含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法及应用与流程

文档序号:11095881阅读:1002来源:国知局
含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法及应用与制造工艺

本发明涉及一种医药抗体技术领域,具体地说是一种含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法及应用。



背景技术:

幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,以下简称HP)是世界上最常见的病原体之一,幽门螺杆菌具有传染性,它已被世界卫生组织(WHO)列为胃癌的第一类致癌因子。幽门螺杆菌可通过口腔侵入胃和十二指肠粘膜上皮细胞而造成消化道病变,并非所有的幽门螺杆菌菌株感染都会发展为消化道病变。临床研究结果表明,幽门螺杆菌菌株可分为两个类型,即一个是含有与细胞毒素表达相关CagA基因的毒力型幽门螺杆菌,(I型幽门螺杆菌,又称产细胞毒素幽门螺杆菌),另一个则不含CagA基因的低毒力型幽门螺杆菌(II型幽门螺杆菌,又称非产细胞毒素幽门螺杆菌)。

产细胞毒素幽门螺杆菌菌株其检出率约占总幽门螺杆菌的50-60%,这类型的HP幽门螺杆菌是幽门螺杆菌中较具毒性的菌株,在临床上会造成较严重的疾病--胃癌、胃溃疡、十二指肠溃疡及并发症(胃出血、穿孔或阻塞等)。而非产细胞毒素幽门螺杆菌感染仅造成胃部轻微不适症状。幽门螺杆菌在正常人群中的高感染率引起世界学者的广泛关注,据报道在发达国家,30岁以下人群感染率低于20%,60岁以上人群感染率高于50%,在发展中国家20岁以上人群感染率已达到80%。估计幽门螺杆菌的感染率在世界上达到数十亿人,中国幽门螺杆菌感染率已达到8亿人,而其中约占一半人数以上是感染产细胞毒素幽门螺杆菌。

目前可靠的抗幽门螺杆菌治疗主要是联合疗法,但由于联合疗法费用高,且易耐药,病人难以接受。随着被动免疫方法的广泛应用,使特异性抗幽门螺杆菌IgY防治幽门螺杆菌成为一种可行的方法。

因此,有必要利用抗体产生反应高的家禽鸡为抗体来源,免疫I型幽门螺杆菌,使鸡体内产生抗体,并产生在蛋黄内含有抗体的鸡蛋。该产品是鸡在反复摄取幽门螺杆菌抗原后,当鸡体内产生抗体时产下的蛋。鸡蛋中的蛋黄中就存在幽门螺杆菌的抗体IgY。IgY对胃黏膜上吸附幽门螺杆菌有阻止吸附的作用,这样就可以防止幽门螺杆菌对引发胃癌的可能性。



技术实现要素:

本发明要解决的技术问题是,提供一种种安全、成本低、具有高效预防和治疗幽门螺杆菌引发的胃癌、胃溃疡、十二指肠溃疡及并发症(胃出血、穿孔或阻塞等)的卵黄抗体的制备方法。

为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是,该含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法,包括以下步骤:

(1)将含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的鸡蛋清洗消毒后打破,用蛋黄分离器小心分离卵黄,保证卵黄膜未破裂;

(2)将卵黄在普通滤纸翻滚数次,尽可能将卵白吸除干净,卵黄破膜收集卵黄;

(3)用2倍卵黄体积的10mM PBS,pH7.4稀释卵黄,室温搅拌;按终浓度3.5%PEG6000沉淀稀释后的卵黄,离心条件为:速度为8000~12000rpm/min,温度为4℃,离心时间为5~20min;离心后收集上层清液,经普通滤纸过滤去除不溶物;

(4)向步骤(3)中去除不溶物后的上层清液加入终浓度为8.5%PEG6000,室温搅拌10~30min,再离心弃去上层清液得到沉淀,离心条件为:速度为8000~12000rpm/min,温度为4℃,离心时间为5~20min;

(5)将步骤(4)离心得到的沉淀用卵黄体积的PBS,pH7.4溶解,再加入终浓度为12%PEG6000沉淀卵黄抗体,室温搅拌10~30min;再离心弃上层清液得二次沉淀,其离心条件为:速度为10000rpm/min,温度为4℃,离心时间为10min;

(6)将步骤(5)离心得到的二次沉淀再用6~8ml PBS重悬溶解;在4℃条件下加入33%饱和硫酸铵,搅拌50~70min,再离心弃上层清液得到三次沉淀,其离心条件为:速度为8000~12000rpm/min,温度为4℃,离心时间为5~20min;

(7)将步骤(6)离心得到的三次沉淀再用1ml PBS重悬溶解;溶解后的沉淀对PBS透析,20小时以上,每6~8小时更换透析液一次;收集经过透析的卵黄抗体。

采用上述技术方案,抗体纯化后可制成药品,用于防治因幽门螺杆菌感染引起的相关疾病;通过多次溶解并离心提纯,该方法纯化获得的IgY纯度在98%以上,且抗体的得率在63%。该方案采用改良的PEG沉淀法获得抗体纯度更高,经PBS透析可以有效去除纯化产物中残留的聚乙二醇及硫酸铵。

本发明进一步改进在于,所述步骤(1)中的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的鸡蛋为用CagA基因阳性的毒力型幽门螺杆菌免疫所产的蛋。

本发明进一步改进在于,所述步骤(1)中的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的鸡蛋的制备方法,包括以下步骤:

1)培养CagA基因阳性的毒力型幽门螺杆菌;

2)免疫产蛋母鸡:选用40周龄健康产蛋母鸡隔离饲养,进行皮下注射,1.0x109cfu/只;每周加强一次免疫1.0x109cfu/只;三次免疫后收集鸡蛋。

本发明进一步改进在于,采用间接法ELISA测定血清及含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体滴度;具体步骤如下:

S1:超声破碎幽门螺杆菌,Bradford法定量蛋白浓度;

S2:用pH9.6碳酸缓冲溶液稀释菌体蛋白,按100ug/well包被酶标板,4℃过夜;甩掉包被液,用含有0.05%吐温20的PBS浸泡冲洗2~5次每次30~70s;

S3:用1%牛血清白蛋白封闭,温度为37℃,时间为50~70min,洗涤2~5次;加入倍比稀释血清或卵黄,37℃孵育1.5~3h,洗涤酶标板4~6次;

S4:加入1:10000稀释的酶标二抗,37℃反应30~60min后,洗涤板条4~6次;TMB显色,室温10~30min,2M硫酸终止显色反应,酶标仪读取450nm的OD值;抗体滴度判断:OD值大于阴性对照值的2.1倍为阳性,阳性值的最大稀释倍数为滴度。所制得的鸡蛋中含抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体滴度达到1:10000以上。

本发明进一步改进在于,可直接对免疫所产的鸡蛋的卵黄进行干燥制得含含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的卵黄粉,干燥方法具体包括如下步骤:将用蛋黄分离器小心分离卵黄于-20℃预冷冻1~3h,转入-80℃冻存过夜;第二天转入冻干机,主冻干0.1mbar,-56℃,至少24h;终冻干0.02mbar,-56℃,2小时;收获冻干样,研磨获得含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄粉。应用本发明将含卵黄抗体的蛋黄粉添加于食品或制备成保健食品。

本发明进一步改进在于,所制得的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体和所制得的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄粉均可应用于食品或食品添加剂或医药或保健品或功能性保健食品。

本发明有以下优点和效果:将免疫蛋制成蛋黄粉,对幽门螺旋杆菌阳性患者的治疗中证明了显著疗效,有效率达到90%以上。

附图说明

进一步结合附图描述本发明的技术方案;

图1是Yolk纯化前及不同批次纯化后IgY的还原SDS-PAGE图谱;

图2含抗幽门螺杆菌IgY的鸡蛋滴度随免疫进程的变化趋势;

图3是含抗幽门螺杆菌IgY的卵黄抗体的活性随酶切时间延长的变化趋势图。

具体实施方式

实施例1:含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的鸡蛋为用CagA基因阳性的毒力型幽门螺杆菌免疫所产的蛋;含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的鸡蛋的制备方法:

1)包括培养CagA基因阳性的毒力型幽门螺杆菌:毒力型幽门螺杆菌株37度水浴化冻后,接种于羊血琼脂平板,将平板置于37度微需氧环境培养48小时。从平板上收获幽门螺杆菌接种脑心浸液培养基进行扩菌培养。48-72小时离心收获幽门螺杆菌。

2)免疫产蛋母鸡:选用40周龄健康产蛋母鸡隔离饲养,进行皮下注射,首次注射免疫1.0x109cfu/只;每周免疫一次,注射三次免疫后收集鸡蛋。

实施例2:含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法,具体包括如下步骤:

(1)将含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的鸡蛋清洗消毒后打破,用蛋黄分离器小心分离卵黄,保证卵黄膜未破裂;

(2)将卵黄在普通滤纸翻滚数次,尽可能将卵白吸除干净,卵黄破膜收集卵黄;

(3)用2倍卵黄体积的10mM PBS,pH7.4稀释卵黄,室温搅拌;按终浓度3.5%PEG6000沉淀稀释后的卵黄,离心条件为:速度为10000rpm/min,温度为4℃,离心时间为10min;离心后收集上层清液,经普通滤纸过滤去除不溶物;

(4)向步骤(3)中去除不溶物后的上层清液加入终浓度为8.5%PEG6000,室温搅拌20min,再离心弃去上层清液得到沉淀,离心条件为:速度为速度为10000rpm/min,温度为4℃,离心时间为10min;

(5)将步骤(4)离心得到的沉淀用卵黄体积(约12ml)的PBS,pH7.4溶解,再加入终浓度为12%PEG6000沉淀卵黄抗体,室温搅拌20min;再离心弃上层清液得二次沉淀,其离心条件为:速度为10000rpm/min,温度为4℃,离心时间为10min;

(6)将步骤(5)离心得到的二次沉淀再用6~8ml PBS重悬溶解;在4℃条件下加入33%饱和硫酸铵,搅拌60min,再离心弃上层清液得到三次沉淀,其离心条件为:速度为10000rpm/min,温度为4℃,离心时间为10min;

(7)将步骤(6)离心得到的三次沉淀再用1ml PBS重悬溶解;溶解后的沉淀对PBS透析,20小时以上,每6~8小时更换透析液一次;收集经过透析的卵黄抗体。

收集经过透析的卵黄抗体,稀释20~100倍,测定280nm的吸光度计算IgY含量(抗体浓度按0.75xOD 280nm计算,单位:mg/ml);最终获得IgY经还原的SDS-PAGE鉴定纯度;该方法纯化获得的IgY纯度在98%以上,且抗体的得率在63%。

实施例3:免疫鸡蛋及卵黄抗体滴度测定:采用间接法ELISA测定血清及卵黄抗体的滴度;具体步骤包括:

S1:超声破碎幽门螺杆菌,Bradford法定量蛋白浓度;

S2:用pH9.6碳酸缓冲溶液稀释菌体蛋白,按100ug/well包被酶标板,4℃过夜;甩掉包被液,用含有0.05%吐温20的PBS浸泡冲洗3次每次60s;

S3:用1%牛血清白蛋白封闭,温度为37℃,时间为60min,洗涤2~5次;加入倍比稀释血清或卵黄,37℃孵育2h,洗涤酶标板5次;

S4:加入1:10000稀释的酶标二抗,37℃反应30~60min后,洗涤板条4~6次;TMB显色,室温15min,2M硫酸终止显色反应,酶标仪读取450nm的OD值;抗体滴度判断:OD值大于阴性对照值的2.1倍为阳性,阳性值的最大稀释倍数为滴度。

结果表明:含抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体滴度达到1:10000以上。

实施例4:可直接对免疫所产的鸡蛋的卵黄进行干燥制得含含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的卵黄粉,卵黄干燥方法具体包括如下步骤:将用蛋黄分离器小心分离卵黄于-20℃预冷冻2h,转入-80℃冻存过夜;第二天转入冻干机,主冻干0.1mbar,-56℃,至少24h;终冻干0.02mbar,-56℃,2h;收获冻干样,研磨获得含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄粉。

卵黄冻干后为鲜重的53%,此数据与报道的一致;并且试验数据显示,冻干后抗体活性不受影响。

实施例5:模拟的胃液环境(胃蛋白酶)对HP抗体活性的影响:

参考药典2010版人工胃液的配置方法:取稀盐酸16.4m l,加水约800ml与胃蛋白酶10g,摇匀后,加水稀释成1000ml,即得;临用前制备。氢氧化钠调节溶液的酸碱度,获得不同pH值的含有10g/L胃蛋白酶胃液;于不同时间点,在胃液中添加卵黄粉或纯化的抗体,37℃水浴,同时收集经酶消化过的样品,立刻稀释适当倍数经ELISA测定抗体的结合活性,计算分析:活性保留率=ODXmin/OD0min;其中DXmin代表x时间点样品测定的OD值,x代表时间点,OD0min为0点样品ELISA测定的OD值,即为对照组。

通过对比实验结果表明:免疫所产鸡蛋,制成蛋黄粉,参考药典2010版人工胃液的配置方法,胃酸ph在4.0时,卵黄粉经胃蛋白酶消化后,HP抗体的结合活性有一定损失;蛋白酶作用15分钟时抗体活性还有88.6%,30分钟82.5%,60分钟79.7%,90分钟抗体活性还有71.6%;

免疫所产鸡蛋,制备的卵黄抗体,参考药典2010版人工胃液的配置方法,胃酸ph在4.0时,卵黄粉经胃蛋白酶消化后,hp抗体的结合活性有一定损失。蛋白酶作用15分钟时抗体活性还有88.6%,30分钟78.2.%,60分钟76.6%,90分钟抗体活性还有60%。

实施例6:蛋黄粉体内治疗对比验,实验结果如表1:

免疫鸡蛋,制成蛋黄粉,进行体内治疗;将制成的卵黄粉口服明确诊断的HP阳性胃病病人16例,每个病人每次1个鸡蛋的卵黄粉,经10天服用,有效性在90%以上。

表1服用前后C13检测值及症状变化

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

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