一种抗人Tim‑3单克隆抗体8E11及其制备方法与流程

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一种抗人Tim‑3单克隆抗体8E11及其制备方法与制造工艺

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种抗人Tim-3单克隆抗体8E11及其制备方法。



背景技术:

Tim-3基因及Tim-3结构蛋白:小鼠Tim-3基因位于第11号染色体上,转录本全长为1015个碱基;而人类Tim-3基因位于第5号染色体上,转录本全长为1116个碱基。Tim家族至少有四位成员,分别为Tim-1、Tim-2、Tim-3、Tim-4。其中Tim-1为甲型肝炎病毒的受体,Tim-2可以特异性表达于Th2细胞,Tim-3蛋白是活化的Th1细胞表面标志,Tim-4作为Tim-1的配体分子,表达于成熟的DC。

目前的数据表明,小鼠Tim-3分子由281个氨基酸组成,与Th1相关的反应及疾病有关;人类Tim-3分子是由301个氨基酸组成的I型膜蛋白,其胞外部分包括一个富含半胱氨酸的Ig样区域和一个黏蛋白区域,Ig样区包括4个保守的半胱氨酸,黏蛋白区富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸。其胞内区约含42~77个氨基酸,这是小鼠和人类同源物中最高度保守的区域。

Tim-3基因和免疫系统相关疾病及功能方面的联系:人类Tim家族位于5q33.2,此区是哮喘的易感区。某些遗传性过敏症,例如哮喘和过敏性鼻炎,其敏感性和Tim-3基因-574T/G多态性位点联系最为密切。在过敏性鼻炎患者中,Tim-3基因在-1516G/T,-574T/G,4259G/T位点的基因型和等位基因频率和正常人存在显著性差异。对Tim-3启动子区两个单核甘酸多态性位点和过敏性哮喘之间的关系进行了研究,证明了Tim-3启动子区多态性位点和过敏性疾病之间有着密切关联。

自身免疫病是一种和炎症反应相关的疾病。如果能下调炎症反应,就可以减少,甚至是阻止自身免疫病的发生。一些受体分子(例如CTLA-4)、细胞因子(例如TGF-β),还有调节性细胞(例如CD4+CD25+T细胞)共同保持机体的免疫平衡。Tim家族蛋白是炎症反应的一种主要调节分子,提供抑制性信号,下调炎症反应,减少自身免疫病和过敏反应的发生。Fri-sancho-Kiss等通过降低病毒感染鼠Tim-3信号的表达,可以在巨噬细胞和肥大细胞诱导协同刺激分子CD80降低表达,还可以降低CD4+T细胞CTLA-4水平,最终导致了调节T细胞的减少和心脏炎症反应的增加,说明Tim-3信号在调控适应性免疫应答方面起着很重要的作用。

免疫因素是影响肿瘤细胞在体内存活并扩增的重要因素之一。长期使用免疫抑制剂的移植受者,由于不能活化大量有功能的T细胞,常常有并发某些恶性肿瘤的危险。一般认为,T细胞免疫为肿瘤免疫的主要内容,体内如果能够产生足够针对肿瘤细胞的特异性细胞毒性T细胞(CTL),肿瘤细胞很难存活。Tim-3为Th1型细胞的特异性表面标志,不表达于初始T细胞、B细胞、DC以及造血细胞。推测Tim-3可以通过调节Th1型细胞反应,进而调节肿瘤免疫。

Tim-3/Tim-3L与Th免疫反应:Tim-3的配体(Tim-3L)表达比Tim-3要广泛得多。Zhu等的研究发现了Tim-3L高表达在TK-1(一种CD8+的小鼠淋巴瘤细胞)上,并鉴定为半乳凝素-9(Galectin-9)。Galectin-9是一黏附在细胞膜上的可溶性糖蛋A,可诱导胸腺细胞和外周的CD4+、CD8+T细胞凋亡,在调节免疫细胞的动态平衡和炎症反应中起着重要的作用。另有研究发现,阻断Tim-3/Galectin-9通路,CD4+CD25+调节性T细胞介导的可以延长同种异体皮肤移植的存活作用消失了,证明了Tim-3L不仅仅表达在CD4+CD25+调节性T细胞上,而且Tim-3/Galectin-9通路影响了CD4+CD25+调节性T细胞功能的发挥。Galectin-9也存在于脾内少数CD11+树突状细胞和CDllb+单核细胞的表面,Tim-3L可能还表达于巨噬细胞及APC上。

Tim-3与Tim-3L(Galectin-9)结合从而下调Thl型免疫应答,并且可以调节CD4+CD25+调节性T细胞。为了了解Tim-3与其配体结合从而抑制Th1细胞效应功能的机制,Kuchroo等在分化成熟的Thl、Th2细胞中加人Galectin-9,发现异常的钙离子内流和快速的Thl细胞死亡,而Th2细胞和Tim-3-/-的Thl细胞无此效应,从而证实了Galectin-9的作用依赖于与Tim-3的结合。在许多Thl反应异常的疾病中存在着Tim-3/Tim-3L信号通路的异常。自身免疫性脑脊髓炎(EAE)属于典型的Thl型免疫反应,Monney等在在小鼠EAE模型中,应用Tim-3抗体能加速疾病的发作,增加疾病的严重性和死亡率。WangF等_研究表明在同种异体皮肤移植小鼠给予重组Galectin-9,能选择性删除Tim3+Th1细胞,使IFN-γ分泌下降,显著抑制同种异体移植物排斥反应,增加同种异体移植皮肤的存活率。

Tim-3/Tim-3L与肿瘤免疫:一般认为肿瘤免疫中以T淋巴细胞为核心,CD8+T细胞可以直接作为效应细胞来特异地杀伤癌细胞,被称为杀伤性T淋巴细胞(CTL)。还有另一类杀瘤细胞为NK细胞,此类细胞无需抗原预先致敏就能自发地杀伤靶细胞,且具有细胞毒效应。CD4+T细胞较少受到关注,但它们在调节机体的肿瘤免疫中也发挥着重要的作用。CD4+T细胞Thl细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等,它们可以直接或间接地通过激活CTL细胞、NK细胞和巨噬细胞的细胞毒和吞噬作用来促进细胞免疫,因此它们对机体的抗肿瘤免疫反应非常重要。在进展期肿瘤患者中主要是Thl细胞受到抑制,因而肿瘤免疫治疗要设法使其Thl/Th2向Thl漂移。Tim-3为Thl型细胞的特异性表面标志,不表达于初始T细胞、B细胞、DC以及造血细胞。进而推测Tim-3可以通过调节Thl细胞反应,从而调节肿瘤免疫。

Tim-3/Tim-3L在肿瘤免疫中的负性调控

Klibi等的研究发现:鼻咽癌细胞分泌的外核体中有大量的Galectin-9表达,Galectin-9插人到外核体中表达,则能够防止被蛋白酶切割。鼻咽癌细胞分泌的外核体能够诱导特异性的鼻咽癌CD4+T细胞大量凋亡,此效应可以被抗Tim-3抗体或者抗Galectin-9抗体所抑制,从而证明了阻断Tim-3/Galectin-9这条通路,能够减轻鼻咽癌外核体对Thl免疫应答的抑制反应,从而维持T细胞的抗肿瘤效应,提高了临床免疫治疗鼻咽癌的效果。Zoltan等的研究发现:Tim-3在人的肥大细胞和黑色素瘤细胞上都有高表达,有趣的是Galectin-9也在肥大细胞上表达,而不在肿瘤细胞上表达;他们还发现TGF-β1刺激过的肥大细胞,其Tim-3的表达量的升高会抑制机体的抗肿瘤能力,而且这种促瘤作用可能是依赖肥大细胞上表达的Tim-3与自身肥大细胞上表达Galectin-9的结合,所以他们认为Tim-3是促进黑色素瘤这种肿瘤细胞的发展。Geng等构建了sTim-3的真核表达质粒psTim-3,转染了该表达质粒的动物,其体内黑色素瘤细胞加速生长,这可能与sTim-3在体内可以抑制细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-β的产生有关;且抗肿瘤CTL细胞的活性下降,肿瘤组织中的浸润淋巴细胞数量减少,说明sTim-3能显著降低T细胞的抗肿瘤免疫;在实时定量PCR监测肿瘤微环境的基因表达情况中还发现Thl细胞因子的基因表达下调,而与调节性T细胞相关的基因Foxp-3、IL-10、TGF-β表达情况则基本不变。由此表明,sTim-3可能参与了T细胞介导免疫应答的负性调控。



技术实现要素:

鉴于现有技术的情况,本发明的目的在于提供一种抗人Tim-3单克隆抗体8E11及其制备方法。

为了实现上述目的及其他相关目的,本发明采用如下技术方案:

本发明的第一方面提供了一种抗人Tim-3单克隆抗体,所述抗体含有轻链可变区和重链可变区。

优选地,轻链可变区含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

优选地,重链可变区含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明第二方面提供了一种多核苷酸,其编码所述抗人Tim-3单克隆抗体。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

编码所述单克隆抗体的多核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述,如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等,科学出版社,1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法。

在本案的较佳实施例中,编码上述单克隆抗体的多核苷酸为DNA分子,所述DNA分子含有编码所述单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列以及编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。

编码所述单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明第三方面提供了一种表达载体,其含有所述多核苷酸以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述单克隆抗体的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上,以指导mRNA合成进而表达蛋白,或者用于同源重组。

较佳的,所述载体为原核载体或穿梭质粒等。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞,其被所述载体所转化。

宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门菌、李斯特细菌;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO,COS.293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明第五方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法,该方法具体包括如下步骤:

a)获得目的基因片段;

b)将目的基因融合片段插入表达载体中;

c)将获得的表达载体转化真核宿主细胞;

d)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤c)所得的真核宿主细胞;

e)分离纯化获得所述重组单克隆抗体。

较佳的,步骤a)中,所述目的基因含有SEQ ID NO:3所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列,以及SEQ ID NO:4所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。

较佳的,步骤b)中,所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体,优选pNP表达载体。

较佳的,步骤c)中,可将获得的表达载体转化大肠杆菌,优选大肠杆菌DH5a;宿主细胞,可优选CHO细胞。

较佳的,步骤e)中,分离纯化方法为:用ProteinG亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化出上述单克隆抗体。

本发明第六方面,提供了所述单克隆抗体在制备Tim-3检测或诊断试剂盒中的应用。

本发明第七方面,提供了一种Tim-3检测或诊断试剂盒,含有前述单克隆抗体。

与现有技术相比,本发明的有益效果为:

本发明的抗人Tim-3单克隆抗体特异性高,效价高,相对于目前市场上常用的R&D公司和eBioscience公司的抗人Tim-3抗体结合效率更高,为Tim-3的检测提供了全新的手段。

附图说明

图1:本发明的抗人Tim-3单克隆抗体8E11抗体标记L929-Tim3细胞,再标记羊抗鼠PE二抗(eBioscience),流式细胞仪检测结果,同时设置商品化抗体和同型对照。

具体实施方式

本发明涉及一种抗人Tim-3单克隆抗体,该抗体包含重链可变区和轻链可变区。轻链可变区含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。重链可变区含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体,即该群体中包含的单个抗体是相同的,除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原点。而且,与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的,不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,是从基本均一的抗体群中获得的,这不应被解释成需要用任何特殊方法来产生抗体。

本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端由可变区(VL),另一端有恒定区:轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸在轻链和重链的可变区之间形成界面。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为架构区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈p一折叠构型,由形成接连环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分p折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH PuB,No.91-3242,卷I,647-669页(1991)),恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来获得。例如,单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等,Nature,256:495(1975)首先提出)制得,或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。

本发明还提供了编码本发明抗人Tim-3单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中,该DNA分子含有SEQ ID NO:3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列,以及SEQ ID NO:4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

在获得编码本发明抗人Tim-3单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后,通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。

首先,提供含有编码本发明的单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达裁体。

本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常含包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活动。例如,如果启动子或增强子增加了编码序列的转录,则它与编码序列是操作性相连的。

编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如,可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后,用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切为点将这些核苷酸序列插入合适的表达裁体中,使它们分别在表达裁体中所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前,并使它们在同一读框中。

本发明所用的表达裁体是本领域技术人员已知的各种市售的表达裁体,例如购自Qiagen和Promega公司的表达裁体,以及可购得的表达裁体pMG18(《根据INCP-9质粒序列进行环境监测的工具德开发》(DEVELOPMENT OFTOOLS FORENVIROMNENTAL MONITORING BASED ON INCP-0PLASMIDS SEQUENCES),A.Created,R.Krasowiak,M.Titok,C.M.ThomasSchool of Biological Sciences,University of Birmingham,Edgbaston,Birmingham B152TT,UK and Faculty of Biology,Dept of MicroBiology,Belarus State UniversityScoring Av.4,Minsk 220080Belarus).

随后,用上述获得的表达裁体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞核哺乳动物细胞。在本发明中,较佳的宿主细胞是CHO细胞。用表达裁体转化宿主细胞的方法有很多种,所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法本领域所知的,其包括葡聚糖界导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1,5一二甲基一1,5一二氮十一亚甲基聚臭化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中,较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染CHO细胞。

然后,在适合本发明单克隆抗体表达的条件下,培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤,如蛋白A-Sepharose羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的重组抗双酚A单克隆抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结核试验(如放射性免疫测定Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard)分析来测定。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。

实施例1抗人Tim-3单克隆抗体8E11的制备与获得

一、动物免疫

以纯化的重组人Tim-3蛋白(R&DSystems,2365-TM)为免疫原,免疫6~8周龄的BALB/c小鼠,每2周免疫1次,共免疫3次,于融合前4天,再次以加强免疫。

二、骨髓瘤细胞的准备

融合前10天复苏小鼠骨髓瘤细胞Ag8,采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,待细胞生长旺盛、形态良好(浑圆,透亮,大小均一),且细胞活力大于95%(苔盼蓝染色)方可用以融合。融合前24~36h用新鲜培养基将细胞浓度调整为3×105/mL。

三、杂交瘤细胞株的建立

实验开始前将DMEM基础培养基、PEG溶液置于37℃水浴中预温。收集2×107个生长良好的Ag8细胞,与1×108个脾脏细胞混合于50ml离心管中,用无血清DMEM培养基洗涤两遍,1000rpm离心5min后弃尽上清,用手指弹击管底,使两种细胞充分混匀成糊状。将塑料管置于37℃保温杯中,吸取1ml经37℃预温的50%的PEG溶液,将尖头吸管轻轻插入细胞悬液中,在1min内匀速加完,且边加边轻轻搅拌,然后在37℃水浴中静置90s。接着在3个1min内同样匀速分别加入1ml、2ml、3ml 37℃预温的无血清DMEM,最后加入37℃预温的无血清DMEM使管内液体终体积为40ml,室温静止5min,800rpm离心10min,弃上清,将沉淀细胞轻置于100ml含2%HAT、10%胎牛血清的DMEM培养基中。混匀后滴加在含有饲养细胞的96孔培养板中,100μl/孔,37℃、5%CO2培养,3~4d后半量换液,10d后改用HT培养基,2周后转用含10%胎牛血清的DMEM培养基。

四、阳性杂交瘤细胞的筛选

待杂交瘤细胞克隆布满1/3-1/4培养孔时(培养基颜色呈黄色),即可吸取上清用间接免疫荧光标记和流式细胞术进行筛选。以L929-Tim-3基因转染细胞为阳性抗体筛选细胞,L929为阴性抗体筛选细胞,同时以商品化PE标记的抗人TIM-3单抗(R&DClone#344823)为阳性对照。吸取杂交瘤培养上清用间接免疫荧光标记法和流式分析进行筛选,获得阳性克隆后适时换液并及时按上述方法进行复筛。

五、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养

采用有限稀释法将阳性孔的细胞准确计数后,用HAT选择培养基梯度稀释为10个/ml细胞,稀释后的细胞悬液100μl/孔于96孔培养板中,每孔平均含有1个细胞,37℃、5%CO2培养。根据细胞的生长状态适时更换培养基并及时按已建立的阳性克隆的筛选方法进行复筛。选择单个克隆生长、形态良好、抗体效价高的杂交瘤细胞继续亚克隆,直至抗体分泌阳性率大于98%;扩大培养并及时液氮冻存。

将获得的鼠抗人Tim-3单克隆抗体8E11进行可变区测序。

从杂交瘤细胞株中分离总RNA,转录成cDNA库。PCR扩增编码抗体重链和轻链可变区DNA。PCR产物跑胶之后回收纯化之后送测序。

得知,本发明的抗人Tim-3单克隆抗体8E11,轻链可变区具有的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,具体为:

LDIVLTQSPSYLAAPPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAMYYRQQHNEYPWTFGGGTKLEIKRI。

重链可变区具有的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,具体为:

HRVESGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFLSRLNITMDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARDLYHYAMDYWGQGTSITVSSKSQSFPNVFPLISCDSPLSDKNLV。

编码所述单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的,具体为:

CTCGATATTGTGTTGACACAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCACCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAACTTCTTATATACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAACCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACCGTCAACAGCATAATGAATACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAACGTATA。

编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,具体为:

GCTGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGGCTTCAGGTGCACCGGGTGGAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAcCTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCCTATCCAGACTGAACATCACCATGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGCCTGCAAGCTGATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGACCTTTACCACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAATCACCGTCTCCTCAAAGAGTCAaTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCaTCTCCTGCGACAGCCCCCTGTCTGATAAGAATCTGGTGGC。

实施例2抗人Tim-3单克隆抗体的效价评价

培养L929-Tim3细胞,转移至96孔板,每孔1×105细胞悬浮在100μl的含1%FBS的PBS中。每孔加入相同量0.2μg的抗体,包括实施例1制备的抗人Tim-3单克隆抗体8E11、同型对照以及R&D和eBioscience公司抗人Tim-3抗体。在4℃避光条件下孵育20分钟,然后离心弃去上清,重悬在含1%FBS的PBS中,流式细胞术检测。

结果如图1所示,与R&D公司以及eBioscience公司已知的抗体相比,本发明的抗人Tim-3单克隆抗体,在相同浓度下可以更高效率的结合率。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 常州格鲁康生物医药科技有限公司

<120> 一种抗人Tim-3单克隆抗体8E11及其制备方法

<130> 164867

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 轻链可变区具有的氨基酸序列

<400> 1

Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Pro Pro

1 5 10 15

Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Arg Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile

100 105 110

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 重链可变区具有的氨基酸序列

<400> 2

His Arg Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly Val

20 25 30

His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val

35 40 45

Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Leu Ser Arg

50 55 60

Leu Asn Ile Thr Met Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp

85 90 95

Leu Tyr His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Ile Thr

100 105 110

Val Ser Ser Lys Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe Pro Leu Ile Ser

115 120 125

Cys Asp Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val

130 135

<210> 3

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码所述单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列

<400> 3

ctcgatattg tgttgacaca gtctccatct tatcttgctg cacctcctgg agaaaccatt 60

actattaatt gcagggcaag taagagcatt agcaaatatt tagcctggta tcaagagaaa 120

cctgggaaaa ctaataaact tcttatatac tctggatcca ctttgcaatc tggaattcca 180

tcaaggttca gtggcagtgg atctggtaca gatttcactc tcaccatcag taacctggag 240

cctgaagatt ttgcaatgta ttaccgtcaa cagcataatg aatacccgtg gacgttcggt 300

ggaggcacca agctggaaat aaaacgtata 330

<210> 4

<211> 473

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列

<400> 4

gctgctcgag cggccgccag tgtgatggat atctgcagaa ttcggcttca ggtgcaccgg 60

gtggagtcag gacctggcct agtgcagccc tcacagagcc tgtccatcac ctgcacagtc 120

tctggtttct cattaactac ctatggtgta cactgggttc gccagtctcc aggaaagggt 180

ctggagtggc tgggagtgat atggagtggt ggaagcacag actataatgc agctttccta 240

tccagactga acatcaccat ggacaattcc aagagccaag ttttctttaa aatgaacagc 300

ctgcaagctg atgacacagc catatattac tgtgccagag acctttacca ctatgctatg 360

gactactggg gtcaaggaac ctcaatcacc gtctcctcaa agagtcaatc cttcccaaat 420

gtcttccccc tcatctcctg cgacagcccc ctgtctgata agaatctggt ggc 473

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