本发明涉及植物提取技术领域，尤其是涉及一种从柑橘中提取川陈皮素、橘皮素的方法。
背景技术：
柑橘(Citrus reticulata Blanco)，芸香科下属植物，柑橘类果皮具有很高的药用价值，橘皮中还含有硫胺素、核黄素、挥发油、黄酮类。橘皮中的挥发油对消化道有刺激作用。可以增加胃液分泌，促进胃肠蠕动，健胃祛风。黄酮有扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量的作用。此外，橘皮还有消炎、抗溃疡、抑菌及利胆等效果。橘皮中的维生素P，对血管硬化症有显著疗效。
其中，川陈皮素和橘皮素是柑橘类多甲氧基黄酮类(PMFs)主要部分，尽管在柑橘类植物含量低，但其具有比一般类柑橘黄酮更强的生理活性。具文献报道，川陈皮素和橘皮素具有消炎、抗肿瘤、降低胆固醇和抗氧化等功能。如川陈皮素有拮抗哮喘炎症，抗肝炎C型病毒等；体外实验表明川陈皮素对Hela细胞、THP-1细胞、Colon26细胞、S180细胞具有较好的抑制作用。桔皮素具有抗真菌作用，体外可抑制肿瘤细胞增殖，可抑制嗜碱性细胞组胺释放。对于平滑肌的收缩亦有抑制作用。其特有的生物活性使川陈皮素和橘皮素具有很高的药用价值和广阔的市场前景。
橙皮苷是柑橘类黄酮中的主要成分之一，橙皮苷具有维持渗透压，增强毛细血管韧性，防止毛细血管破裂出血的作用。橙皮苷可以降低胆固醇，在临床上用于心血管系统疾病的辅助治疗，是多种防止动脉硬化和心肌梗塞的药物的主要原料之一。橙皮苷还具有抗炎症和镇痛的功效；临床研究表明橙皮苷可以减轻妇女绝经期。
目前，关于橙皮苷、川陈皮素和橘皮素联合提取的专利，多集中用有机溶剂提取，然后有机溶剂多次萃取，萃取后再用有机溶剂重结晶等，如专利申请CN104230871A，通过分步提取分离多甲基黄酮和橙皮苷，提取时间过长，又经过多次吸附和洗脱，其步骤复杂，不利于工业化。如专利申请CN102875509A，只提取柑橘果皮中川陈皮素，原料未充分利用，降低原料价值。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供从柑橘中提取川陈皮素、橘皮素的方法，所述的方法解决了现有技术提取成分单一，洗脱次数多导致提取效率低的问题。
为了达到以上目的，本发明提供了以下技术方案：
一种从柑橘中提取川陈皮素、橘皮素的方法，包括下列步骤：
步骤A：以第一有机溶剂与水的混合液为提取剂，控制溶液pH为8-9的条件下对提取原料回流提取一次或多次，合并提取液、浓缩，得到柑橘黄酮浓缩液；
步骤B：用第二有机溶剂萃取所述柑橘黄酮浓缩液，分离出有机相和水相；
步骤C：去除所述有机相中的萃取剂，再依次采用第一洗脱液和第二洗脱液在大孔吸附树脂中进行洗脱，并分别收集川陈皮素、橘皮素；
其中，所述第一有机溶剂选自极性有机溶剂，优选醇、酮、醚、酯、酸；优选醇，优选甲醇/乙醇；
所述第二有机溶剂优选酮、醚、酯、烷烃、石油醚，优选酯、烷烃、石油醚中的一种；
所述第一洗脱液和第二洗脱液分别独立地选自强极性有机溶剂和弱极性有机溶剂的混合液；所述强极性有机溶剂优选选自酸/酯，所述弱极性有机溶剂优选选自烷烃/石油醚。
本发明的上述方法通过碱性条件下的回流提取、萃取、洗脱三步至少实现了多个成分(陈皮素、橘皮素)、减少洗脱次数两个效果。
具体地，本发明首先采用极性有机溶剂和水的混合液对原料(柑橘的果皮、果肉或者整颗果实)回流提取，并加入碱，从而快速、高利用率地使原料中柑橘黄酮类物质溶出。这一步与传统工艺中的回流提取相比，提取效率和溶出度达到提高。之后再采用萃取的方法将水溶性杂质与目标物分离开，这不仅减轻了后续洗脱的工作量和难度，而且还可以结合其他工艺回收利用水溶性的成分。第三步，本发明通过调整洗脱液的组成以及配比分别分离出上述有机相中的陈皮素、橘皮素。
综上，与现有工艺相比，本发明首先提取的成分种类多，至少包含陈皮素、橘皮素，提高了生产效益；其次本发明缩短了提取时间，提高了生产效率，更利于工业化。
此外，本发明在回流提取之前还需对原料进行常规预处理，例如干燥、磨粉等。
本发明所述的控制溶液pH是针对回流提取的整体溶液。
上述方法还可以进一步改进：
优选地，所述步骤A的回流提取次数以及浓缩的程度根据成本与效益的权衡选择，另外，浓缩还应当考虑黄酮类物质的稳定性。优选的浓缩温度为70-80℃。
优选地，所述第一有机溶剂优选考虑与黄酮类物质化学结构相似的溶剂，但同时应当兼顾安全性、成本、回流难度等因素。其中最佳选择为醇，主要指C1-5的低级醇，例如甲醇、乙醇、正丁醇。
优选地，在选用所述第一洗脱液和第二洗脱液时，应当选用极性相差大的两种或两种以上的溶剂组成。
优选地，所述步骤A中控制溶液pH的方法为：加入水溶性的无机碱调节，所述无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等中的一种或多种。
加入碱的主要目的是增加黄酮类物质的溶出速度和溶出率，因此在选择碱时应当考虑性质稳定、溶解度大、不破坏目标物结构等方面。另外，碱以溶液形式加入。实际操作中，pH并不需要满足预设的绝对值，允许存在常规的误差或波动。
优选地，所述步骤A中回流提取的pH为8。
优选地，所述回流提取的温度为60-80℃，优选70-80℃。
控制温度能够防止黄酮类物质氧化或者降低活性。
优选地，所述步骤A中的提取剂，第一有机溶剂与水的体积比为50-80:30-50；每次回流提取的时间优选为1-2小时，优选回流提取3次。
优选地，所述步骤A中，提取剂与提取原料的重量比为3-6:1。
优选地，所述步骤B中，第二有机溶剂与所述柑橘黄酮浓缩液的体积比为3-5L：1kg，每次萃取的时间优选为0.5-1.5h，优选1-1.5h；优选萃取2-3次。
优选地，所述步骤B的萃取剂为低极性有机溶剂。
优选地，去除所述有机相中的萃取剂时，采用真空旋转蒸发回收法，环保且效率高。
优选地，所述步骤C中，第一洗脱液为酯：烷烃/石油醚＝1：1-2(v/v)，优选乙酸乙酯：正己烷＝1：1-2(v/v)，更优选乙酸乙酯：正己烷＝1：1(v/v)；
优选地，第二洗脱液为酯：烷烃/石油醚＝1：1-2(v/v)，优选乙酸乙酯：正己烷＝1：1-2(v/v)，更优选乙酸乙酯：正己烷＝1：2(v/v)。
在洗脱时，针对川陈皮素、橘皮素的极性差异，选用的洗脱液有所区分，以加强分离效果。
洗脱时的树脂选择非极性或弱极性大孔树脂为中压层析柱填充料，例如选自AB-8、D-101、DM301、HPD-100、AS-5、AS-8中的一种。
优选地，所述步骤C中洗脱的流速为30-50mL/min，柱压1-3MPa。
本发明洗脱后所得的川陈皮素、橘皮素为溶液态，如果要得到纯品，还需经过常规的浓缩、干燥、精提等过程，常用的精提方法为重结晶。针对川陈皮素、橘皮素，优选的重结晶溶剂为含量大于80％乙醇水溶液或无水乙醇。
本发明还有很重要的一个改进点是回收利用步骤B水相中的橙皮苷，具体如下：
调节所述水相的pH＝11-13，过滤去杂质，滤液调pH＝5-6，静置，收集沉淀、干燥。
所述静置的时间视情况而定。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)提高了生产效率：体现在回流提取速率快、洗脱次数少、工艺流程简化等方面。
(2)降低了成本，提高了生产效益：体现在设备简单、工艺流程简化、提取成分种类多、提取率高等方面。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下文实施例1至5所用的树脂为大孔吸附树脂AB-8。
实施例1
原料橘皮产自四川金堂县，将橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎过30目筛。
取200g橘皮粉末，加1200mL 70％乙醇水溶液，然后用5％NaoH溶液调pH＝8；在80℃下回流提取2小时，过滤收集滤液；滤料再次用1000mL pH＝8的70％乙醇水溶液在80℃下回流提取2次，每次1小时。合并三次滤液共3000mL。用旋转蒸发仪回收乙醇得450mL柑橘黄酮浓缩液。
将柑橘黄酮浓缩液按1:3加入乙酸乙酯萃取3次，每次一小时，分离水相和有机相；有机相回收乙酸乙酯后得多甲氧基黄酮浓缩液约30mL。用恒流泵将乙酸乙酯泵入中压层析柱至溶剂流出，将多甲氧基黄酮浓缩液泵入中压层析柱，然后泵入正己烷，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含川陈皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱压1-3MPa；两种流份分别浓缩，干燥，用无水乙醇重结晶，获得川陈皮素和橘皮素。
将萃取后水相减压回收至无乙酸乙酯味，加NaoH溶液调pH＝11，过滤去杂质，滤液调pH＝6收集沉淀，重结晶，得橙皮苷。
实施例2
原料橘皮产自四川金堂县，将橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎过30目筛。
取200g橘皮粉末加5g生石灰混匀，然后加1200mL 50％乙醇水溶液，在80℃下回流提取2小时，过滤收集滤液；滤料再次用1000mL 50％乙醇水溶液在80℃下回流提取2次，每次1小时。合并三次滤液共2900mL。用旋转蒸发仪回收乙醇得400mL柑橘黄酮浓缩液。
将柑橘黄酮浓缩液按1:3加入乙酸乙酯萃取3次，每次一小时，分离水相和有机相；有机相回收乙酸乙酯后得多甲氧基黄酮浓缩液约30mL。用恒流泵将乙酸乙酯泵入中压层析柱至溶剂流出，将多甲氧基黄酮浓缩液泵入中压层析柱，然后泵入正己烷，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含川陈皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱压1-3MPa；两种流份分别浓缩，干燥，用无水乙醇重结晶，获得川陈皮素和橘皮素。
将萃取后水相减压回收至无乙酸乙酯味，加NaoH溶液调pH＝11，过滤去杂质，滤液调pH＝5收集沉淀，重结晶，得橙皮苷。
实施例3
原料橘皮产自四川金堂县，将橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎过30目筛。
取200g橘皮粉末加1g氢氧化钾，然后加1200mL 80％甲醇水溶液，在75℃下回流提取2小时，过滤收集滤液；滤料再次加1g氢氧化钾，用1000mL80％甲醇水溶液在75℃下回流提取2次，每次1小时。合并滤液共2900mL。用旋转蒸发仪回收乙醇得400mL柑橘黄酮浓缩液。
将柑橘黄酮浓缩液按1:3加入正己烷萃取3次，每次一小时，分离水相和有机相；有机相回收正己烷后得多甲氧基黄酮浓缩液约30mL。用恒流泵将正己烷泵入中压层析柱至溶剂流出，将多甲氧基黄酮浓缩液泵入中压层析柱，然后泵入乙酸乙酯，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含川陈皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱压1-3MPa；两种流份分别浓缩，干燥，用95％乙醇重结晶，获得川陈皮素和橘皮素。
将萃取后水相减压回收至无乙酸乙酯味，加NaOH溶液调pH＝13，过滤去杂质，滤液调pH＝6收集沉淀，重结晶，得橙皮苷。
实施例4
原料橘皮产自四川金堂县，将橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎过30目筛。
取1kg橘皮粉末加5L 70％乙醇水溶液，用NaoH溶液调pH＝8，在80℃下回流提取2小时，过滤收集滤液；滤料再次用4L pH＝8的70％乙醇水溶液在80℃下回流提取2次，每次1小时。合并三次滤液共12L。用旋转蒸发仪回收乙醇得约1.5L柑橘黄酮浓缩液。
将柑橘黄酮浓缩液按1:3加入正己烷萃取3次，每次一小时，分离水相和有机相；有机相回收正己烷后得多甲氧基黄酮浓缩液约200mL。用恒流泵将正己烷泵入中压层析柱至溶剂流出，将多甲氧基黄酮浓缩液泵入中压层析柱，然后泵入乙酸乙酯，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含川陈皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱压1-3MPa；两种流份分别浓缩，干燥，用90％乙醇重结晶，获得含量大于90％川陈皮素2.4g和含量大于85％橘皮素1.7g。
将萃取后水相减压回收至无乙酸乙酯味，加NaoH溶液调pH＝12，过滤去杂质，滤液调pH＝6收集沉淀，重结晶，得含量95％橙皮苷31.3g。
实施例5
原料橘皮产自四川金堂县，将橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎过30目筛。
取5kg橘皮粉末加5g氢氧化钠，然后加30L 75％乙醇水溶液，在70℃下回流提取2小时，过滤收集滤液；滤料再次加5g氢氧化钠，用25L 75％乙醇水溶液在70℃下回流提取2次，每次1小时。合并三次滤液共73L。回收乙醇得8L柑橘黄酮浓缩液。
将柑橘黄酮浓缩液按1:2加入乙酸乙酯萃取3次，每次一小时，分离水相和有机相；有机相回收乙酸乙酯后得多甲氧基黄酮浓缩液约1000mL。用恒流泵将乙酸乙酯泵入中压层析柱至溶剂流出，将多甲氧基黄酮浓缩液分次泵入中压层析柱，然后泵入乙酸乙酯，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含川陈皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例为洗脱液，洗脱3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱压1-3MPa；两种流份分别浓缩，干燥，用95％乙醇重结晶，获得含量大于90％川陈皮素13.3g和含量大于85％橘皮素9.2g。
将萃取后水相减压回收至无乙酸乙酯味，加NaoH溶液调pH＝11，过滤去杂质，滤液调pH＝6收集沉淀，重结晶，得95％橙皮苷169g。
实施例6-9
与实施例1的区别在于回流提取所用的溶剂不同，分别为：甲醇/水＝50:50(v/v)，甲醇/水＝85:15(v/v)，甲醇/水＝30:70(v/v)，乙醇/水＝30:70(v/v)。
实施例10
与实施例1的区别在于回流提取时加入的碱量不同，需加至溶液的pH约为9。
实施例11-13
与实施例1的区别在于萃取时所用的溶剂不同，分别为：乙酸甲酯，环己烷，乙酸乙酯与环己烷混合物。
实施例14
与实施例1的区别在于洗脱所用的洗脱液不同，收集川陈皮素的洗脱液为乙酸乙酯：石油醚＝1:1(V/V)，收集橘皮素的洗脱液为乙酸乙酯：石油醚＝1:2(V/V)。
实施例15-19
与实施例1的区别在于所用的吸附树脂不同，分别为大孔吸附树脂D-101、DM301、HPD-100、AS-5、AS-8。
对比以上所有实施例的提取效果，结果如表1。
表1
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。