一种构建Hi‑C高通量测序文库的方法与流程

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种构建Hi-C高通量测序文库的方法。

背景技术：

经典染色质构象捕获(Chromosome conformation capture，3C)技术是一种通过定量手段(PCR产物的有和无、产量的高和低)对DNA之间是否存在相互作用以及作用强度这一定性、定量问题进行研究的技术，其主要经过甲醛交联、酶切、连接、解交联、DNA纯化与PCR鉴定与定量等步骤。通过一对与选定的两段DNA分别配对的引物进行PCR扩增，根据PCR产物的有无、产量的高低等，就可以对是否存在相互作用以及相互作用的强弱进行判断。高通量染色质构象捕获技术(Hi-C技术)是染色质构象捕获的一种衍生技术，是指基于高通量测序进行全基因组染色质构象的捕获。在Hi-C技术中，以整个细胞核为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系即空间三维高级结构；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息，把基因表达调控引入到空间的、全局性的研究层面，为全面解析与DNA有关的生物学过程的机理开启新的契机。

Hi-C技术自从2009年问世以来，虽然经过了诸如从溶液中连接到原位连接等改进，但是目前仍然存在诸多不足，如不易于标准化、结果不稳定、建库步骤繁琐、建库时间长、数据质量较差等等。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何构建优质的Hi-C高通量测序文库。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了构建Hi-C高通量测序文库的方法。

本发明所提供的构建Hi-C高通量测序文库的方法，具体可为方法一，依次包括如下步骤：

(1)取解交联后的DNA，进行纯化和富集；

(2)进行转座反应；

(3)进行PCR扩增，获得文库。

本发明所提供的构建Hi-C高通量测序文库的方法，具体可为方法二，依次包括如下步骤：

(1)取解交联后的DNA，进行纯化；

(2)超声处理，进行富集；

(3)进行转座反应；

(4)进行PCR扩增，获得文库。

上述方法中，所述转座反应的反应体系可包括：完成上一步骤的DNA和转座酶。

所述完成上一步骤的DNA具体可为将解交联后的DNA进行纯化和富集，得到的DNA。

所述完成上一步骤的DNA具体可为将解交联后的DNA，进行纯化；然后超声处理，进行富集，得到的DNA。

上述方法一或方法二中，所述转座反应的反应体系可由完成所述富集的DNA、转座酶和转座酶缓冲液组成。

上述方法一或方法二中，所述转座反应的反应体系可由完成所述富集的DNA、转座酶和转座酶缓冲液和水组成。

所述转座酶可为Tagment DNA Enzyme。所述转座酶缓冲液可为2×Tagment DNA buffer。所述2×Tagment DNA buffer和所述Tagment DNA Enzyme均为Nextra DNA prep kits中的组件；Nextra DNA prep kits为Illumina公司的产品，产品目录号为FC-121-1030。

25μL所述转座反应的反应体系由完成所述富集的DNA、12.5μL 2×Tagment DNA buffer、1μL Tagment DNA Enzyme和11.5μL ddH₂O组成。

上述方法一或方法二中，所述转座反应的条件可为：37℃3min。

上述方法一或方法二中，所述“进行转座反应”之后、所述“进行PCR扩增，获得文库”之前，还包括步骤(A)：从完成所述转座反应的体系中分离DNA。

上述方法一或方法二中，所述“进行PCR扩增，获得文库”的具体步骤可依次如下：

(a)制备反应体系甲；所述反应体系甲由缓冲液和ddH₂O组成；

(b)取所述反应体系甲，95-100℃处理40-50s；

(c)制备反应体系乙；所述反应体系乙由完成步骤(b)的体系、上游引物、下游引物和从完成所述转座反应的体系中分离的DNA组成；

(d)取所述反应体系乙，进行PCR扩增。

所述步骤(a)中，所述缓冲液可为2×KAPA HiFi hotstart mix。38μL所述反应体系甲具体可由25μL 2×KAPA HiFi hotstart mix和13μL ddH₂O组成。

所述步骤(b)具体可为：取所述反应体系甲，98℃处理45s。

所述步骤(c)中，所述上游引物可为Nextra Primer 1.0：5’

-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-3’，下游引物可为Nextra Primer 2.1：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’或Nextra Primer 2.2：5’

-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’。50μL所述反应体系乙具体可由38μL完成步骤(b)的体系、1μL浓度为25μM的Nextra Primer 1.0、1μL浓度为25μM的Nextra Primer 2.1或Nextra Primer 2.2、和10μL从完成所述转座反应的体系中分离的DNA的水溶液组成。

所述步骤(d)中，所述PCR扩增的反应程序为：72℃延伸5min；98℃变性30s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃延伸1min。

上述方法二中，所述超声处理的参数可为：超声频率35％；超声1s，停1s，超声总时间可为200s。

上述方法一或方法二中，所述“解交联后的DNA”的制备方法依次包括如下步骤：

(1)用甲醛固定生物细胞核染色质；

(2)裂解所述生物细胞，收集细胞核；

(3)限制性内切酶酶切；

(4)加入生物素化的脱氧核糖核苷酸，连接；

(5)加入蛋白酶K，解交联。

所述生物可为细菌、植物或动物。所述细菌具体可为冰岛硫化叶菌REY15A。

所述限制性内切酶可为限制性内切酶HindIII。

所述生物素化的脱氧核糖核苷酸可为Bio-16-dCTP。Bio-16-dCTP具体可为Trilink公司的产品，产品目录号为N5002。

本发明还保护一种含有转座酶的试剂盒；该试剂盒可用于构建Hi-C高通量测序文库。所述转座酶可为所述Tagment DNA Enzyme。

实验表明，采用本发明提供的方法构建的Hi-C高通量测序文库的结果稳定可靠，而且数据质量更高(可用连接片段数均较多，酶切片段中可用连接片段数较多等等)，更易标准化，步骤更少(本发明所提供的方法构建Hi-C高通量测序文库只需经过转座反应即可进行PCR鉴定，而常规方法构建Hi-C高通量测序文库需经过末端补平、加“A”和连接接头等步骤才可进行PCR鉴定)，时间更短(采用常规方法构建Hi-C高通量测序文库的时间为1-2d，采用本发明所提供的方法构建Hi-C高通量测序文库的时间约3h)，更节约资源(采用常规方法构建Hi-C高通量测序文库的步骤较多，因此DNA样品损失也较多)。因此，本发明所提供构建Hi-C高通量测序文库的方法具有重要的应用价值。

附图说明

图1为DNA测序溶液甲中可用连接和冗余的片段数和比例。

图2为DNA测序溶液甲中基于酶切片段的比对统计情况。

图3为DNA测序溶液甲中片段比对后的统计情况。

图4为DNA测序溶液甲的分辨率。

图5为DNA测序溶液乙中可用连接和冗余的片段数和比例。

图6为DNA测序溶液乙中基于酶切片段的比对统计情况。

图7为DNA测序溶液乙中片段比对后的统计情况。

图8为DNA测序溶液乙的分辨率。

图9为DNA测序溶液丙中可用连接和冗余的片段数和比例。

图10为DNA测序溶液丙中基于酶切片段的比对统计情况。

图11为DNA测序溶液丙中片段比对后的统计情况。

图12为DNA测序溶液丙的分辨率。

图13为DNA测序溶液甲与DNA测序溶液丙的染色质覆盖度一致性分析。

图14为DNA测序溶液乙与DNA测序溶液丙的染色质覆盖度一致性分析。

图15为DNA测序溶液甲与DNA测序溶液乙的染色质覆盖度一致性分析。

图16为DNA测序溶液甲与DNA测序溶液丙的相互作用一致性分析。

图17为DNA测序溶液乙与DNA测序溶液丙的相互作用一致性分析。

图18为DNA测序溶液甲与DNA测序溶液乙的相互作用一致性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

DSM88培养基：将(NH4)₂SO₄ 1.300g、KH₂PO₄ 0.280g、MgSO₄·7H₂O 0.250g、FeCl₃·6H₂O 0.020g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.025mg、CaCl₂·2H₂O 0.070g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.025mg、FeCl₃0.280mg、CuSO₄ 0.016mg、MnSO₄·H₂O 2.200mg、H₃BO₃ 0.500mg、ZnSO₄·7H₂O0.500mg、CoCl₂·6H₂O 0.046mg、CaSO₄·H₂O 60.000mg、Tryptone 1.000g和Yeast extract 1.000g溶于1L蒸馏水，pH值调至3.5；121℃灭菌15min。

冰岛硫化叶菌REY15A记载于如下文献中：Li Guo.，et al.Genome Analyses of Icelandic Strains of Sulfolobus islandicus，Model Organisms for Genetic and Virus-Host Interaction Studies.JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Apr.2011，p.1672-1680.(文献中冰岛硫化叶菌REY15A的名称为S.islandicus strains REY15A)。公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所(即申请人处)获得，以重复本实验。

pH7.4、1×PBS缓冲液的制备方法为：向800mL去离子水中加入0.27g磷酸二氢钾、1.42g磷酸氢二钠、8.00g氯化钠和0.20g氯化钾，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调节pH值至7.4，最后加入去离子水定容至1L。

限制性内切酶HindIII为NEB公司的产品。10×NEB2.1buffer、2×快速连接酶buffer和DNA快速连接酶均为NEB公司的产品，产品目录号分别为B7202S、B6058S和M2200S。10×T4DNA连接酶buffer、T4DNA连接酶和RNase A均为Thermo Fisher Scientific的产品。MyOne^TM Streptavidin C1为Thermo Fisher公司的产品，产品目录号为65001。QIAGEN PCR纯化试剂盒、QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒和QIAGEN MinElute胶回收试剂盒均为QIAGEN公司的产品，产品目录号分别为28104、28004和28604。Ready-Lyse^TMLysozyme为Epicentre公司的产品，产品目录号为R1804M。6×loading buffer为TransGen公司的产品，产品目录号为GH101-01。测序仪为Illumina公司的产品，产品型号为HiSeq X Ten。2×Tagment DNA buffer和Tagment DNA Enzyme均为Nextra DNA prep kits中的组件；Nextra DNA prep kits为Illumina公司的产品，产品目录号为FC-121-1030。2×KAPA HiFi hotstart mix为KAPABIOSYSTEMS公司的产品，产品目录号为KK2601。DNA聚合酶I(Klenow大片段)的商品名称为“DNA Polymerase I,Large(Klenow)Fragment”，具体为NEB公司的产品，产品目录号为M0210L。T4DNA聚合酶的商品名称为T4DNA Polymerase，具体为NEB公司的产品，产品目录号为M0203L。Klenow片段(3’→5’exo-)的商品名称为Klenow Fragment(3’→5’exo-)，具体为NEB公司的产品，产品目录号为M0212L。Bio-16-dCTP为Trilink公司的产品，产品目录号为N5002。

1×B&W buffer为含2M NaCl和0.5mM EDTA的pH7.5、5mM Tris-HCl缓冲液。2×B&W buffer为含4M NaCl和1mM EDTA的pH7.5、10mM Tris-HCl缓冲液。终止反应缓冲液：含0.2％(0.2mg/mL)SDS和1mM EDTA的pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液。

实施例1、冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库的两种构建方法的比较

一、采用本发明提供的方法构建冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库

1、甲醛交联

(1)取冰岛硫化叶菌REY15A的菌液，接种(接种量为1％(v/v))至DSM88培养基，得到初始菌液(体积为50mL)；初始菌液中，冰岛硫化叶菌REY15A的浓度为1.0×10⁵cfu/mL。

(2)取步骤(1)得到的初始菌液，78℃、220rpm振荡培养6h，得到OD_600nm值为0.4-0.6的培养菌液。

(3)向步骤(2)得到的培养菌液中加入1.39mL 37％(v/v)甲醛水溶液，得到混合溶液甲(混合溶液甲中甲醛的浓度为1％(v/v))；然后置于78℃，静置10min，得到交联体系。

(4)向步骤(3)得到的交联体系中加入3.2mL浓度为2M的甘氨酸水溶液，得到混合溶液乙(混合溶液乙中甘氨酸的浓度为0.125M)；然后室温静置5min，得到终止体系。

(5)取步骤(4)得到的终止体系，室温、2500g离心10min，收集菌体并转移至康宁管(规格为15mL)。

(6)向完成步骤(5)后的康宁管中加入10mL pH7.4、1×PBS缓冲液，轻轻吹吸混匀，室温、2500g离心10min，弃上清。

(7)向完成步骤(6)后的康宁管中加入10mL pH7.4、1×PBS缓冲液，轻轻吹吸混匀，室温、2500g离心10min，弃上清。

(8)向完成步骤(7)后的康宁管中加入1mL pH7.4、1×PBS缓冲液进行重悬，得到重悬液。采用Bio-RAD细胞计数仪对重悬液中的细胞进行计数。

2、裂解

(1)取100μL步骤1中(8)得到的重悬液(含1×10⁹个细胞)，室温，2500rpm离心去上清后，再用100μL的1×TE缓冲液(含1mM EDTA的pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液)溶解，得到待裂解菌体。

(2)向步骤(1)得到的待裂解菌体中加入1μL浓度为2000U/μL的Ready-Lyse^TMLysozyme，然后室温裂解15min，得到裂解体系甲。

(3)向裂解体系甲中加入2.5μL 20％(20g/100mL)SDS水溶液，得到裂解体系乙(裂解体系乙中，SDS的浓度为0.5％(0.5g/100mL))；然后室温裂解10min，得到裂解体系丙。

(4)取裂解体系丙，室温、2500g离心10min，收集沉淀。

3、酶切

(1)制备酶切体系。1mL酶切体系由步骤2中(4)收集的沉淀、100μL浓度为10％(10g/100mL)TX-100水溶液、100μL 10×NEB2.1buffer、40μL浓度为20000U/mL的限制性内切酶HindIII溶液和760μL ddH₂O组成。

(2)完成步骤(1)后，取所述酶切体系，37℃、50rpm/min反应5h。

(3)取完成步骤(2)后的酶切体系，室温、2500g离心10min，收集沉淀。

4、Bio-DNA的获得

(1)制备反应体系。240μL反应体系由步骤3中(3)收集的沉淀、1.44μL浓度为10mM的dATP水溶液、1.44μL浓度为10mM的dGTP水溶液、1.44μL浓度为10mM的dTTP水溶液、2.88μL浓度为5mM的Bio-16-dCTP、24μL 10×NEB2.1buffer、8μL浓度为5000U/mL的DNA聚合酶I(Klenow大片段)溶液和200.8μL ddH₂O组成。

(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系，37℃、50rpm/min反应1.5h。

(3)向完成步骤(2)后的体系中加入6μL 20％(20g/100mL)SDS水溶液，得到终止体系(终止体系中，SDS的浓度为0.5％(0.5g/100mL))；然后室温静置10min，获得Bio-DNA。

5、连接

(1)制备连接体系。2.4mL连接体系由240μL浓度为10％(10g/100mL)TX-100水溶液、240μL 10×T4DNA连接酶buffer、240μL步骤4中(3)获得的Bio-DNA、12μL浓度为10mg/mL的BSA水溶液、80μL浓度为5weiss U/μL的T4DNA连接酶溶液和1588μL ddH₂O组成。

(2)完成步骤(1)后，取所述连接体系，16℃静置反应8h。

(3)向完成步骤(2)后的体系中加入48μL浓度为10mg/mL的RNase A溶液，得到RNA处理体系(RNA处理体系中，RNase A的浓度为200μg/mL)；然后37℃处理45min。

6、解交联

向完成步骤5的体系中加入24μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K水溶液，得到解交联体系(解交联体系中，蛋白酶K的浓度为200μg/mL)；然后65℃反应10h。

7、DNA纯化

(1)向完成步骤6的体系中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为：25:24:1)，上下颠倒混匀，室温、5000g离心10min，得到上层水相甲和下层有机相甲。

(2)完成步骤(1)后，取一新的EP管，加入上层水相甲和等体积的氯仿，上下颠倒混匀，室温、5000g离心10min，得到上层水相乙和下层有机相乙。

(3)完成步骤(2)后，另取一新的EP管，加入10体积份的上层水相乙、1体积份的NaAc水溶液(pH值为5.2)和12体积份的异戊醇，上下颠倒混匀，然后-80℃沉降1h。

(4)完成步骤(3)后，取所述EP管，4℃、12000g离心20min，弃上清，向沉淀中加入500μL的75％(v/v)乙醇水溶液，上下颠倒混匀；然后4℃、12000g离心5min，弃上清，将沉淀在室温下晾干，然后加入95μL的ddH₂O，得到DNA溶液。

(5)制备去除单片段体系。120μL去除单片段体系由95μL DNA溶液、12μL10×NEB2.1buffer、1μL浓度为10mg/mL的BSA水溶液、1μL浓度为10mM的dGTP水溶液、1μL浓度为10mM的dATP水溶液、3μL浓度为3000U/mL的T4DNA聚合酶和7μL ddH₂O组成。

(6)完成步骤(5)后，取所述去除单片段体系，12℃反应2h。

(7)取完成步骤(6)后的体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用60μL ddH₂O洗脱，得到Bio-Hi-C DNA溶液。

8、超声处理液

(1)取40μL步骤7中(7)得到的Bio-Hi-C DNA溶液，加入560μL ddH₂O，得到稀释液；将所述稀释液置于冰上，然后超声。超声的具体参数为：超声频率35％；超声1s，停1s，超声总时间为200s。

(2)取完成步骤(1)后的体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用40μL ddH₂O进行洗脱，得到超声处理液。

9、Bio-Hi-C DNA的富集

(1)取20μLMyOne^TM Streptavidin C1，置于磁力架上1-2min，弃beads储液。

(2)完成步骤(1)后，取beads，用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗三次，然后弃上清。

(3)完成步骤(2)后，取所述beads，用100μL 1×B&W buffer清洗一次。

(4)完成步骤(3)后，向所述beads中加入20μL步骤7中(7)得到的Bio-Hi-C DNA溶液和20μL 2×B&W buffer，混匀，然后置于混匀仪上，室温反应15min；弃上清。

(5)完成步骤(4)后，取所述beads，先用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗一次；再用100μL 1×B&W buffer清洗一次；最后用预冷pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液清洗一次。

10、转座反应

(1)制备转座反应体系。25μL转座反应体系由完成步骤9中(5)的所述beads、12.5μL 2×Tagment DNA buffer、1μL Tagment DNA Enzyme和11.5μL ddH₂O组成。

(2)完成步骤(1)后，取所述转座反应体系，置于混匀仪上，37℃反应3min。

(3)完成步骤(2)后，弃上清，然后加入100μL终止反应缓冲液，反应2min。

(4)完成步骤(3)后，弃上清，然后加入预冷pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液清洗两次，将所述beads转移至新的EP管中，加入10μL ddH₂O进行溶解，液相即为模板溶液。

11、PCR鉴定

(1)制备PCR扩增反应体系甲。38μL PCR扩增反应体系甲由25μL 2×KAPA HiFi hotstart mix和13μL ddH₂O组成。

(2)完成步骤(1)后，取所述PCR扩增反应体系甲，98℃处理45s。

(3)制备PCR扩增反应体系乙。50μL PCR扩增反应体系乙由38μL完成步骤(2)的体系、1μL浓度为25μM的Nextra Primer 1.0(核苷酸序列为：5’

-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-3’)、1μL浓度为25μM的Nextra Primer 2.1(核苷酸序列为：5’

-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’)和10μL步骤10中(4)得到的模板溶液组成。

(4)完成步骤(3)后，取所述PCR扩增反应体系乙，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应程序为：72℃延伸5min；98℃变性30s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃延伸1min。

(5)完成步骤(4)后，取所述PCR扩增产物，采用QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用20μL ddH₂O进行洗脱，得到洗脱液。

(6)完成步骤(5)后，向20μL洗脱液中加入4μL 6×loading buffer，混匀，进行2％琼脂糖凝胶电泳(电压设置为100V，电泳时间为60min)。

(7)完成步骤(6)后，在紫外灯下切割条带大小为200-500bp的胶块，然后采用QIAGEN MinElute胶回收试剂盒进行回收，并用10μL ddH₂O进行洗脱，得到DNA测序溶液甲。

步骤(4)获得PCR扩增产物即为采用本发明提供的方法构建的冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库。

12、高通量测序

采用测序仪对步骤11中(7)得到的DNA测序溶液甲进行高通量测序，然后利用软件对Hi-C数据进行分析。

按照上述步骤9至11的方法，将步骤9中(4)的“步骤7中(7)得到的Bio-Hi-C DNA溶液”替换为“步骤8中(2)得到的超声处理液”，将步骤11中(3)的“Nextra Primer 2.1”替换为“Nextra Primer 2.2(核苷酸序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’)”，其它步骤均不变，得到DNA测序溶液乙；采用测序仪DNA测序溶液乙进行高通量测序，然后利用软件对Hi-C数据进行分析。

二、采用常规方法构建冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库

1、同步骤一中1。

2、同步骤一中2。

3、同步骤一中3。

4、同步骤一中4。

5、同步骤一中5。

6、同步骤一中6。

7、同步骤一中7。

8、同步骤一中8。

9、末端补平

(1)制备末端补平体系。50μL末端补平体系由10μL(约100ng)步骤8得到的超声处理液、5μL 10×T4DNA连接酶buffer、0.5μL浓度为10mM的dATP、0.5μL浓度为10mM的dTTP、0.5μL浓度为10mM的dCTP、0.5μL浓度为10mM的dGTP、1μL浓度为5weiss U/μL的T4DNA聚合酶、1μL浓度为1U/μL的DNA聚合酶I(Klenow大片段)稀释液、1μL浓度为10U/μL的T4多聚核苷酸激酶和30μL ddH₂O组成。

DNA聚合酶I(Klenow大片段)稀释液为用无菌水将DNA聚合酶I(Klenow大片段)稀释至5倍体积得到的。

(2)完成步骤(1)后，取末端补平体系，20℃反应30min。

(3)取完成步骤(2)后的末端补平体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用34μL ddH₂O进行洗脱，得到末端补平溶液。

10、加“A”反应

(1)制备加“A”体系。50μL加“A”体系由34μL末端补平溶液、5μL10×NEB2.1buffer、10μL浓度为1mM的dATP和1μL浓度为5U/μL的Klenow片段(3’→5’exo-)组成。

(2)完成步骤(1)后，取加“A”体系，37℃反应30min。

(3)取完成步骤(2)后的加“A”体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用9μL ddH₂O进行洗脱，得到末端加“A”溶液。

11、连接接头

(1)制备接头反应体系。25μL接头反应体系由9μL末端加“A”溶液、12.5μL2×快速连接酶buffer、1μL adaptor混合物稀释液和2.5μL DNA快速连接酶组成。

adaptor混合物稀释液为用水将adaptor混合物稀释至20倍体积得到的。adaptor混合物为引物Top adapter：5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3’和引物Bottom adapter：5′-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG-3’组成的混合物。adaptor混合物中，引物Top adapter和引物Bottom adapter的浓度均为25μM。引物Top adapter和引物Bottom adapter均由Invitrogen公司合成。

(2)完成步骤(1)后，取接头反应体系，22℃反应15min。

(3)取完成步骤(2)后的接头反应体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用10μL ddH₂O进行洗脱，得到洗脱液。

(4)完成步骤(3)后，向10μL洗脱液中加入4μL 6×loading buffer，混匀，进行2％琼脂糖凝胶电泳(电压设置为100V，电泳时间为60min)。

(5)完成步骤(4)后，在紫外灯下切割条带大小为200-500bp的胶块，然后采用QIAGEN MinElute胶回收试剂盒进行回收，并用20μL ddH₂O进行洗脱，得到末端连接接头溶液。

12、Bio-Hi-C DNA的富集

(1)取20μLMyOne^TM Streptavidin C1，置于磁力架上1-2min，弃beads储液。

(2)完成步骤(1)后，取beads，用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗三次，然后弃上清。

(3)完成步骤(2)后，取所述beads，用100μL 1×B&W buffer清洗一次。

(4)完成步骤(3)后，向所述beads中加入20μL末端连接接头溶液和20μL2×B&W buffer，混匀，然后置于混匀仪上，室温反应15min；弃上清。

(5)完成步骤(4)后，取所述beads，先用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗一次，再用100μL 1×B&W buffer清洗一次，最后用预冷pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液清洗一次。

(6)完成步骤(5)后，将所述beads转移至新的EP管中，加入10μL ddH₂O进行溶解，液相即为模板溶液。

13、PCR鉴定

(1)制备PCR扩增反应体系。50μL PCR扩增反应体系由25μL 2×KAPA HiFi hotstart mix、1μL浓度为25μM的Illumina Primer 1.0(核苷酸序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)、1μL浓度为25μM的Illumina Primer Index 12(核苷酸序列为：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’)、10μL步骤12中(6)得到的模板溶液和13μL ddH₂O组成。

(2)完成步骤(1)后，取所述PCR扩增反应体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应程序为：98℃变性2min45s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃延伸5min。

(3)完成步骤(2)后，取所述PCR扩增产物，采用QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用20μL ddH₂O进行洗脱，得到洗脱液。

(4)完成步骤(3)后，向20μL洗脱液中加入4μL 6×loading buffer，混匀，进行2％琼脂糖凝胶电泳(电压设置为100V，电泳时间为60min)。

(5)完成步骤(4)后，在紫外灯下切割条带大小为200-500bp的胶块，然后采用QIAGEN MinElute胶回收试剂盒进行回收，并用10μL ddH₂O进行洗脱，得到DNA测序溶液丙。

步骤(2)获得PCR扩增产物即为采用常规方法构建的冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库。

14、高通量测序

采用测序仪对步骤13中(5)得到的DNA测序溶液丙进行高通量测序，然后利用软件对Hi-C数据进行分析。

DNA测序溶液甲、DNA测序溶液乙和DNA测序溶液丙的Hi-C数据分析结果见图1至图18。结果表明，与DNA测序溶液丙的Hi-C数据相比，DNA测序溶液甲和DNA测序溶液乙的可用连接片段数均较多(即冗余片段数较少)，酶切片段中可用连接片段数均较多(即不可用连接片段数较少)；“DNA测序溶液甲与DNA测序溶液乙”的染色质覆盖度一致性和相互作用一致性均高于“DNA测序溶液甲与DNA测序溶液丙”和“DNA测序溶液乙与DNA测序溶液丙”。

上述结果表明，采用本发明提供的方法构建Hi-C高通量测序文库的结果稳定可靠，而且数据质量更高，更易标准化，步骤更少(本发明所提供的方法构建Hi-C高通量测序文库只需经过转座反应即可进行PCR鉴定，而常规方法构建Hi-C高通量测序文库需经过末端补平、加“A”和连接接头等步骤才可进行PCR鉴定)，时间更短(采用常规方法构建Hi-C高通量测序文库的时间为1-2d，采用本发明所提供的方法构建Hi-C高通量测序文库的时间约3h)，更节约资源(采用常规方法构建Hi-C高通量测序文库的步骤较多，因此DNA样品损失也较多)。