刺激48小时后,CD80、CD86占外周血单个核细胞PBMC中DC细胞的比例仍然为(8.5±1.01)%和(12.8±1.08)%,表示外周血单个核细胞中DC细胞的没有被活化。

该用量的OPN刺激后的大肠癌患者的DC细胞上CD80、CD86的表达量是仍然为(6.95±1.22)%和(8.09±1.28)%,表示大肠癌患者外周血单个核细胞中DC细胞的没有被活化。

对比例2、将实施例1和实施例2中的全长骨桥蛋白(OPN)稀释液的用量由“50ul”改成“80ul”,其余等同,所得结果为:该用量的OPN刺激48小时后,CD80、CD86占外周血单个核细胞PBMC中DC细胞的比例分别为(34.56±1.20)%和(30.75.±1.40)%(指P<0.05,该数值有统计学意义),与“50ul”的用量下的OPN刺激浓度使DC细胞升高的比例基本相同,说明本发明是最适浓度,随着浓度的增加,DC升高比例保持不变,只会浪费蛋白试剂。

该用量的OPN刺激48小时后,大肠癌患者DC上的CD80、CD86并没有明显的升高,保持在(19.67±1.14)%和(14.58±0,98)%说明本发明的OPN刺激是最适浓度。加多蛋白的刺激只会浪费试剂。

最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。

再多了解一些
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