一种酸性高比活木聚糖酶XYN11A及其基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性木聚糖酶XYN11A及其基因和应用。

背景技术：

纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分。半纤维素包括木聚糖，甘露聚糖，半乳聚糖等等，完全降解半纤维素举要多种酶的协同作用，其中木聚糖酶是一种切割β-1,4-糖苷键的主要酶类，在食品，饲料和纸浆工业等方面有广阔的应用前景。

在啤酒酿造过程中，麦芽中的木聚糖造成啤酒过滤困难、堵塞过滤膜，增加了啤酒的生产成本和品质，采用酸性木聚糖酶和木聚糖酶协同作用，可以解决以上问题。在饲料制粒时，热稳定性优良的木聚糖酶可以较少的损失酶活，并在进食过程中辅助消化提高营养。而在纸浆漂白时，木聚糖酶可以替代部分有机氯化物，从而减少环境污染。

由于不同工业对木聚糖酶性质需求不同，因此，获得新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能高效应用的酸性木聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述酸性木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述酸性木聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述酸性木聚糖酶的应用。

本发明从青霉Penicillium sp.L1中分离得到一种新的酸性木聚糖酶XYN11A。

本发明提供了一种酸性木聚糖酶XYN11A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：

MSLFKSLFVVSAAILGANALPGDYHKRQTITSSETGTSNGYYYSFWTNGGGTVDYTNGDGGEYSVSWEDCGDFTSGKGWATGSDRDITFSGSFNPSGNAYLSVYGWTTSPLVEYYILENYGDYNPGSSMTYKGTVTSDGSVYEIYEHQQVDQPSVSGTATFNQYWSIRQDTRSSGTVTTANHFDAWASLGMDLGTTFNYQIVSTEGYESSGSSTITVS其中，该酶基因编码218个氨基酸，N端19个氨基酸为其的信号肽序列“MSLFKSLFVVSAAILGANA”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的酸性木聚糖酶Xyn11A的理论分子量为21.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

LPGDYHKRQTITSSETGTSNGYYYSFWTNGGGTVDYTNGDGGEYSVSWEDCGDFTSGKGWATGSDRDITFSGSFNPSGNAYLSVYGWTTSPLVEYYILENYGDYNPGSSMTYKGTVTSDGSVYEIYEHQQVDQPSVSGTATFNQYWSIRQDTRSSGTVTTANHFDAWASLGMDLGTTFNYQIVSTEGYESSGSSTITVS

本发明的木聚糖酶Xyn11A同时具有好的pH稳定性，并且常温下在pH2.0-5.0酸性范围内均具有高活性，其最适pH值为3.5，在pH1.5～8.0的范围内维持稳定；最适温度为50℃。

本发明提供了编码上述酸性木聚糖酶XYN11A。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

ATGTCCCTTTTCAAGAGCTTATTCGTGGTTTCTGCTGCCATCCTAGGGGCCAATGCGCTTCCTGGTGATTACCACAAGCGGCAAACTATCACCTCTAGCGAAACCGGGACGAGCAATGGCTACTATTATTCGTTCTGGACCAACGGGGGTGGCACAGTGGATTATACAAACGGCGATGGAGGTGAATACAGCGTCAGCTGGGAAGACTGTGGTGATTTCACATCCGGAAAAGGCTGGGCAACTGGAAGTGACCGGGATATCACCTTTTCCGGGTCTTTCAATCCTTCTGGAAACGCCTATCTTTCCGTCTACGGCTGGACTACGAGCCCACTCGTTGAGTACTATATCCTCGAGAATTATGGCGATTATAACCCTGGCAGCTCGATGACGTACAAGGGAACGGTGACCAGCGACGGATCTGTCTATGAGATCTACGAGCACCAGCAGGTTGATCAGCCCTCTGTGTCTGGCACTGCTACTTTCAACCAATACTGGTCCATTCGACAGGATACCCGCTCAAGCGGTACCGTGACCACTGCTAATCATTTCGATGCTTGGGCTTCCCTTGGAATGGATCTAGGAACCACCTTCAACTATCAGATAGTATCTACTGAGGGATATGAGAGCAGTGGATCCTCAACAATCACAGTTTCATGA

本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xyn11A，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYN11A结构基因xyn11A全长657bp。其中，信号肽的碱基序列为：

ATGTCCCTTTTCAAGAGCTTATTCGTGGTTTCTGCTGCCATCCTAGGGGCCAATGCG(SEQ ID NO.6)。

成熟的木聚糖酶XYN11A的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5

CTTCCTGGTGATTACCACAAGCGGCAAACTATCACCTCTAGCGAAACCGGGACGAGCAATGGCTACTATTATTCGTTCTGGACCAACGGGGGTGGCACAGTGGATTATACAAACGGCGATGGAGGTGAATACAGCGTCAGCTGGGAAGACTGTGGTGATTTCACATCCGGAAAAGGCTGGGCAACTGGAAGTGACCGGGATATCACCTTTTCCGGGTCTTTCAATCCTTCTGGAAACGCCTATCTTTCCGTCTACGGCTGGACTACGAGCCCACTCGTTGAGTACTATATCCTCGAGAATTATGGCGATTATAACCCTGGCAGCTCGATGACGTACAAGGGAACGGTGACCAGCGACGGATCTGTCTATGAGATCTACGAGCACCAGCAGGTTGATCAGCCCTCTGTGTCTGGCACTGCTACTTTCAACCAATACTGGTCCATTCGACAGGATACCCGCTCAAGCGGTACCGTGACCACTGCTAATCATTTCGATGCTTGGGCTTCCCTTGGAATGGATCTAGGAACCACCTTCAACTATCAGATAGTATCTACTGAGGGATATGAGAGCAGTGGATCCTCAACAATCACAGTTTCATGA

成熟蛋白理论分子量为21.7kDa，本发明的木聚糖酶与来源于Penicillium sp.40的木聚糖酶(xylanase A)的性质有很大的差异，与Penicillium sp.40来源的的木聚糖酶xylanase A相比较，本发明的木聚糖酶XYN11A有更好的pH稳定性和热稳定性，且其比活性是xylanase A的5倍，XYN11A更适于在饲料、食品等领域应用，且成本低廉。

本发明还提供了包含上述酸性木聚糖酶基因XYN11A的重组载体，优选为pPIC-xyn11A。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn11A。

本发明还提供了包含上述酸性木聚糖酶基因xyn11A的重组菌株，优选所述菌株为酵母菌，优选为重组菌株GS115/xyn11A。

本发明还提供了一种制备酸性木聚糖酶XYN11A的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN11A。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xyn11A。

本发明还提供了上述酸性木聚糖酶XYN11A的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH为3.5，在pH2.0～5.0都有较高的酶活性；pH稳定性好；并且具有较高木聚糖酶活性。本发明的木聚糖酶可应用于饲料工业，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。该酶还可以在木质纤维材料降解中，辅助纤维素酶进行进一步地降解。因此，本木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组木聚糖酶的最适pH。

图2重组木聚糖酶的pH稳定性。

图3重组木聚糖酶的最适温度。

图4重组木聚糖酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从青霉Penicillium sp.L1中分离得到一种新的酸性木聚糖酶Xyn11A。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。榉木木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)青霉Penicillium sp.L1培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1青霉Penicillium sp.L1木聚糖酶编码基因XYN11A的克隆

提取青霉Penicillium sp.L1基因组DNA。

设计引物P1和P2进行PCR扩增，

P1:CGGAATTCCTTCCTGGTGATTACCACAAGCGG

P2:ATTTGCGGCCGCTCATGAAACTGTGATTGTTGAGGATCCAC

回收、测序获得序列如SEQ ID NO.4所示的酸性木聚糖酶XYN11A。

实施例2重组木聚糖酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码木聚糖酶的基因xyn11A双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有青霉Penicillium sp.L1木聚糖酶基因xyn11A的重组质粒pPIC-xyn11A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn11A。

以同样的方法构建含有信号肽序列的木聚糖酶基因的重组表达载体，并转化毕赤酵母菌株。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为809.9U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组木聚糖的比活为4286U/mg。

实施例4重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH3.5，50℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖所需要的酶量。

1、重组木聚糖酶XYN11A的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶XYN11A的最适pH为3.5，在pH2.0～5.0有60％以上的相对酶活性。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH3.5缓冲液体系中50℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明木聚糖酶在pH 1.5-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80％左右，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。虽然与来源于Penicilliumsp.40的木聚糖酶(xylanase A)氨基酸序列一致性为86％，但是两者的最适pH值不同，xylanase A为2.0，而XYN11A为3.5，XYN11A有更宽的pH作用范围，XYN11ApH稳定性优于xylanase A。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在pH3.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在50℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为50℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，XYN11A有良好的热稳定性，在40℃下温育1h，能保持90％以上的酶活。在热稳定性方面，XYN11A也显著优于xylanase A的30℃稳定。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH3.5)缓冲液体系中，50℃下测定酶活性，计算出其K_m值。经测定，以木聚糖为底物时的K_m值为3.3mg/mL，最大反应速度V_max为6000μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYN11A酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在50℃、pH4.0条件下测定酶活性。结果表明，部分离子和化学试剂在浓度为5mmol时重组木聚糖酶的活力没有明显变化。但是Fe³⁺可以抑制其将近一半活力，而Pb²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺可以抑制近20％的活性，而SDS可强烈抑制其活力仅剩余30％。而Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、EDTA、K⁺可以部分激活XYN11A酶活力。

5、重组木聚糖酶的底物特异性

该酶可高效降解榉木木聚糖，燕麦木聚糖，桦木木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖。

<110> 北京盛拓达生物技术有限公司

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