本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一种大菱鲆增食欲素Orexin基因、重组蛋白及其制备方法。
背景技术：
：Orexin（增食欲素）是一组近年来发现的新型下丘脑神经肽，最初是在研制能控制进食的新药试验中，在大鼠下丘脑腹外侧核内发现的。Orexin主要由下丘脑神经元产生，通过其神经纤维的直接投射或释放入脑脊髓液作用于靶位点，激活2种与G蛋白耦联的细胞表面受体OX1R和OX2R，参与机体对摄食、能量代谢、睡眠觉醒循环等生理活动的调节。Orexin在鱼类中的重要生理作用，近年来才被科学家认识并逐渐得到重视，针对Orexin的基因克隆、组织学分布、生理作用等相关研究随之展开。近年来，随着分子生物学特别是功能基因组学技术，被陆续应用于鱼类重要下丘脑神经多肽的发掘和生理调控功能研究以来，人们对于鱼类Orexin的结构、分布以及功能等领域的研究逐步得以深入。与此同时，随着垂体促性腺激素释放激素（GnRH）、生长激素（GH）等神经多肽在养殖生产中成熟地应用于调控鱼类的生长和繁殖以来，如何借助Orexin来人为调控养殖鱼类的摄食、营养代谢、能量平衡及其他生理活动也逐渐成为关注的重点。当前中国的海水鱼类养殖业发展迅速，为了促进产业朝着规模化、集约化、环境友好型的新型养殖模式发展，对鱼类摄食机理、营养吸收和能量转换等方面的基础研究显得尤为重要，为此急需开展鱼类Orexin等神经内分泌因子相关研究，开发鱼类早期发育必需的营养饲料，特别是为研制可应用于生产的促进鱼类摄食和生长的高新产品及技术打下基础，以实现育苗早期成活率的大幅度提高，就必将有利于推动海水鱼类养殖大产业向集约化、可持续、环境友好型的方向发展。技术实现要素：本发明的目的是提供了一种大菱鲆增食欲素Orexin基因、重组蛋白及其制备方法。本发明构建了含有大菱鲆增食欲素Orexin基因的重组表达载体，并将其转入表达菌株进行表达，经纯化获得大菱鲆增食欲素重组蛋白。为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明提供了一种大菱鲆增食欲素Orexin，所述大菱鲆增食欲素Orexin的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明提供了编码所述的大菱鲆增食欲素Orexin的Orexin基因，所述Orexin基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。进一步的：克隆所述Orexin基因所需的引物F1和R1序列如下：F1:5′-TGGGCAAGCGGGAGGAGGATGAGYAT-3′；R1:5′-ATRCTCATCCTCCTCCCGCTTGCCCA-3′。本发明提供了含有所述的Orexin基因的重组表达载体。进一步的：所述重组表达载体为pET-24a-SL，其制备过程为：使用正向引物F和反向引物R，通过PCR扩增获得所述Orexin基因，并在Orexin基因的两端分别添加XhoI和EcoRI酶切位点，将该核苷酸序列经过限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表达载体XhoI和Eco4RI酶切位点之间，获得重组表达载体pET-24a-orexin。进一步的：所述正向引物F和反向引物R序列如下：F:5′-CCGGAATTCATGACTCCCCTTCACAAAAAG-3′；R:5′-CCGCTCGAGCACAGGAAGGGGTGTTGTGATG-3′；PCR扩增的反应条件为：95℃5min；95℃35s，55℃退火35s，72℃延伸1min，35个循环。本发明提供了所述的大菱鲆增食欲素Orexin重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：（1）将重组表达载体pET-24a-orexin转化大肠杆菌，将挑取的阳性克隆菌株接种于含有卡那霉素的LB液体培养瓶中，37℃振荡培养过夜，次日转接到含有LB培养基的发酵罐中，37℃培养到OD600=0.5~1.0时，加入IPTG诱导重组蛋白表达，离心收集细菌培养物；（2）将诱导表达后的细菌培养物重悬于裂解液中，超声破碎，将超声破碎的细胞裂解液离心，收集沉淀即为包涵体，使用包涵体洗涤液洗涤包涵体；用溶解缓冲液溶解包涵体，4℃放置过夜；室温下离心；将上述溶液滴加到缓冲液，将稀释后的包涵体溶液装入透析袋中，4℃透析过夜；（3）利用低压层析系统，将透析后的包涵体溶液上样至Ni柱；收集洗脱后的蛋白流出液；装入透析袋中，放入缓冲液中，透析过夜；获得纯化后的增食欲素Orexin重组蛋白。进一步的：所述步骤（1）中IPTG的浓度为0.5~0.7mmol/L，诱导表达的时间为3~5h。进一步的：所述步骤（3）中透析后的包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱。本发明的优点和技术效果是：本发明利用分子生物学手段获得大菱鲆增食欲素Orexin的成熟肽编码序列，通过构建重组大菱鲆增食欲素Orexin的原核表达载体，转化表达宿主菌，诱导菌体表达，收集菌体及纯化获得重组表达的大菱鲆增食欲素Orexin重组蛋白。本发明可用于制备ELISA试剂盒和饲料添加剂等产品，将为研究大菱鲆的食欲调控机理和开发可应用于生产的促进鱼类摄食和生长的新产品打下良好基础。附图说明图1：表达载体pET-24a-orexin示意图。图2：重组表达载体pET-24a-orexin的双酶切核酸电泳图；其中：LaneM：DL2,000DNAMarker；Lane1：重组表达载体双酶切产物。图3：SDS-PAGE分析重组大菱鲆增食欲素（Orexin）蛋白表达情况，其中：LaneM：蛋白分子质量标准。图4：SDS-PAGE分析纯化的大菱鲆增食欲素（Orexin）重组蛋白，其中：LaneM：蛋白分子质量标准；Lane1：经Ni柱纯化后的大菱鲆Orexin重组蛋白。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。1、大菱鲆下丘脑总RNA提取大菱鲆下丘脑总RNA提取采用的EasyPureTMRNAKit动物组织提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司提供)。具体操作方法如下：1）取20mg左右下丘脑组织，快速用液氮速冻组织，用研磨杵将组织研磨成粉未，将粉未转移到1.5ml离心管中加入0.6mlBindingBuffer和15mlProteinaseK，混匀后56℃处理20分钟。2）室温12000r/min离心5分钟吸上清于RNase-free的离心管中，向上清中加入等倍体积70%乙醇。3）彻底混匀，将得到的沉淀和溶液一起加入离心柱中，12000r/min离心30秒，弃掉流出液。4）向离心柱中加500mlCB4（CleanBuffer4），室温12000r/min离心30秒，弃掉流出液。然后向离心柱中加入80ml的DNaseI工作液，室温放置15分钟.5）重复步骤2）一次。6）加500mlWB4（WashBuffer4）室温12000r/min离心30秒，弃掉流出液。7）重复步骤4）一次。8）室温12000r/min离心2分钟，彻底去除残留的乙醇，在室温中静置数分钟彻底晾干离心柱。9）将离心柱放入一个新的1.5mlRNase-free的管中，并向离心柱中央加入50mlRNase-freeWater,,室温静置1分钟。10）室温12000r/min离心2分钟，用45ml洗脱液洗脱RNA。11）取5mlRNA样品在2.0%的琼脂糖凝胶中电泳，EB染色观察结果。再取2mlRNA样品在NanoDrop2000c分光光度计检测RNA的浓度和纯度。2、大菱鲆增食欲素（Orexin基因全长序列RACE克隆1）3’RACE扩增大菱鲆增食欲素Orexin基因cDNA下游序列使用SMARTRACE试剂盒以及特异引物F1（SEQIDNO:3）和试剂盒中的3’CDS通用引物,进行3’RACE扩增。反应条件如下：95°C预变性5min：以下重复30个循环：95°C变性35s，54°C退火35s，72°C延伸50S；最后72°C延伸10min。3’RACE扩增PCR体系：反应体系反应体积（20μl）2×PCRMix10μlddH2O7μlF11μl3’CDS1μlcDNA1μl2）5’RACE扩增大菱鲆增食欲素Orexin基因cDNA上游序列使用SMARTRACE试剂盒以及特异引物R1（SEQIDNO:4）和试剂盒中的5’Oliogo通用引物,进行5’RACE扩增。反应条件如下：95°C预变性5min：以下重复35个循环：95°C变性35s，52°C退火35s，72°C延伸40min；最后72°C延伸10min。F1:5′-TGGGCAAGCGGGAGGAGGATGAGYAT-3′（SEQIDNO:3）；R1:5′-ATRCTCATCCTCCTCCCGCTTGCCCA-3′（SEQIDNO:4）。5’RACE扩增PCR体系：反应体系反应体积（20μl）2×PCRMix10μlddH2O7μlR11μl5’Oliogo1μlcDNA1μl3）用2.0%琼脂糖凝分离PCR扩增得到DNA片段,并利用胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）纯化分离得到目的DNA片段,然后亚克隆到pMD18-载体上，挑选阳性克隆委托上海生工进行测序，获得核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的Orexin基因，编码产生的大菱鲆增食欲素Orexin的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3、大菱鲆增食欲素Orexin的蛋白重组表达质粒构建1）以大菱鲆下丘脑总RNA反转录cDNA为模板，以带有酶切位点和保护碱基的引物：正向引物F和反向引物R为引物进行PCR扩增。反应条件为：95℃5min；95℃35s，55℃退火35s，72℃延伸1min，35个循环。正向引物(F):Forward5’-CCGGAATTCATGACTCCCCTTCACAAAAAG-3’（SEQIDNO:5）；反向引物(R)：Forward5’-CCGCTCGAGCACAGGAAGGGGTGTTGTGATG-3’（斜体CCG为保护碱基；下划线GAATTC为Xhol位点；下划线CTCGAG为EcoR1位点）（SEQIDNO:6）。2）克隆得到编码大菱鲆增食欲素（Orexin）基因蛋白的cDNA序列并且两端分别带有XhoI和EcoRI酶切位点，将该序列经过限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表达载体XhoI和EcoRI酶切位点之间，获得重组表达载体pET-24a-orexin。表达载体示意图如图1所示，大菱鲆增食欲素Orexin基因的cDNA序列经XhoI和EcoRI双酶切后的电泳结果如图2所示。4、大菱鲆增食欲素（Orexin）重组蛋白在大肠杆菌中的表达将重组表达载体pET-24a-orexin转化大肠杆菌BG21，挑选阳性克隆，测序正确后，将挑取的BG21菌株接种于含有卡那霉素的LB液体培养瓶中，37℃振荡培养过夜，次日按1:100~1:500(V/V)转接到含有10LLB培养基的15L的发酵罐中，37℃培养到OD600=0.5~1.0时，按浓度0.5~0.7mmol/L加入IPTG诱导3~5h，6000rpm离心10min，收集细菌培养物放到置于-20℃保存。采用SDS-PAGE分析重组大菱鲆Orexin蛋白表达情况，结果如图3所示。5、大菱鲆增食欲素（Orexin）重组包涵体蛋白的变复性将诱导表达后的菌体沉淀重悬于裂解液Lysisbuffer(20mMTris-HClcontaining1mMPMSFandbacteriaproteaseinhibitorcocktail,pH8.0)中，超声破碎，将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集沉淀即为包涵体，使用包涵体洗涤液(20mMTris，1mMEDTA，2M尿素，1MNaCl，1％TritonX-100，pH8.0)洗涤包涵体3-5次；用溶解缓冲液(20mMTris，5mMDTT，8M尿素pH8.0)，按一定比例溶解包涵体，4度放置过夜；室温，15000rpm离心15min；将上述溶液滴加20mMTris-HCL5mMEDTABufferPH7.8缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，剪取处理好适量长度的透析袋，在纯水中冲洗，将蛋白溶液装入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）缓冲液中，4℃透析过夜。6、大菱鲆增食欲素（Orexin）重组蛋白的Ni柱亲和纯化利用低压层析系统，将透析后的包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱；用Ni-IDABinding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDAWashing-Buffer(20mMTris-HCl，20mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl，250mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集蛋白流出液；剪取处理好适量长度的透析袋，在纯水中冲洗，将上述收集的蛋白溶液装入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）缓冲液中，4℃透析过夜；分步收集洗脱液，检测纯度和含量。分别取3μL未纯化包涵体蛋白、3μL变复性的蛋白和1μL洗脱的纯化产物与蛋白质分子量标准进行12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯蓝染色后，于凝胶成像系统观察重组蛋白纯化效果，结果见图4所示。经亲和层析法纯化后获得纯化的重组蛋白，收集后作为样品备用。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。SEQUENCELISTING<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所<120>一种大菱鲆增食欲素Orexin基因、重组蛋白及其制备方法<130><160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>170<212>PRT<213>人工序列<400>1MetThrProLeuHisLysLysGlnLysMetMetMetTrpSerHisThr151015AsnLeuGlnArgMetThrProLeuHisLysLysGlnLysMetMetMet202530TrpSerHisThrAsnLeuGlnArgAlaAlaGlyMetAspProSerAsn354045LysLysValLeuValLeuValLeuThrLeuLeuLeuSerGlnLeuThr505560CysAspAlaHisSerLeuSerGluCysCysArgGlnThrSerArgSer65707580CysArgLeuTyrValLeuLeuCysArgSerGlyGlyLysAspThrGly859095GlyThrLeuAlaGlyAspAlaAlaAlaGlyIleLeuThrLeuGlyLys100105110ArgGluGluAspGluHisArgLeuHisSerArgLeuHisGlnLeuLeu115120125GlnValSerArgAsnGlnAlaAlaGlyIleLeuThrMetGlyLysArg130135140ThrGluGluSerAlaGlyGlyArgTyrMetAspTrpMetAlaArgSer145150155160GlyValThrIleThrThrProLeuProVal165170<210>2<211>453<212>DNA<213>人工序列<400>2atgactccccttcacaaaaagcagaagatgatgatgtggtcccacaccaacctccagaga60gctgctgggatggacccgtccaacaagaaagtcctggtgctcgtcttgacgttgctgctg120tcccagctgacctgcgacgctcacagcctgtctgagtgctgcagacaaacgtcccgctcc180tgtcgcctttacgtgttgctgtgtcgctccggcggaaaggacacgggggggacgctcgca240ggagacgccgccgctggcatcctcaccctgggcaagcgggaggaggatgagcatcgcctg300cacagccgactccaccagctcctgcaggtctccaggaaccaggcggccgggatcctgacg360atggggaagaggacagaggagagcgctggagggcggtacatggactggatggctcgatcg420ggggtcaccatcacaacaccccttcctgtgtga453<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>3tgggcaagcgggaggaggatgagyat26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>4atrctcatcctcctcccgcttgccca26<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5ccggaattcatgactccccttcacaaaaag30<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>6ccgctcgagcacaggaaggggtgttgtgatg31当前第1页1 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