一种抗肿瘤荧光化合物、其制备方法及用途与流程

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种抗肿瘤荧光化合物、其制备方法及用途。

背景技术：

肿瘤是一种涉及到细胞生长失控的复杂疾病，已经成为当今威胁人类健康、危及生命的重大疾病之一，更成为导致死亡的主要原因之一。长期以来，肿瘤治疗都是医学界研究专注的一大课题。肿瘤通常的医疗手段是手术治疗、生物治疗、放射治疗和化学治疗，其中化学治疗是多种肿瘤的主要方式。

具有生物活性的一些天然/合成类抗生素化合物，比如紫杉醇、阿霉素等，一直是主流的肿瘤治疗药物，有的已经被广泛地使用于临床。然而，多数抗肿瘤药物也显示出严重的副作用：它们在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也有一定毒性，比如：血小板减少症和肝毒性，长期使用还会使肿瘤细胞产生耐药性等。因此，开发新的具有毒性低、特异性好的抗肿瘤药物已成为当今的有机和药物化学中的一个重要方向。

烯二炔类抗肿瘤抗生素是天然肿瘤抗生素的一类，它们具有独特的分子结构、新颖的作用机制和高效的抗肿瘤活性，是迄今为止已经发现的活性最强的抗肿瘤物质之一，具有良好的发展前景，并已经成为化学、生物和医药领域重点研究对象。许多天然烯二炔肿瘤抗生素具有很高的细胞毒性，在微摩尔浓度即可诱导肿瘤细胞的凋亡，例如Calicheamicin的半数杀伤浓度在pg/μL水平，比阿霉素强1000倍以上。目前发现的烯二炔类抗生素中Neocarzinostatin已经用于临床实践，主要治疗白血病、胃癌、胰腺癌等。这类化合物通过发生Bergman Cyclization反应可以产生双苯基自由基，与DNA直接作用夺取DNA分子链上的H原子，从而导致DNA链的断裂，从分子水平促使肿瘤细胞凋亡。然而这些烯二炔类抗肿瘤抗生素依然无法识别和区分正常细胞和肿瘤细胞，因此对正常细胞具有一定的毒副作用。

目前为止大部分烯二炔引发上述Bergman环化的条件，要么是比较高的温度加热，要么是紫外光照；即使少数烯二炔靠金属离子或者碱性条件引发，但这些条件在人体内都较难以实现。人体在正常的代谢过程中靠酸碱平衡维持细胞或组织处在一个偏中性的生理环境中；而一旦发生癌变，肿瘤细胞可以通过异常的能量代谢为自己的生存繁殖创造一个不适于正常细胞生存的酸性微环境。如果利用肿瘤细胞内的酸性微环境，来引发烯二炔的Bergman环化反应，那么烯二炔不仅能够对肿瘤细胞产生毒性，而且只在肿瘤细胞的酸性微环境下发生反应，而在正常细胞的偏中性环境下并不发生Bergman环化反应，这样就可以达到烯二炔正确的区分正常细胞和肿瘤细胞的目的，选择性的杀死肿瘤细胞而对正常细胞不造成伤害，这为设计新型高选择性的抗肿瘤烯二炔开拓了新的思路。

专利CN201410211924.6中设计和合成了含有三乙氧基基团的烯二炔，其在酸性条件下可以造成DNA链断裂并且能够导致肿瘤细胞的凋亡。但是三乙氧基基团对酸性条件比较敏感，只要是相对的酸性条件都可以引发反应，无法保证在人体内复杂的细胞微环境下适时在肿瘤细胞内发生反应产生细胞毒性；此外，该化合物因为没有荧光也无法进行标记示踪。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中抗肿瘤药物对肿瘤细胞和正常细胞不具有选择性的缺陷，提供了一种选择性的杀死肿瘤细胞的抗肿瘤荧光化合物。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种抗肿瘤荧光化合物，结构式如下所示：

本发明要解决的第二个技术问题是：克服现有技术中抗肿瘤药物对肿瘤细胞和正常细胞不具有选择性的缺陷的不足，提供了选择性的杀死肿瘤细胞的抗肿瘤荧光化合物的制备方法。

本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案是：一种抗肿瘤荧光化合物的制备方法，包括如下步骤：

将3,4-二((2-乙氧基-1,3-二氧戊环-2-基)乙炔基)-1-(呋喃-2-基甲基)-1H-吡咯-2,5-二酮溶解于溶剂中，将荧光素-5-马来酰亚胺在氮气气氛下加入反应容器中，搅拌溶解后，在40～100℃下密封反应0.5～10小时得到化合物b。

优选的，所述制备方法还包括如下步骤：

将1-(呋喃-2-基甲基)-3,4-碘-1H-吡咯-2,5-二酮，碘化亚酮，POPd 1，三苯基磷和碳酸铯依次加入到反应容器中，在氮气气氛下加入重蒸过的四氢呋喃和甲苯，搅拌溶解后，最后加入2-乙氧基-2-乙炔基-1,3-二氧戊环；将体系在氮气保护下40～80℃搅拌反应0.5～10小时，得到化合物a。

优选的，所述制备方法还包括如下后处理步骤：

停止反应后冷却至室温，用二氯甲烷和饱和氯化钠溶液萃取洗涤，收集有机层用无水硫酸镁干燥，过滤后将滤液真空浓缩，得到化合物b。

优选的，由a为原料制备b的反应中所述溶剂为无水DMF。

本发明要解决的第三个技术问题是：克服现有技术中抗肿瘤药物对肿瘤细胞和正常细胞不具有选择性的缺陷的不足，提供了选择性的杀死肿瘤细胞的抗肿瘤荧光化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明解决第三个技术问题所采用的技术方案是：化合物b在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果是，本发明提供的抗肿瘤荧光烯二炔化合物带有荧光基团，能够进行荧光标记示踪；且该化合物能够专属性的在肿瘤细胞的酸性条件下发生Bergman环化反应，从细胞实验结果可以看到，实现了对肿瘤细胞和正常细胞的高度选择性。

附图说明

图1—化合物b在不同pH下对DNA的链裂解。

图2—化合物b在不同浓度、不同时间下对A549肿瘤细胞的细胞毒性。

图3—化合物b在不同浓度、不同时间下对L-02正常细胞的细胞毒性。

图4—化合物b在不同浓度下对A549肿瘤细胞和L-02正常细胞的细胞毒性对比图。

图5—化合物b与细胞混合后的激光共聚焦显微镜成像。

具体实施方式

实施例1化合物e的合成

分别称量丁二酸(0.1g，0.87mmol)、乙二醇(2.75g，44.2mmol)和3,3,3-三乙氧基-1-丙炔(3.34g，19.4mmol)加入到反应瓶中，加热使之回流搅拌反应3小时，停止反应后冷却至室温，用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液萃取洗涤，收集有机层用无水硫酸镁干燥、过滤，收集滤液旋蒸，得到的产物经乙酸乙酯/石油醚＝1/10层析柱分离后得到化合物e，产物经氢谱及质谱确证。

实施例2化合物d的合成

称量二溴马来酸酐(3g，12mmol)加入到圆底烧瓶中，加入80ml乙酸，室温搅拌溶解。将2-呋喃甲胺(1.37g,14mmol)逐滴加入到烧瓶中，立即有白烟产生，室温下搅拌至白烟消失，待2-呋喃甲胺滴加完毕白烟完全消失后加入碘化钾(3.7g，22.4mmol)，将反应瓶转移至120℃的油浴中搅拌回流反应24小时。反应结束后冷却至室温，除去乙酸后用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液进行萃取，收集有机层用无水硫酸镁干燥，过滤后滤液旋蒸，得到的固体用乙酸乙酯/石油醚＝1/15经柱层析后得到化合物d，产物经氢谱及质谱确证。

实施例3化合物a的合成

将1-(呋喃-2-基甲基)-3,4-碘-1H-吡咯-2,5-二酮(0.556g，1.3mmol)，碘化亚酮(100mg，40mmol％)，POPd 1(121mg，10mmol％)，三苯基磷(68mg，20mmol％)和碳酸铯(1.3g，3.99mmol)依次加入到50ml的Schlenk瓶中，抽真空换氮气三次，在氮气下加入重蒸过的四氢呋喃(4ml)和甲苯(10ml)，搅拌溶解后，最后加入化合物e(0.74g，5.2mmol)。在氮气保护下60℃搅拌反应4小时后停止反应，将产物后经过柱层析分离(正己烷/乙酸乙酯＝5/1)，得到化合物a，化合物a的氢谱和质谱数据如下：

¹H NMR(CDCl₃，400MHz,ppm)：δ7.27(s,-O-CH＝,1H),6.33-6.32(d,-CH＝CH-,1H),6.30-6.29(d,-C＝CH-,1H),4.71(s,-N-CH₂-,2H),4.11-4.06(qq,-O-CH₂-,8H),3.75-3.70(q,CH₃-CH₂-,4H),1.33-1.26(t,-CH₂-CH₃,6H)。HRMS(ESI):m/z cald.For C₂₃H₂₃NO₉Na(M+Na)⁺:480.1271；found:480.1276。

实施例4化合物b的合成

在10ml的封口瓶中将化合物a(32mg,0.069mmol)溶解在5ml无水DMF中，抽真空换氮气三次后，称量荧光素-5-马来酰亚胺(33mg,0.072mmol)在氮气气氛下加入到封口瓶中，搅拌溶解后，将封口瓶置于80℃下密封反应8小时。停止反应后冷却至室温，用二氯甲烷和饱和氯化钠溶液萃取洗涤，收集有机层用无水硫酸镁干燥，过滤后将滤液真空浓缩，得到化合物b，化合物b的氢谱和质谱数据如下：

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz,ppm)：δ6.43-8.22(m,-Ar-H,9H),6.05(s,-CH＝CH,1H),6.17(s,-CH＝CH,1H),4.63(t,-O-CH-,1H),4.11-4.06(qq,-O-CH₂-,8H),4.02(s,-N-CH₂-,2H),3.75-3.70(q,CH₃-CH₂-,4H),2.86(d,-CH-CH-,1H),2.76(s,-CH-CH-,1H),1.33-1.26(t,-CH₂-CH₃,6H)。HRMS(ESI):m/z cald.For C₄₇H₃₆N₂O₁₆Na(M+Na)⁺:907.1963；found:907.1978。

实施例5化合物b对DNA的裂解实验

将化合物b配成50mM/L的丙酮溶液，取2μL加入到4μL的DNA TE缓冲液中，用不同浓度的对甲苯磺酸吡啶盐(1mM/L，10mM/L，100mM/L，1M/L)分别调节不同组别的pH分别在pH＝3、pH＝4、pH＝5和pH＝6左右。混合均匀后将不同组放在37℃下恒温孵育48小时后，取出溶液进行琼脂糖凝胶电泳实验。

如图1所示，实验结果表明，在pH＝6和pH＝5的组别下，DNA几乎没有变化；在pH＝4时DNA才开始发生变化，由FormⅠ形式转化为FormⅡ形式，说明DNA发生了链断裂；在pH＝3时，DNA的形态有了更明显的变化，有更多的FormⅡ形式产生，说明DNA分子链大部分发生了链断裂。

实施例6化合物b的细胞毒性实验

使用MTT方法进行细胞毒性评价：

①将处于对数生长期的A549肿瘤细胞和L-02正常细胞进行接种后放在CO₂培养箱中贴壁培养；

②将化合物b配成200mM/L的丙酮溶液，用滤膜过滤消毒后，再用细胞培养液分别稀释至100、50、25、12.5、6.25、3.1μM/L；

③取各个浓度的化合物b溶液200μL分别加入到培养中的肿瘤细胞和正常细胞孔板中，空白组实验加入200μL的0.1％丙酮；将孔板放在CO₂培养箱中培养24小时、48小时以及72小时；

④培养结束后使用MTT方法进行测定评价细胞活性。

实验结果表明，加入了化合物b的肿瘤细胞，在培养了24h后，细胞出现了明显的凋亡，随着时间的增长到48h、72h，细胞活性明显降低，说明抗肿瘤化合物b对肿瘤细胞表现出强烈的细胞毒性，如图2所示。而相反，化合物b对正常细胞的毒性明显小很多，如图3所示。

实施例7化合物b的荧光性

使用激光共聚焦显微镜观察到了化合物b进入细胞的过程，其表现出明显的黄绿色荧光。如图5所示。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。