本发明涉及一种合成1-苯基乙醇的生物学方法，属于香精香料领域。
背景技术：
：除了趋避植食性昆虫，吸引天敌和传粉昆虫，植物间信号传导之外，植物香气还有着潜在的经济利用价值，例如延长食品贮藏时间，提高食物的风味，镇静，提高记忆力等。越来越多的研究表明植物香气对人类的健康有贡献，同时某些植物香气为新药的开发提供了线索。基于以上的功能，植物香气的合成和纯化受到越来越多的关注。传统的从植物中提取香气物质的方法耗时长，花费大并且得率低。因此，开发新的、安全高效的植物香气合成方法势在必行。1-苯基乙醇是香水工业的原料，同时也是某些药物合成的中间体。在茶树花中，1-苯基乙醇是主要的香气物质。目前茶树多采取无性繁殖。和具有高附加值的茶叶相比而言，茶树花是一种“废弃”资源。从茶树花中直接提取1-苯基乙醇也存在着耗时长，花费大并且产量低的劣势。我们发现茶树花中含有某些酶能够高效的将苯乙酮转化为1-苯基乙醇。利用植物来源的酶合成植物香气具有高效、环保、合成迅速等优点。苯乙酮是一种价格非常低廉的工业原料。建立利用茶树花酶将苯乙酮转化为1-苯基乙醇的方法能够实现1-苯基乙醇的经济、高效、绿色合成。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用茶树花的酶合成1-苯基乙醇的方法，利用该方法可以实现1-苯基乙醇的高效、安全、绿色合成。一种利用茶树花的酶合成1-苯基乙醇的方法，包括以下步骤：（1）1-苯基乙醇合成酶粗酶的制备：将聚乙烯吡咯烷酮和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐加入茶树花中；用pH值为7的磷酸钾缓冲液在冰上充分匀浆，缓冲液中同时含有1%的甘油，1mMEDTA；匀浆产物在4℃下离心15-20分钟；离心之后的上清液通过PD-10脱盐柱将目的蛋白用含有0.1%甘油、0.1mMEDTA的磷酸钾缓冲液洗脱，缓冲液的浓度为10mM,pH值为7，得到1-苯基乙醇合成酶粗酶；（2）1-苯基乙醇的合成：底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇；反应所使用的缓冲液为100mM磷酸钾缓冲液；反应液中包含1.25mM的苯乙酮，3.75mM的辅酶NADPH和0.1μg/μl的酶。在上述方法中，作为优选的：步骤（2）的反应温度为55℃，合成pH为4.5-5.3，反应时间为100分钟。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.1-苯基乙醇合成酶为植物来源，安全环保；2.1-苯基乙醇合成酶粗酶的提取方法简单；3.本合成方法的转化效率高，绿色无污染；4.本合成方法实现了废弃资源的合理利用，提高了茶树花的产业附加值。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：（1）1-苯基乙醇合成酶粗酶的制备将0.3克聚乙烯吡咯烷酮和20毫克3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐加入1克茶树花中。此混合物用10毫升pH值为7的100mM磷酸钾缓冲液在冰上充分匀浆。缓冲液中同时含有1%的甘油，1mM乙二胺四乙酸。匀浆产物在4℃，26740离心力的条件下离心15-20分钟。离心之后的上清液通过PD-10脱盐柱将目的蛋白用含有0.1%甘油，0.1mMEDTA的磷酸钾缓冲液洗脱。缓冲液的浓度为10mM,pH值为7。此方法制备的蛋白为1-苯基乙醇合成酶粗酶。（2）1-苯基乙醇的合成底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇。反应所使用的缓冲液为100mM磷酸钾缓冲液。反应液中包含1.25mM的苯乙酮，3.75mM的辅酶NADPH和0.1μg/μl的酶。反应温度为55℃，反应pH值为4.5，反应时间为100分钟。实施例2：（1）1-苯基乙醇合成酶粗酶的制备将3克聚乙烯吡咯烷酮和0.2克3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐加入10克茶树花中。此混合物用100毫升pH值为7的100mM磷酸钾缓冲液在冰上充分匀浆。缓冲液中同时含有1%的甘油，1mM乙二胺四乙酸EDTA。匀浆产物在4℃，26740离心力的条件下离心15-20分钟。离心之后的上清液通过PD-10脱盐柱将目的蛋白用含有0.1%甘油，0.1mMEDTA的磷酸钾缓冲液洗脱。缓冲液的浓度为10mM,pH值为7。此方法制备的蛋白为1-苯基乙醇合成酶粗酶。（2）1-苯基乙醇的合成底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇。反应所使用的缓冲液为100mM磷酸钾缓冲液。反应液中包含1.25mM的苯乙酮，3.75mM的辅酶NADPH和0.1μg/μl的酶。反应温度为55℃，反应pH值为5.0，反应时间为100分钟。实施例3：（1）1-苯基乙醇合成酶粗酶的制备将1.5克聚乙烯吡咯烷酮PVPP和0.1克3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐加入5克茶树花中。此混合物用50毫升pH值为7的100mM磷酸钾缓冲液在冰上充分匀浆。缓冲液中同时含有1%的甘油，1mM乙二胺四乙酸EDTA。匀浆产物在4℃，26740离心力的条件下离心15-20分钟。离心之后的上清液通过PD-10脱盐柱将目的蛋白用含有0.1%甘油，0.1mMEDTA的磷酸钾缓冲液洗脱。缓冲液的浓度为10mM,pH值为7。此方法制备的蛋白为1-苯基乙醇合成酶粗酶。（2）1-苯基乙醇的合成底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇。反应所使用的缓冲液为100mM磷酸钾缓冲液。反应液中包含1.25mM的苯乙酮，3.75mM的辅酶NADPH和0.1μg/μl的酶。反应温度为55℃，反应pH值为5.3，反应时间为100分钟。以上三个实施例条件均能高效催化苯乙酮生成1-苯基乙醇。苯乙酮生成1-苯基乙醇的转化率约为40%。目前1-苯基乙醇的合成多采用化学合成的方法。化学合成污染大，且有反应副产物产生。通过酶催化的反应能够稳定，单一的形成特定的产物。而植物中含有大量可催化形成香气物质的酶。基于以上理论，我们首次发明了利用源自茶树花的酶高效合成1-苯基乙醇的方法。我们首先通过响应面分析初步确定了茶树花酶提取缓冲液的最佳pH值、反应pH值、反应温度、反应时间、NADPH浓度、苯乙酮浓度。接下来通过对不同反应温度，不同反应pH的筛选，最终确定了最优化的利用茶树花酶以苯乙酮为底物生成1-苯基乙醇的条件。通过对生成的1-苯基乙醇进行含量测定发现，本发明三个实施例催化苯乙酮生成1-苯基乙醇的效率均比较高。说明在本发明中利用茶树花酶合成1-苯基乙醇的方法得到了优化，合成1-苯基乙醇的反应高效稳定。此方法对环境友好，符合可持续发展的战略方针。表1.三个实施例的1-苯基乙醇相对产量比较1-苯基乙醇相对产量※实施例16.44实施例26.08实施例36.49※1-苯基乙醇的相对产量通过GC-MS进行测定，为1-苯基乙醇和内标葵酸乙酯的峰面积比值。当前第1页1 2 3