本发明属于生物技术领域，涉及一种发酵与生物转化原位耦合制备壳寡糖的方法。
背景技术：
壳寡糖是壳聚糖经水解后产生的一类聚合度在 2-20且可溶于水的氨基糖类化合物，具有独特的生理活性和优越的功能性质，在食品、农业、医药和化工领域具有重要应用，如可以作为功能性食品添加剂和防腐剂，在农业上作为植物调节剂和生物防治剂，在医药上可以作为抗癌和免疫系统的药物等。壳寡糖可作为植物生长调节剂，能够刺激植物的免疫系统反应，增强植物对病虫害的防御能力，对烟草花叶病毒病、稻瘟病和纹枯病、核盘霉菌病原菌等植物病具有较好的防治作用，还对植物体内多种功能酶具有较好的诱导激活作用，并且可诱导植保素合成，此外壳聚糖对鳞翅目和同翅目等害虫均具有一定的杀虫活性。
壳寡糖的制备方法有酶法、氧化法和酸降解法，其中酶法制备壳寡糖具有反应条件温和、可人为控制降解速率和产物相对分子质量、不产生二次污染等优点。在酶法制备壳寡糖中，具有突出应用前景的是专一性酶（壳聚糖酶）转化法制备，其相对于非专一性酶（如纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶和果胶酶等）来说，具有催化效率高、产物聚合度适中且具有高生理生化活性等突出优点。
在以往的文献报道中，酶法生物转化生产壳寡糖首先是获得生物催化剂，然后采用酶法生物转化制备的两步工艺路线。本发明是在筛选获得一株用于番茄和葡萄根结线虫害防治的淡紫拟青霉（发明专利CN 104818216 A）的基础上，发现该菌株还高产壳聚糖酶，以此优化其培养工艺，在此基础上确立了微生物发酵与酶法生物转化原位耦合制备壳寡糖的工艺技术，该种壳寡糖制备方法相对于传统的发酵与生物转化完全分开两步法来说，具有节省设备投资、车间厂房占地面积小、转化效率高、产品质量稳定等突出优点。
技术实现要素：
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种发酵与生物转化原位耦合制备壳寡糖的方法，其特征在于发酵生产壳聚糖酶和酶法生物转化制备壳寡糖的工艺合二为一。以淡紫拟青霉YT08为出发菌株，在其培养前期以壳聚糖酶产量为主，在微生物培养后期以生物转化制备壳寡糖为目的。
所用的淡紫拟青霉菌株具有高产壳聚糖酶的特性，其保藏名称为：YT08，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年11月26日，保藏号为CGMCC No.10026，分类命名：淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）。
本发明的目的可以通过如下措施来达到：
1. 菌种活化
活化培养基：3～5 g/L蛋白胨，5～10 g/L葡萄糖，0.5～1.5 g/L壳聚糖（90%以上的脱乙酰度），0.5～1 g/L磷酸二氢钾，0.3～0.6 g/L硫酸镁, pH 7.0。500ml三角烧瓶中分装100ml活化培养基，115℃灭菌20min备用。从试管斜面保存菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28℃、200 rpm下培养30 h至菌体浑浊，制得活化种子液。
2. 发酵与生物转化原位耦合制备壳寡糖
采用优选培养基：5～15 g/L甘油，15～25 g/L大豆蛋白胨，1.5～2.5 g/L MnSO4，8～12 g/L粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度），2.5～3.5 g/L NaCl，0.5～1.5 g/L CaCl2，1.5～2.5 g/L MgSO4，0.6～1.2 g/L FeSO4。在生物发酵罐中，以70%比例装入发酵培养组分，经118℃蒸汽灭菌20min后，火焰圈保护条件下按照0.2～0.5%（v/v）的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH 5.5～6.0，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在28～32℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在5%以上。经发酵培养2 d后，往发酵罐中一次性添加灭菌的壳聚糖（90%以上的脱乙酰度），新增壳聚糖浓度为20～30 g/L，维持溶解氧在10%以上继续培养2d以实现生物转化壳聚糖底物制备壳寡糖。
3. 壳寡糖产品回收与成型
壳寡糖产品回收：发酵与生物转化原位耦合制备的壳寡糖样液，经过滤除菌体和未反应的底物壳聚糖后即可直接作为农业壳寡糖和饲料添加剂使用。
壳寡糖产品成型：经过滤除菌丝体后的壳寡糖样液，添加无水乙醇至终体积分数为 30%以沉淀蛋白，离心去沉淀后的酶解产物溶液经过截留分子量10kDa 的超滤膜过滤，收集膜透过液组分，再补加无水乙醇至终体积分数为75%，以沉淀壳寡糖产品，最后经离心收集沉淀并干燥后即为成型的壳寡糖产品。
为进一步实现本发明的目的，本发明方法中底物壳聚糖添加使用粉末壳聚糖。根据淡紫拟青霉YT08所产壳聚糖酶对壳聚糖底物形式的降解程度不同，以粉末状态催化效率较高，且方便后续产物分离，故所用的壳聚糖为粉末壳聚糖形式。
本发明中壳寡糖的制备方法与现有的制备方法相比，其有益效果在于：
（1）壳寡糖制备高效、产品质量高
采用本发明的制备方法获得的壳寡糖产品，均为高生理活性的壳寡糖产品，聚合度适中，且产品得率高。
（2）发酵与生物转化原位耦合，节省设备等投资
本发明提供发酵与生物转化原位耦合制备壳寡糖的新型工艺，相对现有的酶制剂生产和生物转化完全分开的两步工艺来说，具有节省设备投资、占地面积小、缩减人力用工成本等突出特点，适合工厂化放大生产。
附图说明
图1 为实施例1中酶解产物的薄层层析结果分析，其中标号1为氨基葡萄糖，标号2为酶解产物。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。
实施例1：在10L发酵罐中发酵与生物转化原位耦合制备壳寡糖（1）
活化培养基：3 g/L蛋白胨，5 g/L葡萄糖，0.5 g/L壳聚糖（90%脱乙酰度），磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.3, pH 7.0。500ml三角烧瓶中分装100ml活化培养基，115℃灭菌20min备用。从试管斜面保存菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28℃、200 rpm下培养30 h至菌体浑浊，制得活化种子液。
采用优选培养基：5 g/L甘油，15 g/L大豆蛋白胨，1.5 g/L MnSO4，8 g/L粉末壳聚糖（90%脱乙酰度），2.5 g/L NaCl，0.5 g/L CaCl2，1.5 g/L MgSO4，0.6 g/L FeSO4。在10L生物发酵罐中，以70%比例装入发酵培养组分，经118℃蒸汽灭菌20min后，火焰圈保护条件下按照0.2%（v/v）的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH 5.5，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在28℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在5%以上。经发酵培养2 d后，往发酵罐中一次性添加灭菌的壳聚糖（90%的脱乙酰度），新增壳聚糖浓度为20 g/L，维持溶解氧在10%以上继续培养2d以实现生物转化壳聚糖底物制备壳寡糖。
酶解产物的薄层层析分析见附图1，可以看出所得壳寡糖产品均为聚合度为2以上且8以下的高生理活性的壳寡糖。
经过滤除菌丝体后的壳寡糖样液，添加无水乙醇至终体积分数为 30%以沉淀蛋白，离心去沉淀后的酶解产物溶液经过截留分子量10kDa 的超滤膜过滤，收集膜透过液组分，再补加无水乙醇至终体积分数为75%，以沉淀壳寡糖产品，最后经离心收集沉淀并干燥后即为成型的壳寡糖产品128.18 g，壳寡糖实际产品得率为61.4%。
实施例2：在10L发酵罐中发酵与生物转化原位耦合制备壳寡糖（2）
活化培养基：5 g/L蛋白胨，10 g/L葡萄糖，1.5 g/L壳聚糖（90%脱乙酰度），1 g/L磷酸二氢钾，0.6 g/L硫酸镁, pH 7.0。500ml三角烧瓶中分装100ml活化培养基，115℃灭菌20min备用。从试管斜面保存菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28℃、200 rpm下培养30 h至菌体浑浊，制得活化种子液。
采用优选培养基：15 g/L甘油，25 g/L大豆蛋白胨，2.5 g/L MnSO4，12 g/L粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度），3.5 g/L NaCl，1.5 g/L CaCl2，2.5 g/L MgSO4，1.2 g/L FeSO4。在生物发酵罐中，以70%比例装入发酵培养组分，经118℃蒸汽灭菌20min后，火焰圈保护条件下按照0.5%（v/v）的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH 6.0，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在32℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在5%以上。经发酵培养2 d后，往发酵罐中一次性添加灭菌的壳聚糖（90%脱乙酰度），新增壳聚糖浓度为30 g/L，维持溶解氧在10%以上继续培养2d以实现生物转化壳聚糖底物制备壳寡糖。
经过滤除菌丝体后的壳寡糖样液，添加无水乙醇至终体积分数为 30%以沉淀蛋白，离心去沉淀后的酶解产物溶液经过截留分子量10kDa 的超滤膜过滤，收集膜透过液组分，再补加无水乙醇至终体积分数为75%，以沉淀壳寡糖产品，最后经离心收集沉淀并干燥后即为成型的壳寡糖产品180.49 g，壳寡糖实际产品得率为65.39%。
实施例3：在50L发酵罐中发酵与生物转化原位耦合制备壳寡糖
活化培养基：4 g/L蛋白胨，8 g/L葡萄糖，1.5 g/L壳聚糖（90%脱乙酰度），0.6 g/L磷酸二氢钾，0.5 g/L硫酸镁, pH 7.0。500ml三角烧瓶中分装100ml活化培养基，115℃灭菌20min备用。从试管斜面保存菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28℃、200 rpm下培养30 h至菌体浑浊，制得活化种子液。
采用优选培养基：12 g/L甘油，25 g/L大豆蛋白胨，1.5 g/L MnSO4，12 g/L粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度），3 g/L NaCl，1 g/L CaCl2，2 g/L MgSO4，1 g/L FeSO4。在生物发酵罐中，以70%比例装入发酵培养组分，经118℃蒸汽灭菌20min后，火焰圈保护条件下按照0.5%（v/v）的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH 6.0，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在32℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在5%以上。经发酵培养2 d后，往发酵罐中一次性添加灭菌的壳聚糖（90%脱乙酰度），新增壳聚糖浓度为25 g/L，维持溶解氧在10%以上继续培养2d以实现生物转化壳聚糖底物制备壳寡糖。
经过滤除菌丝体后的壳寡糖样液，添加无水乙醇至终体积分数为 30%以沉淀蛋白，离心去沉淀后的酶解产物溶液经过截留分子量10kDa 的超滤膜过滤，收集膜透过液组分，再补加无水乙醇至终体积分数为75%，以沉淀壳寡糖产品，最后经离心收集沉淀并干燥后即为成型的壳寡糖产品172.8 g，壳寡糖实际产品得率为67.72%。
实施例4：在300L发酵罐中发酵与生物转化原位耦合制备壳寡糖
活化培养基：3 g/L蛋白胨，7 g/L葡萄糖，1 g/L壳聚糖（90%脱乙酰度），0.6 g/L磷酸二氢钾，0.4 g/L硫酸镁, pH 7.0。500ml三角烧瓶中分装100ml活化培养基，115℃灭菌20min备用。从试管斜面保存菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28℃、200 rpm下培养30 h至菌体浑浊，制得活化种子液。
采用优选培养基：10 g/L甘油，20 g/L大豆蛋白胨，1.5 g/L MnSO4，10 g/L粉末壳聚糖（95%脱乙酰度），2.5 g/L NaCl，1 g/L CaCl2，2 g/L MgSO4，0.6 g/L FeSO4。在生物发酵罐中，以70%比例装入发酵培养组分，经118℃蒸汽灭菌20min后，火焰圈保护条件下按照0.5%（v/v）的比例接入活化的菌种，通过调节酸碱蠕动泵控制发酵过程中的pH始终维持在pH 6.0，利用发酵罐的加热装置调节培养温度在30℃，溶解氧参数通过调节进罐的无菌空气量和搅拌转速的大小使其始终维持在5%以上。经发酵培养2 d后，往发酵罐中一次性添加灭菌的壳聚糖（95%脱乙酰度），新增壳聚糖浓度为30 g/L，维持溶解氧在10%以上继续培养2d以实现生物转化壳聚糖底物制备壳寡糖。
经过滤除菌丝体后的壳寡糖样液，添加无水乙醇至终体积分数为 30%以沉淀蛋白，离心去沉淀后的酶解产物溶液经过截留分子量10kDa 的超滤膜过滤，收集膜透过液组分，再补加无水乙醇至终体积分数为75%，以沉淀壳寡糖产品，最后经离心收集沉淀并干燥后即为成型的壳寡糖产品188.02 g，壳寡糖实际产品得率为66.15%。