本发明涉及生化技术领域，具体地说是水解海带干粉得到海带抗氧化肽粗提液,再经过离子层析柱初步分离纯化，得到一种海带抗氧化肽产品的方法。
背景技术：
海带是一种营养价值很高的蔬菜，同时具有一定的药用价值。含有丰富的碘等矿物质元素。海带含热量低、蛋白质含量中等、矿物质丰富，研究发现，海带具有降血脂、降血糖、调节免疫、抗凝血、抗肿瘤、排铅解毒和抗氧化等多种生物功能。研究表明其中的抗氧化功能就与其中所含的抗氧化肽有直接关系，因为抗氧化肽为胞内多肽，所以细胞破碎技术是直接影响抗氧化肽提取得率的关键因素之一。抗氧化肽的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等。本方案通过缓冲液法对海带中细胞进行破碎提取抗氧化肽，确定了各条件下抗氧化肽提取的最佳条件。在抗氧化肽的分离时，主要是把抗氧化肽与提取液中其他物质分离。可利用蛋白质的盐析和调节PH使蛋白变性等，使蛋白质从提取液中分离出来；最后，再把抗氧化肽从杂蛋白中分离出来，常用的方法有柱分离法等。
本发明的技术方案采用通过缓冲液提取法从海带干粉得到海带抗氧化肽粗提液,再经过离子层析柱初步分离纯化，得到一种海带抗氧化肽产品的方法。该法简单，可操作性强，成本较低，适合大规模化生产。
技术实现要素：
本发明的目的是生产一种海带抗氧化肽产品。
通过缓冲液提取法从海带干粉得到海带抗氧化肽粗提液再经过离子层析柱初步分离纯化，得到一种海带抗氧化肽产品的方法。本发明具有工艺简单，操作安全，成本较低的特点，非常适用于规模化大生产。包括如下步骤：
（1）溶解离心：取海带干粉，按其重量1:5-1:90（w/v）的比例量取PBS缓冲液。先用PBS缓冲液将海带干粉溶解，搅拌2-8h，10000r/min离心5-60min，取上清液。将沉淀溶于2-10倍（w/v）蒸馏水后继续搅拌2-8h后再次10000r/min离心5-60min，取上清液。再将沉淀溶解于2-10倍（w/v）蒸馏水进行第三次搅拌，离心后取上清液，作为上柱液。
（2）柱平衡：用pH 3.0-7.5平衡缓冲液平衡柱体，用恒流泵控制流速为100-700ml/min，平衡时间1-5小时。
（3）上样：将上柱液加入层析柱，恒流泵控制流速为100-700ml/min。上样结束后，用平衡缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为200-800ml/min。
（4） 洗涤：用pH 2.0-9.0洗涤缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为200-800ml/min。
（5）洗脱：洗涤结束后，用pH2.5±10.0洗脱液洗脱层析柱，恒流泵控制流速为300-900ml/min。洗脱的同时，使用核酸蛋白检测仪粗略测量流出液100-640nmOD值，当OD值接近0.05-0.95时改用紫外分光光度计精密测量OD值，当流出液OD值在0.2-0.7以上，开始收集流出液，直到OD值在0.2-0.7以下，停止收集流出液。
（6）柱再生：洗脱结束后，用含0.1-1mol /L氢氧化钠溶液的再生液洗涤层析柱，之后再用纯化水洗涤层析柱，流速均用恒流泵控制在100-1000ml/min。
（7）沉淀：计量收集流出液体积，转入不锈钢桶内，边搅边加入流出液体积2-8倍量(v/v)的冷乙醇，乙醇温度不超过-5℃，静置沉淀12-36小时，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不锈钢桶底部。
（8）离心、脱水：用软管自然虹吸上层乙醇，下层沉淀物装入离心杯用低速大容量冷冻离心机离心，使固液分离，设定离心转速不低于2500-5000rpm。离心结束后，弃去上层母液，收集下层固体，按固体物重量1:2-1:9（w/v）比例于离心杯内加入无水乙醇脱水1-4次，再按上述步骤离心，收集固体物干燥。
（9）真空干燥：将上述盛有离心固体物的离心杯放置于真空干燥箱，干燥10-35小时以上，干燥后即得产品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
（1）溶解离心：取海带干粉，按其重量1:8（w/v）的比例量取PBS缓冲液。先用PBS缓冲液将海带干粉溶解，溶解离心：取海带干粉，按其重量1:5（w/v）的比例量取PBS缓冲液。先用PBS缓冲液将海带干粉溶解，搅拌2h，10000r/min离心10min，取上清液。将沉淀溶于2倍（w/v）蒸馏水后继续搅拌2h后再次10000r/min离心10min，取上清液。再将沉淀溶解于2倍（w/v）蒸馏水进行第三次搅拌，离心后取上清液，作为上柱液。
（2）柱平衡：用pH 3.0平衡缓冲液平衡柱体，用恒流泵控制流速为100ml/min，平衡时间1.5小时。
（3）上样：将上柱液加入层析柱，恒流泵控制流速为150ml/min。上样结束后，用平衡缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为200ml/min。
（4） 洗涤：用pH 2.0洗涤缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为200ml/min。
（5）洗脱：洗涤结束后，用pH 2.5洗脱液洗脱层析柱，恒流泵控制流速为300ml/min。洗脱的同时，使用核酸蛋白检测仪粗略测量流出液100nmOD值，当OD值接近0.05时改用紫外分光光度计精密测量OD值，当流出液OD值在0.2以上，开始收集流出液，直到OD值在0.2以下，停止收集流出液。
（6）柱再生：洗脱结束后，用含0.1mol /L氢氧化钠溶液的再生液洗涤层析柱，之后再用纯化水洗涤层析柱，流速均用恒流泵控制在100ml/min。
（7）沉淀：计量收集流出液体积，转入不锈钢桶内，边搅边加入流出液体积2倍量(v/v)的冷乙醇，静置沉淀12小时，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不锈钢桶底部。
（8）离心、脱水：用软管自然虹吸上层乙醇，下层沉淀物装入离心杯用低速大容量冷冻离心机离心，使固液分离，设定离心转速不低于2500rpm。离心结束后，弃去上层母液，收集下层固体，按固体物重量1:2（w/v）比例于离心杯内加入无水乙醇脱水1次，再按上述步骤离心，收集固体物干燥。
（9）真空干燥：将上述盛有离心固体物的离心杯放置于真空干燥箱，干燥15小时以上，干燥后即得产品。
实施例2
（1）溶解离心：取海带干粉，按其重量1:50（w/v）的比例量取PBS缓冲液。先用PBS缓冲液将海带干粉溶解，溶解离心：取海带干粉，按其重量1:40（w/v）的比例量取PBS缓冲液。先用PBS缓冲液将海带干粉溶解，搅拌4h，10000r/min离心30min，取上清液。将沉淀溶于5倍（w/v）蒸馏水后继续搅拌4h后再次10000r/min离心30min，取上清液。再将沉淀溶解于5倍（w/v）蒸馏水进行第三次搅拌，离心后取上清液，作为上柱液。
（2）柱平衡：用pH 4.0平衡缓冲液平衡柱体，用恒流泵控制流速为400 ml/min，平衡时间2.5小时。
（3）上样：将上柱液加入层析柱，恒流泵控制流速为400ml/min。上样结束后，用平衡缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为500ml/min。
（4） 洗涤：用pH 5.0洗涤缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为500ml/min。
（5）洗脱：洗涤结束后，用pH 6.0洗脱液洗脱层析柱，恒流泵控制流速为600ml/min。洗脱的同时，使用核酸蛋白检测仪粗略测量流出液350nmOD值，当OD值接近0.65时改用紫外分光光度计精密测量OD值，当流出液OD值在0.5以上，开始收集流出液，直到OD值在0.5以下，停止收集流出液。
（6）柱再生：洗脱结束后，用含0.5mol /L氢氧化钠溶液的再生液洗涤层析柱，之后再用纯化水洗涤层析柱，流速均用恒流泵控制在500ml/min。
（7）沉淀：计量收集流出液体积，转入不锈钢桶内，边搅边加入流出液体积5倍量(v/v)的冷乙醇，静置沉淀24小时，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不锈钢桶底部。
（8）离心、脱水：用软管自然虹吸上层乙醇，下层沉淀物装入离心杯用低速大容量冷冻离心机离心，使固液分离，设定离心转速不低于3500rpm。离心结束后，弃去上层母液，收集下层固体，按固体物重量1:6（w/v）比例于离心杯内加入无水乙醇脱水2次，再按上述步骤离心，收集固体物干燥。
（9）真空干燥：将上述盛有离心固体物的离心杯放置于真空干燥箱，干燥20小时以上，干燥后即得产品。
实施例3
（1）溶解离心：取海带干粉，按其重量1:80（w/v）的比例量取PBS缓冲液。先用PBS缓冲液将海带干粉溶解，溶解离心：取海带干粉，按其重量1:90（w/v）的比例量取PBS缓冲液。先用PBS缓冲液将海带干粉溶解，搅拌8h，10000r/min离心60min，取上清液。将沉淀溶于10倍（w/v）蒸馏水后继续搅拌8h后再次10000r/min离心60min，取上清液。再将沉淀溶解于10倍（w/v）蒸馏水进行第三次搅拌，离心后取上清液，作为上柱液。
（2）柱平衡：用pH 7.5平衡缓冲液平衡柱体，用恒流泵控制流速为700ml/min，平衡时间5小时。
（3）上样：将上柱液加入层析柱，恒流泵控制流速为700ml/min。上样结束后，用平衡缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为800ml/min。
（4） 洗涤：用pH 9.0洗涤缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为800ml/min。
（5）洗脱：洗涤结束后，用pH 10.0洗脱液洗脱层析柱，恒流泵控制流速为900ml/min。洗脱的同时，使用核酸蛋白检测仪粗略测量流出液640nmOD值，当OD值接近0.95时改用紫外分光光度计精密测量OD值，当流出液OD值在0.7以上，开始收集流出液，直到OD值在0.7以下，停止收集流出液。
（6）柱再生：洗脱结束后，用含1mol /L氢氧化钠溶液的再生液洗涤层析柱，之后再用纯化水洗涤层析柱，流速均用恒流泵控制在1000ml/min。
（7）沉淀：计量收集流出液体积，转入不锈钢桶内，边搅边加入流出液体积8倍量(v/v)的冷乙醇，乙醇温度不超过-5℃，静置沉淀36小时，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不锈钢桶底部。
（8）离心、脱水：用软管自然虹吸上层乙醇，下层沉淀物装入离心杯用低速大容量冷冻离心机离心，使固液分离，设定离心转速不低于5000rpm。离心结束后，弃去上层母液，收集下层固体，按固体物重量1:9（w/v）比例于离心杯内加入无水乙醇脱水4次，再按上述步骤离心，收集固体物干燥。
（9）真空干燥：将上述盛有离心固体物的离心杯放置于真空干燥箱，干燥35小时以上，干燥后即得产品。