全长骨桥蛋白体外活化树突状细胞的方法与制造工艺

文档序号:11145047
全长骨桥蛋白体外活化树突状细胞的方法与制造工艺
本发明涉及细胞生物工程领域,具体为一种骨桥蛋白活化树突状细胞的方法。

背景技术:
全长骨桥蛋白(osteopontin,OPN)作为带负电的非胶原性骨基质糖蛋白,广泛的分布于多种组织和细胞中,其相对分子质量约为44kDa,约含300个氨基酸残基,骨桥蛋白多肽链的二级结构中包括8个α螺旋和6个β折叠结构,高度保守的RGD基元两端各有一个β折叠结构,分子中心部位是a螺旋结构。全长骨桥蛋白中包括凝血酶裂解位点:RGD序列结构中有RS位点,位于RGD序列羧基端第6位氨基酸残基所形成的肽键,是凝血酶的裂解位点,可将其裂解成45kD及24kD两个片断。其中45kD片断更能刺激细胞的黏附和迁移。OPN广泛的分布于多种组织和细胞中,能够参与组织修复,自身代谢等功能。正常情况下其表达甚微的细胞,如巨噬细胞、SMC、T淋巴细胞、成纤维细胞等在一些诱导因素下可以大量表达OPN,包括:(1)高血压,(2)高血糖,(3)低氧,(4)干扰素,(5)成纤维细胞生长因子,(6)其他因素。OPN可表达于各种组织里,不同细胞类型也能表达OPN,如骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞(SMC)、活化的T细胞、MФ和自然杀伤细胞(NK)细胞亚群;OPN也存在正常体液里,如血清、乳汁、尿液,胆汁。病理状态(免疫性疾病、炎症和肿瘤)OPN表达增强,如大肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌及各种转化细胞系亦能高水平表达OPN。外周血单个核细胞,PBMC(peripheralbloodmononuclearcell),指外周血中具有单个核的细胞,包含淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。树突状细胞(Dendriticcells,DC),因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名,是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigenpresentingcells,APC),它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原,未成熟树突状细胞具有较强的迁移能力,成熟树突状细胞能有效激活初始型T细胞,处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。树突状细胞自身具有免疫刺激能力,是目前发现的惟一能激活未致敏的初始型T细胞的APC。人体内大部分树突状细胞处于非成熟状态,表达低水平的共刺激因子和粘附因子,体外激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低,但未成熟树突状细胞具有极强的抗原吞噬能力,在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时即分化为成熟树突状细胞,而成熟的树突状细胞表达高水平的共刺激因子和粘附因子。树突状细胞在成熟的过程中,由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官,与T细胞接触并激发免疫应答。T细胞的有效活化需要两个信号的参与,即需要抗原肽-MHC复合物与TCR-CD3结合提供第1信号,以及共刺激分子介导的第2信号。最基本的共刺激信号由抗原递呈细胞表达的CD80、CD86分子与T细胞上表达的相应受体提供。树突状细胞作为目前发现的功能最强的APC,能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)生成。近年来研究表明,应用肿瘤相关抗原或抗原多肽体外冲击致敏树突状细胞,回输或免疫接种于载瘤宿主,可诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应。树突状细胞与肿瘤的发生、发展有着密切关系,大部分实体瘤内浸润的树突状细胞数量多则患者预后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答,CD8+T细胞的活化需要树突状细胞递呈抗原的过程,此过程中CD80、CD86等共刺激分子发挥了重要作用,这也是树突状细胞作为免疫治疗手段的基础。树突状细胞在成熟的过程中,由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官,与T细胞接触并激发免疫应答。树突状细胞作为目前发现的功能最强的APC,能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)生成。近年来研究表明,应用肿瘤相关抗原或抗原多肽体外冲击活化树突状细胞,回输或免疫接种于载瘤宿主,可诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应。其抗肿瘤的机制如下:①树突状细胞可以高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子,MHC分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合,形成肽-MHC分子复合物,并递呈给T细胞,从而启动MHC-I类限制性CTL反应和MHC-Ⅱ类限制性的CD4+Thl反应。同时,树突状细胞还通过其高表达的共刺激分子(CD80/、CD86/、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号,启动了免疫应答。②树突状细胞与T细胞结合可大量分泌IL-12、IL-18激活T细胞增殖,诱导CTL生成,主导Th1型免疫应答,利于肿瘤清除;激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用;③树突状细胞分泌趋化因子(ChemotacticCytokines,CCK)专一趋化初始型T细胞促进T细胞聚集,增强了T细胞的激发。保持效应T细胞在肿瘤部位长期存在,可能通过释放某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。上述CCK进一步以正反馈旁分泌的方式活化树突状细胞,上调IL-12及CD80、CD86的表达;同时树突状细胞也直接向CD8+T细胞呈递抗原肽,在活化的CD4+T细胞辅助下使CD8+T细胞活化,CD4+和CD8+T细胞还可以进一步通过分泌细胞因子或直接杀伤,增强机体抗肿瘤免疫应答。流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法。它集中了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。利用流式细胞仪可以对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观、多参数相关的检测。流式细胞仪的基本原理是采用流体动力学聚焦以保证细胞按同一方式逐一通过激光束(检测区)。当样本流中的细胞经过流动室中的检测区时,椭圆形的激光束即可检测到细胞信号。包括细胞的散射光以及细胞上标有的荧光染料发出的激光。T细胞及树突状细胞细胞是肿瘤免疫的重要效应细胞,是宿主抵抗肿瘤细胞生长的第一道防线。机体正常的免疫机制有赖于辅助性T细胞与抑制性T细胞比值的协调,故树突状细胞、T淋巴细胞及其亚群能够直接反映机体细胞免疫的状态。活化血液中树突状细胞非常重要:首先树突状细胞功能的强弱与机体免疫功能密切相关,发病初期如果树突状细胞诱导T细胞活化功能较弱,可预测患者可能预后不佳,肿瘤侵袭度高;其次,肿瘤、感染等疾病患者树突状细胞功能降低,树突状细胞功能的强弱与疾病的预后密切相关。现有技术中,尚不能有效体外活化树突状细胞,而达到增强免疫,增加抗肿瘤作用的目的。因此现急需发明一种活化树突状细胞的方法以解决活化T细胞、抗肿瘤的作用。

技术实现要素:
本发明要解决的技术问题是提供一种采用骨桥蛋白体外活化血液中树突状细胞的方法。为了解决上述技术问题...
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