一种从环境样品中提取纯化和检测副猪嗜血杆菌的方法与流程

本发明涉及一种从环境样品中提取纯化和检测副猪嗜血杆菌的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

随着科技的进步，pcr技术逐渐被应用到环境微生物中特定细菌的检测中，如土壤、未经处理的生活废弃物、医院废弃物、工厂废弃物、垃圾和人畜粪便以及大气中的漂浮物和气溶胶等环境中的微生物检测。

随着规模化、集约化养殖场数量的增加，畜禽的粪便和污水排放量剧增，环境污染问题越来越突出，一些致病性微生物如猪副猪嗜血杆菌混迹其间，对人畜健康造成极大的危害，也给养殖业的健康发展带来无法估量的经济损失。因此，需要对养殖场环境病原微生物进行实时监测，以防止动物疫病的爆发与蔓延。

迄今，对病原菌的检测和鉴定大多采用传统的方法，即对病料进行病原培养分离，配合血清型鉴定来诊断畜禽疾病。该方法虽然比较准确，但耗时费力，鉴定时间长(一般需要2～4天)，易受细菌生理条件和抗生素使用限制，常导致培养假阴性，很难满足临床要求。

pcr技术以其敏感性强，特异性好，检测时间短等特点被广泛应用于许多病原菌的快速鉴定。但对于环境中的病原菌而言，环境中存在大量干扰物质影响pcr检测，如腐殖质等。所以传统的解决办法就是采用去除腐殖质试剂对样品进行洗涤，去除腐殖质，然后用裂解试剂裂解环境中的细菌，析出dna复合物，用蛋白酶去除dnp中的蛋白质，析出dna，再经纯化，洗涤作为dna检测的样品试剂。此类方法存在繁琐的dna的提取纯化过程，且常常会导致提取失败。目前市场上有针对具体病原菌dna提取的试剂盒，但步骤繁多，且价格昂贵，难以推广进行日常使用。

菌落pcr因为不用提取细菌dna而直接进行检测而广受追捧，但如何提取纯化能直接用于pcr检测的环境样品中的病原菌，仍然是一个很难解决的问题。

因此，在生产实践中，亟需快速检测鉴定技术来帮助广大基层兽医工作者来快速诊断检测，为尽早防治病原菌的侵袭提供宝贵的时间。

技术实现要素：

本发明提供了一种检测环境样品中副猪嗜血杆菌的方法，它包括如下步骤：

(1)从环境样品中提取纯化总细菌，重悬菌液备用；

(2)将重悬菌液直接上机进行菌落pcr扩增副猪嗜血杆菌的任一段特定的dna序列，用于扩增的上游引物序列如seqno.1所示，下游引物序列如seqno.2所示；

(3)检测扩增产物，与阳性对照比较，判断提取纯化的总细菌中是否含有副猪嗜血杆菌。

本方法可用于多种环境中的副猪嗜血杆菌的检测，如土壤、未经处理的生活废弃物、医院废弃物、工厂废弃物、垃圾和人畜粪便以及大气中的漂浮物和气溶胶等环境中微生物的提取纯化。本发明一个具体实施方式中，用于检测的环境样品为养殖环境中的粪样、垫草、垫土(即土壤)。

seqno.1和seqno.2所示的碱基序列为：

seqno.1：5’-gtgatgaggaagggtggtgt-3’，

seqno.2：5’-ggcttcgtcaccctctgt-3’。

进一步地，总细菌的提取方法包括如下步骤：

(1)取环境样品，加入水或缓冲液，混匀；

(2)加入苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，待溶剂分层，移取上层备用；

(3)将移取的上层进行离心，弃上清，保留沉淀；

(4)将沉淀洗涤至基本无色，用水或缓冲液重悬菌液即可。

所述“溶剂分层”，是指步骤(2)引入的有机溶剂与步骤(1)中引入的水或缓冲液，由于两者不能完全互溶而分为两层(也可以称为两相)，本发明中取上层(主要是水相)。但有机溶剂与水或缓冲液可能会有一定互溶比例，因此，不排除各相溶剂中均含有一定量的有机溶剂和水。本发明中溶剂分层，可以采取多种方式，如静置、离心等。

优选地，加入环境样品中或重悬沉淀的为pbs缓冲液。

优选地，步骤(2)中，苯酚-氯仿-异戊醇混合液中，苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1～100:24:1。

优选地，苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1。

优选地，步骤(4)中，洗涤液为tenpp缓冲液，tenpp缓冲液组成为：50mmol/ltris，20mmol/ledta，100mmol/lnacl，1％pvpp，ph10.0。

本发明还提供了一种检测检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，包括序列如seqno.1和seqno.2所示的引物对，扩增来自副猪嗜血杆菌的基因。

本发明进一步提供了seqno.1和seqno.2所示的核苷酸序列的用途，可用于扩增或扩增后检测来自副猪嗜血杆菌的基因。

优选地，加入环境样品中和重悬沉淀(总细菌)的水为无菌水(如ddh2o)或无菌生理盐水，缓冲液为pbs缓冲液或tris-hcl缓冲液。

进一步优选地，加入环境样品中和重悬沉淀(总细菌)的为pbs缓冲液，其效果略优于水和其他缓冲液。

优选地，环境样品和pbs缓冲液的质量体积比为1g：3ml。

优选地，步骤(2)中，加入的苯酚-氯仿-异戊醇混合液与pbs缓冲液的体积比为5:3。

通常洗涤3～5次沉淀即可洗至基本无色，重悬菌液可用无菌水或各种常用的缓冲液，如pbs缓冲液，tris缓冲液等。

优选地，上述需离心的各步骤中，离心转速为12000rpm，离心时间为2～5min。

若环境中的总细菌较少，或为了提高本发明方法的检测灵敏度，可在步骤(2)移取上层后向下层样品(主要是有机相)中再加入pbs缓冲液，混匀，离心，移取上清备用；此步骤可再重复1～2次；合并前面移取的上层，然后进行步骤(3)及后面的操作。

本发明方法利用特定配比的有机溶剂、水或缓冲液将细菌从环境样品中提取出来，再通过洗涤进一步纯化，可用于快速高效地提取纯化环境样品中的总细菌，继而用于pcr检测。

环境中的总细菌既包括革兰氏阴性菌，又包括革兰氏阳性菌，二者的主要区别在于细胞壁。革兰氏阳性菌不能通过热裂解来直接进行菌落pcr检测，还需要用蛋白酶对细胞壁进行破壁，析出细菌dna，再进行pcr检测，类似于传统pcr检测方法。本发明提取纯化的总细菌中，虽含有革兰氏阳性菌，但在后续pcr实验过程中，不引入其他的裂解步骤，革兰氏阳性菌的存在对革兰氏阴性菌的菌落pcr检测方法并无影响。所以，本发明方法特别适合用于环境样品中的革兰氏阴性菌的pcr检测。

本发明通过特定的引物设计，检测重复性好，灵敏高，特异性好。

附图说明

图1苯酚-氯仿-异戊醇浓度筛选实验结果图

图2垫草中副猪嗜血杆菌菌落pcr检测图

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明进一步进行说明，但不应理解为对本发明的限制。

材料与试剂

(1)所用菌株

致病性副猪嗜血杆菌，西南民族大学张斌副教授赠送。

(2)主要试剂

2×pcrmix、marker、苯酚、氯仿、异戊醇、pbs缓冲液，pvpp等，均购自tiangen公司；细菌总dna提取试剂盒(用于垫草中细菌dna提取)试剂盒购自omega公司，其他试剂均为分析纯。

(3)引物：

表1引物序列表

由英骏生物技术有限公司合成。

实施例1苯酚-氯仿-异戊醇混合液配比的筛选

1材料：

待检细菌：副猪嗜血杆菌；载体：垫草。

2实验方法：

实验组共有7组，苯酚-氯仿-异戊醇配比(体积比)分别为：第1组0:24:1；第2组25:96:4；第3组50:72:3；第4组25:24:1；第5组：75:48:2；第6组为100:24:1；第7组为100:0:0。各组菌采用相同的细菌起始浓度，3×10⁶cfu/g。

将待检细菌加入垫草中，然后用本发明方法从混有细菌的垫草中将细菌提取纯化出来，进行菌落pcr检测。以空白样品为阴性对照(第9组)，同时采用相应dna提取试剂盒为阳性对照(第8组)。

具体过程为：称取0.1g垫草于1mlep管中，加入300μlpbs缓冲液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l)，涡旋混匀，加入苯酚-氯仿-异戊醇500ml，涡旋混匀，12000rpm离心2～5min，移取上层于另一干净灭菌ep管中。再加入300μlpbs缓冲液，涡旋混匀，12000rpm离心2～5min，移取上层于上次的ep管中，重复一次上述操作，合并三次的上层。将合并的菌液(上层)12000rpm离心5min，弃上清。将沉淀用500μltenpp缓冲液(20mmol/ledta，50mmol/ltris,1％pvpp，100mmol/lnacl，ph10.0)洗涤3～5次至上清基本无色。用50μlddh2o重悬菌液。取此菌液1μl进行后续pcr检测。

pcr反应体系及条件：

反应体系(25μl)：2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下游引物各1μl，用ddh2o补足至25μl。反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃10min。

凝胶电泳检测：

pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

3实验结果

如图1所示(lane1-7分别为酚-氯仿-异戊醇提取第1～7组，lanem为marker,lane8为阳性对照，lane9为阴性对照)，第4、5、6、7组和阳性对照组都能检出布氏杆菌的条带，第7组为单纯苯酚组，苯酚具有一定的亲水性，不能很好地将水相与有机相分离，萃取操作时，分界不明显，会造成二次操作，特别麻烦，所以苯酚-氯仿-异戊醇三者的配比为25:24:1～100:24:1较为合适。

实施例2pcr扩增及凝胶电泳法检测养殖场环境样品中提取纯化的病原菌

1.材料：

1.1所用菌株：致病性猪副猪嗜血杆菌。

1.2环境载体：垫草。

1.2引物，见表1：

2、方法：

2.1pcr反应体系及条件

反应体系(25μl):2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下游引物各1μl，用ddh2o补足至25μl。反应条件:94℃5min；94℃30s，55℃30s(布氏杆菌采用60℃30s)，72℃1min，共30个循环；72℃10min。

2.2凝胶电泳检测

pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.4本发明方法提取纯化病原菌用于pcr检测的有效性和敏感性试验

将副猪嗜血杆菌新鲜菌液分别计数后进行10倍系列稀释，取1×10⁰，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7稀释度各10μl加入0.1g垫草中，用本发明实施例1的方法提取纯化总细菌，并检测pcr敏感性。以空白样品为阴性对照，同时采用相应dna提取试剂盒为阳性对照，对比本发明方法的有效性和敏感性。

2.结果

如图2所示，本方法能从垫草样品中提取出副猪嗜血杆菌，完成菌落pcr检测。

lanem为marker，marker条带从上到下为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。lane1-5为采用本发明方法进行pcr的检测结果，lane6-10为采用标准dna提取试剂盒提取dna后进行pcr的检测结果。其中，lane1和lane6的垫草中副猪嗜血杆菌浓度为1×10⁶cfu/g，lane1-5为依次10倍浓度稀释，lane5和lane10为100cfu/g。

图2结果表明，本发明方法能从环境样品中提取检测到副猪嗜血杆菌的浓度下限为1×10⁴cfu/g，和市售dna提取试剂盒检测结果相当。

上述表明，本发明方法简化了pcr检测的前处理步骤，省去了繁琐的dna提取步骤，直接用本方法处理得到的稀释菌液或菌落为模板，以特定序列的引物对进行pcr扩增，重复性好，灵敏高，特异性好，检测时间短，节省人力物力，大大降低了检测成本。

sequencelisting

<110>四川省畜牧科学研究院

<120>一种从环境样品中提取纯化和检测副猪嗜血杆菌的方法

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>上游引物

<400>1

gtgatgaggaagggtggtgt20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>下游引物

<400>2

ggcttcgtcaccctctgt18