一种猪盖他病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种猪盖他病毒毒株，还涉及由所述猪盖他病毒毒株制备的灭活疫苗组合物及其制备方法，属于猪盖他病毒毒株的分离和应用领域。
背景技术：
：盖他病毒(Getahvirus，GETV)是一种以蚊虫为主要传播媒介的虫媒病毒，在自然宿主中主要表现为无症状或高滴度病毒血症，但通过蚊虫传播给易感动物后则可引起病毒病流行。该病毒最初于1955年从马来西亚的雪背库蚊中分离获得。此后，在日本、前苏联的东部、东南亚和澳大利亚等地，从三带吻库蚊，刺忧伊蚊和猪的血液中也分离到了盖他病毒。自本病受到关注后，在欧洲、亚洲、大洋洲一些国家的猪、马、牛、山羊、犬、兔、袋鼠、鸡和部分野鸟体内都检测到盖他病毒抗体的存在，并且在部分人的血液中也检测到了盖他病毒抗体，因此被视为一种人畜共患病，但对人造成的影响暂无具体报道。该病主要侵害马和猪，可引起仔猪的发热、腹泻、精神不振、身体发抖、后肢麻痹、体表发红、死亡及妊娠母猪的流产、死产等临床症状；马感染该病毒后的主要临床表现为精神沉郁、不食、全身淋巴结肿大淤血、急性发热、后肢伴有荨麻疹和肿胀等。2014年该病在日本赛马中的暴发及危害再度引发了人们的关注，且该病的致病机理及防控措施等有待进一步研究。且本病尚无有效地治疗药物，疫苗免疫接种是预防和控制该病的根本措施。我国对盖他病毒的研究较晚，虽然已经从蚊子中分离到一些盖他病毒毒株，但迄今为止尚未从猪体内分离到该病毒，其对猪群的致病性及危害更是不得而知。本发明在我国的发病猪体内分离到一株盖他病毒，为后续的相关试验研究提供了材料、奠定了基础。此外，目前市场上的盖他病毒疫苗屈指可数，主要为日本于1979年获批的用于马的灭活疫苗、日本于1990年报道的用于猪的弱毒活疫苗、日本于1993年报道的盖他—乙脑—细小三联弱毒活疫苗及日本于1997年报道的用于马的盖他—乙脑二联灭活疫苗。但日本近两年分离到的毒株与之前的毒株相比有了一定的变异，进化树中属于不同分支，因此这些疫苗是否对新流行的盖他病毒有很好的防控作用仍不得而知。从以上疫苗可以看出，大部分盖他疫苗主要用于马，并且主要为弱毒活疫苗，存在一定的毒力返强风险，况且所用毒株至少为20年前的毒株，与近几年检测到的毒株相比存在一定的变异，并不一定对现流行的毒株有很好的保护力，因此尚缺乏一种新的安全、高效的盖他病毒灭活疫苗，尤其是猪用灭活疫苗。技术实现要素：本发明目的之一是提供一株新分离的猪盖他病毒毒株。本发明的另一目的是针对现有盖他病毒疫苗的不足，提供一种安全有效的猪用盖他病毒灭活疫苗以及该灭活疫苗的制备方法；该灭活疫苗安全性及免疫原性好，攻毒保护率强；所采用的制备方法简单安全。本发明采用的技术方案如下：本发明首先公开了一株分离的猪盖他病毒HNJZ-S1株。该猪盖他病毒HNJZ-S1株，已提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为CGMCCNO.12550；分类命名：披盖病毒科甲病毒属盖他病毒HNJZ-S1；拉丁文学名：Togaviridae，Alphavirus,SwineGethavirus(SGETV)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年6月2日。本发明采集猪流产胎儿的内脏，取1g样品，剪碎后加入约5倍体积的无菌PBS缓冲液，用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，8000r/min离心5min后取上清，按照RNAisoPlus提取试剂的说明书提取病料总RNA，并进行RT-PCR扩增。将RT-PCR检测为阳性的病料匀浆，经10000r/min离心15min后取上清，上清依次用0.45μm、0.22μm的滤膜过滤，得到滤液。取1mL滤液接种于已铺满T25培养瓶瓶底80％-90％的Marc-145细胞，37℃，5％CO2培养箱孵育1h后弃去培养液；加6mL含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养，24h即可出现细胞变圆变大的细胞病变特征，培养48h-60h后收获病毒。并在Marc-145细胞上连续传至第5代。培养过程中同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照。传代过程中，利用GETV特异性引物PF/PR，定性检测有病变的Marc-145细胞中的SGETV。将猪盖他病毒HNJZ-S1株传至第6代，并对第5代病毒进行了病毒滴度TCID50的测定，结果为107.25TCID50/mL。通过理化特性测定、电镜观察病毒的形态、分子生物学研究等方法证实分离的病毒为猪盖他病毒。将猪盖他病毒HNJZ-S1株接种至怀孕早期母鼠，母鼠出现流产、产死胎及木乃伊胎、产仔量下降等症状，表明该毒株对妊娠早期小鼠具有很强的致病性。本发明猪盖他病毒HNJZ-S1株能够用于制备预防由猪盖他病毒所致疾病的疫苗，还能够用于制备猪盖他病毒相关的诊断试剂和治疗药物。本发明还公开了一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有经灭活的猪盖他病毒HNJZ-S1株和药学上可接受的佐剂，其中，所述猪盖他病毒HNJZ-S1株的微生物保藏号为：CGMCCNO.12550。进一步地，上述疫苗组合物还包括药学上可接受的载体。本发明还公开了一种疫苗组合物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：(1)病毒培养：将猪盖他病毒HNJZ-S1株接种至Marc-145细胞进行培养，获得病毒液，其中，所述猪盖他病毒HNJZ-S1株的微生物保藏号为：CGMCCNO.12550；(2)病毒液灭活：向病毒液中加入灭活剂，将病毒灭活，得到灭活的病毒液；(3)制备水相：按w/v计，向灭活的病毒液中加入吐温-80至终浓度为4％，混合均匀，得到水相；(4)制备油相：将注射用白油和司本-80按照体积比92:6混合，得到混合液，然后，按w/v计，向混合液中加入硬脂酸铝至终浓度为2％，得到油相；(5)乳化：按体积比2:1将油相和水相进行混合并乳化，即得疫苗组合物。根据上述的疫苗组合的制备方法，其中，步骤(1)的具体过程为：用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养箱贴壁培养Marc-145细胞；待细胞生长覆盖率达到80％-90％时弃去培养液，按感染复数为0.1接种猪盖他病毒HNJZ-S1株，然后用含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养箱培养，培养48h-60h待细胞病变完全后收获病毒液。根据上述的疫苗组合的制备方法，步骤(2)中所述灭活剂为甲醛或二乙烯亚胺。根据上述的疫苗组合的制备方法，步骤(2)中所述的灭活剂为甲醛时，按体积比计，病毒液中甲醛的终浓度为0.2％；灭活条件为：37℃灭活24h，期间每隔2h振摇一次；灭活后向病毒液中加入硫代硫酸钠溶液中和甲醛，按w/v计，所加入的硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.2％。根据上述的疫苗组合的制备方法，步骤(2)中所述的灭活剂为二乙烯亚胺时，按体积比计，病毒液中二乙烯亚胺的终浓度为0.1％；灭活条件为：32℃灭活24h，期间每隔2h振摇一次；灭活后向病毒液中加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，按w/v计，所加入的硫代硫酸钠溶液的终浓度为2％。本发明的积极有益效果:(1)本发明分离的猪盖他病毒HNJZ-S1株是中国首例从自然感染发病猪群中分离得到的猪源盖他病毒，具有良好的免疫原性，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关试验研究提供了材料、奠定了基础。(2)本发明的疫苗组合物有良好的免疫原性，免疫后可产生较强免疫力，攻毒保护率强，接种后母猪流产率及死产率明显减少，仔猪发病率也显著降低；此外，与国外市场上现有的弱毒活疫苗相比安全性更好，保存、运输及使用更方便，且所用毒株为近年来刚分离到的毒株，同早期毒株相比，与近年来流行的毒株亲缘关系更近，具备了与同类产品竞争的优势，能有效地预防猪盖他病毒的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。(3)本发明疫苗组合物所采用的制备方法简单安全。附图说明图1为组织病料中SGETV的RT-PCR扩增结果，其中，泳道1-病料中SGETV的RT-PCR产物；泳道2-阴性对照；泳道M-DNAMarkerDL2000；图2为各代次Marc-145细胞培养物中SGETV的RT-PCR扩增结果，其中，泳道1-6表示各代次Marc-145细胞培养物中SGETV的RT-PCR产物；泳道7表示阴性对照；泳道M表示DNAMarkerDL2000；图3为感染SGETV的Marc-145细胞的照片(200×)，其中，A.SGETV感染的Marc-145细胞；B.正常的Marc-145细胞对照；图4为猪盖他病毒HNJZ-S1株细胞培养物透射电镜照片；图5为小鼠致病性试验图，A.攻毒组母鼠所产木乃伊胎；B.对照组母鼠所产胎儿；图6为猪盖他病毒HNJZ-S1株全基因扩增结果，泳道M表示DNAMarkerDL2000；泳道1-12表示猪盖他病毒HNJZ-S1株各片段扩增结果；图7为猪盖他病毒HNJZ-S1株与各参考株全基因组核苷酸序列相似性和同源性分析；图8猪盖他病毒HNJZ-S1株与各参考株全基因组核苷酸序列的系统进化树；图9猪群注射灭活疫苗或乳化的DMEM后各组猪平均体温随时间变化情况；图10猪群注射灭活疫苗或乳化的DMEM后各组猪抗体水平随时间的变化情况(平均HI值)。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明。本实施例中试验动物是小鼠和猪，是本发明实验室前期阶段试验动物，不对本发明最终应用有任何限制。在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明采用猪盖他病毒HNJZ-S1株制备疫苗，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12550。实施例1：猪盖他病毒HNJZ-S1株的分离鉴定和生物学特性研究1.1实验材料实验中所用的病料样本来源于河南焦作猪场流产胎儿样品，于2016年1月采集；Marc-145单克隆细胞株由本实验室冻存；雌雄昆明小鼠购自河南省实验动物中心。1.2引物设计参照GenBank中发表的GETVHB0234(EU015062)基因序列，使用Premier5设计了1对特异性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述特异性引物的核苷酸序列如下：PF：5’-AACCCACCCGTGCGCTTGT-3’(SEQIDNO.1)；PR：5’-CGCCGTTGTTGTCTGATTGAGG-3’(SEQIDNO.2)。1.3组织病料中GETVRNA的RT-PCR检测采集猪流产胎儿的内脏，取1g样品，剪碎后加入约5倍体积的无菌PBS缓冲液，用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，8000r/min离心5min后取上清，按照RNAisoPlus提取试剂的说明书提取病料总RNA；以提取的RNA为模板，进行RT-PCR扩增。反转录反应体系(20μL)：RNA模板13μL、5×buffer4μL、dNTP(10mmol/μL)1μL、随机引物random1μL(20pmol/μL)、RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL、反转录酶M-MLV(200U/μL)0.5μL。反转录反应条件：42℃1h，95℃5min。以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应体系(50μL)为：2×EsTaqMasterMix25μL、上下游引物各1μL(20pmol/μL)、cDNA模板5μL，补加灭菌双蒸水至50μL。PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃50s，60℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min。取10μLPCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测(结果见图1)。剩余匀浆-80℃保存备用。由图1可知，扩增出了一条894bp左右的条带，与预期扩增片段大小相符。1.4病毒的分离与培养将RT-PCR检测为阳性的病料匀浆，离心、无菌过滤后将滤液接种至Marc-145细胞并进行传代。具体操作为：将RT-PCR检测为阳性的病料匀浆，经10000r/min离心15min后取上清，上清依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤，得到滤液；取1mL滤液接种于已铺满T25培养瓶瓶底80％-90％的Marc-145细胞，37℃，5％CO2培养箱孵育1h后弃去培养液；然后加入6mL含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养，培养24h即可出现细胞变圆变大的细胞病变特征，培养48h-60h后收获病毒。在Marc-145细胞上连续传至第5代。培养过程中同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照。传代过程中，利用GETV特异性引物PF/PR，定性检测有病变的Marc-145细胞中的SGETV。经观察发现，在传代培养的过程中，从第2代起各代次均出现明显的细胞病变，表现为细胞变圆、变大、出现空斑，利用GETV特异性引物PF/PR对细胞毒RNA进行RT-PCR扩增，均能检测出GETV特异性目的片段(见图2)，而未接种的Marc-145细胞空白对照扩增结果为阴性。病毒接种第2代后细胞病变稳定，接种24h即出现病变，细胞变圆，变大，脱落(见图3)。接种48h后细胞脱落可达80％以上。表明病毒已适应Marc-145细胞并能在Marc-145细胞上稳定增殖。将分离的SGETV命名为猪盖他病毒HNJZ-S1。1.5病毒滴度TCID50的测定将消化吹散的Marc-145细胞悬液接种到96孔板中，每孔200μL，培养24h后，取猪盖他病毒HNJZ-S1株的第5代细胞培养物以连续倍比稀释101-1010，每孔接种100μL，并设立不接猪盖他病毒HNJZ-S1株的空白对照，37℃，5％CO2培养箱孵育1h后，每孔加100μL含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养，每个稀释度各做8个重复，逐日观察细胞病变情况，并按照Reed-Muench法计算病毒滴度TCID50，最终测得病毒滴度TCID50为107.25。1.6猪盖他病毒HNJZ-S1株理化特性研究取7只灭菌的EP管，在超净工作台内分别加入500μL猪盖他病毒HNJZ-S1株第5代细胞培养液。第1管(耐氯仿试验)加入终浓度为4.8％的分析纯氯仿混合振荡，置于4℃作用30min，随后500rpm/min离心5min，吸取上层液体；第2管(耐酸试验)用0.1mol/L的盐酸调PH至3.0，于37℃水浴作用1h，再用0.1mol/L的NaOH溶液将PH调回至7.2；第3管(耐热试验)置于60℃水浴锅中作用1h；第4管(耐甲醛试验)加入体积比1％的分析纯甲醛混合振荡，37℃作用2d，2000rpm离心20min，吸取下层液体；第5管(耐胰酶试验)加入等体积的胰蛋白酶置37℃水浴作用1.5h后，用4mL灭活胎牛血清终止其作用；第6管(紫外敏感试验)紫外照射30min；第7管不处理作为正常对照。然后将7管处理后的猪盖他病毒HNJZ-S1株细胞培养液分别接种至Marc-145传代细胞，按常规法测定其TCID50，其结果见表1。从表1可以看出，分离得到的猪盖他病毒HNJZ-S1株对氯仿敏感，属于有囊膜病毒；对酸敏感；甲醛、紫外线和60℃加热，均可在短时间内使病毒灭活；对胰酶有抵抗力。这些理化特性均符合盖他病毒的理化特性。表1猪盖他病毒HNJZ-S1株理化特性的检测结果处理方法实验组TCID50/mL对照组TCID50/mL对数差值耐氯仿试验100.75107.256.5耐酸试验100107.257.25耐热试验101.1107.256.15耐甲醛试验101.25107.256耐胰酶试验105.75107.251.5紫外敏感试验101.5107.255.751.7猪盖他病毒HNJZ-S1株形态学观察取20mL猪盖他病毒HNJZ-S1株第6代细胞培养物反复冻融后于4℃、8000r/min离心1h，取上清；将上清于4℃、30000r/min离心2h，弃上清，收集沉淀；用10mLpH7.2的0.01mol/LPBS缓冲液重悬沉淀，然后于4℃、8000r/min离心1h，取上清；将上清于4℃、30000r/min离心2h，弃上清收集沉淀；然后再用20μLpH7.2的0.01mol/LPBS缓冲液重悬沉淀，得到重悬液。取10μL重悬液滴于带支持膜的铜网上，3-5min后用滤纸从铜网边缘吸去液体，稍干后用10μL2％磷钨酸染色2min，再用滤纸吸去染色液，待完全干燥后置于透射电镜下观察并拍照。经透射电镜下观察，可在视野内看到大小均一、近似圆形的病毒粒子(图4)，大小约60-70nm，有囊膜，表面有纤突；与已报道的GETV形态基本吻合，而且视野内未见其他形态的病毒粒子。1.8猪盖他病毒HNJZ-S1株感染小鼠试验将公母鼠合笼交配5-7天进行检查，如母鼠奶头周围的毛外翻，奶头显露，说明已经怀孕。将怀孕母鼠挑出，分试验组和对照组两组，每组5只。试验组接种猪盖他病毒HNJZ-S1株第5代细胞培养物，接种量为500μL/只，肌肉注射；对照组肌肉注射等体积的DMEM。接种后逐日观察母鼠的发病情况。对怀孕母鼠攻毒后，实验组母鼠出现流产、死产、木乃伊胎、产仔数下降等临床表现，而对照组母猪产仔正常(图5)，说明此毒株对妊娠小鼠有很强的致病性，并推测其极可能是引起病料来源猪场怀孕母猪繁殖障碍的重要病原。实施例2猪盖他病毒HNJZ-S1株全基因组的克隆与序列分析2.1引物设计参照GenBank中发表的GETVHB0234(EU015062)基因序列，使用Premier5设计了12对特异性引物(其核苷酸序列见表2)；并根据RACE试剂盒说明书针对5’UTR设计了3条引物(其核苷酸序列见表3)，包括1条反转录引物，1条内引物及1条外引物；对3’UTR设计了1条内引物及1条外引物(其核苷酸序列见表3)，引物由上海生物工程有限公司合成。2.2猪盖他病毒HNJZ-S1株RNA的提取及全基因组的扩增将收获的SGETV细胞培养物，反复冻融3次以裂解细胞，8000r/min离心5min后取上清，按照RNAisoPlus提取试剂的说明书提取病料总RNA，并进行RT-PCR扩增。反转录体系(20μL)：RNA模板13μL、5×buffer4μL、dNTP(10mmol/μL)1μL、随机引物random1μL(20pmol/μL)、RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL、反转录酶M-MLV(200U/μL)0.5μL。反转录反应条件：42℃1h，95℃5min。以反转录得到的cDNA为模板，用针对非编码区设计的引物扩增非编码区，用针对编码区设计的12对引物分别进行编码区的PCR扩增。非编码区扩增按试剂盒操作进行。编码区PCR反应体系(50μL)：2×EsTaqMasterMix25μL、上下游引物各1μL(20pmol/μL)、cDNA模板5μL，补加灭菌双蒸水至50μL。编码区PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，退火，72℃延伸70s，35个循环；最后72℃延伸10min，循环过程中，退火温度根据不同引物的不同标准进行。取5μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果见图6。由图6可知，扩增片段经过琼脂糖凝胶电泳检测，均出现与预期长度相符的条带，由此说明设计的引物可成功将各片段扩增出来。2.3猪盖他病毒全基因组的克隆和重组质粒的PCR鉴定将上述用不同引物扩增出的各片段的产物进行回收纯化，并连接到pMD18-T克隆载体上，然后将连接产物进行转化，提取重组质粒，并对重组质粒进行PCR鉴定。表2SGETV基因组编码区序列扩增引物表3SGETV基因组非编码区序列扩增引物2.4猪盖他病毒全基因组的序列测定对PCR鉴定为阳性的各重组质粒进行测序，序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。然后用DNAMAN软件对猪盖他病毒HNJZ-S1株全基因序列进行序列拼接，得到全长为11689bp的猪盖他病毒HNJZ-S1株的全基因组序列(不包括5’端帽子结构和3’端的多聚核苷酸尾)，如SEQIDNo.34所示。GETV基因组具有典型的甲病毒属基因组结构，分为2个独立的开放阅读框架(ORF)，HNJZ-S1株5’端的7404个核苷酸编码4种非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3、nsP4，3’端的3762个核苷酸编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白，两者之间有44个核苷酸为不翻译的连接区。5’端起始的78个核苷酸和3’端402个核苷酸为非编码区。2.5猪盖他病毒HNJZ-S1株全基因组序列相似性和同源性分析用DNAStar软件将猪盖他病毒HNJZ-S1株的全基因组序列与从GenBank上下载的12株GETV(该12株GETV均为GenBank上收录的典型毒株，见表4)全基因组序列进行比对分析。经过对比发现，猪盖他病毒HNJZ-S1株与这12株参考毒株之间核苷酸序列相似性均较高，介于97.6％-99.3％，其中与韩国株SouthKorea相似性最高(99.3％)，而与俄罗斯株LEIV16275Maq相似性最低(97.6％)，详见图7。由上述结果可知，猪盖他病毒HNJZ-S1株与各参照毒株具有同源性，属于盖他病毒。2.6猪盖他病毒HNJZ-S1株全基因组系统发育进化关系分析利用软件MEGA6.05绘制GETV全基因组进化树(图8)，从图8进化树可以看出，猪盖他病毒HNJZ-S1株与日本株14-I-605-C1、14-I-605-C2及中国株HB0234亲缘关系最近，在同一进化分支内；与中国株SC1210、YN0540及韩国株SouthKorea分属同一大的进化分支，遗传关系次之；而与日本株MI-110-C1、MI-110-C2、Kochi/01/2005，蒙古株LEIV17741MPR，中国株M1及俄罗斯株LEIV16275Maq分属不同进化分支，亲缘关系较远。这说明猪盖他病毒HNJZ-S1株与国内及邻近国家日本、韩国的毒株亲缘关系较近，对于了解和分析我国GETV的起源及流行情况具有重要参考价值。表412株GETV参考毒株登录号毒株名称来源地理长度(bp)登录号SouthKorea猪韩国11597AY702913HB0234蚊中国11686EU01506214-I-605-C2马日本11690LC07908914-I-605-C1马日本11689LC079088YN0540蚊中国11690EU015063SC1210蚊中国11690LC107870MI-110-C1马日本11690LC079086MI-110-C2马日本11689LC079087LEIV17741MPR蚊蒙古11689EF631999M1蚊中国11696EU015061Kochi/01/2005猪日本11690AB859822LEIV16275Maq蚊俄罗斯11689EF631998实施例3猪盖他病毒灭活疫苗的制备3.1病毒培养用pH值7.2的含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养箱贴壁培养Marc-145细胞；待细胞生长覆盖率达到80％-90％时弃去培养液，按感染复数为0.1接种猪盖他病毒HNJZ-S1株第4代细胞传代株，然后用含有2％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养箱培养，培养48h-60h待细胞病变完全后收获病毒液于-80℃和室温反复冻融三次，10000×g离心10分钟，去掉细胞碎片，得取上清，得到猪盖他病毒液，冻存于-80℃。3.2病毒液的灭活及灭活检验在病毒含量合格的病毒液中(优选TCID50≥107/mL)加入甲醛，使甲醛的终浓度达到0.2％(体积浓度)，于37℃作用24h，其间每隔2h摇匀一次；灭活后向病毒液中加入硫代硫酸钠溶液用来中和甲醛，其中，按w/v计，所加入的硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.2％，充分混匀，获得灭活的病毒液。将灭活后的病毒液用病毒维持液做10倍稀释，接种Marc-145细胞(6孔板)，每孔接种500μL，同时设立阴性对照孔(采用病毒维持液作为阴性对照)，37℃、5％CO2温箱内孵育1h后弃去培养液，补加2mL维持液，37℃、5％CO2温箱培养，观察细胞病变，盲传三代，未出现细胞病变，表明灭活完全。3.3制备含猪盖他病毒HNJZ-S1株的疫苗组合物(1)制备水相：按w/v计，向灭活后的病毒液中加入吐温-80，使得吐温-80终浓度为4％，混合均匀，得到水相；(2)制备油相：将注射用白油和司本-80按照体积比92:6混合，得到混合液，然后，按w/v计，向混合液中后加入硬脂酸铝至终浓度为2％，得到油相。(3)乳化：按照体积比2:1将油相和水相进行混合并乳化，即得疫苗组合物。乳化质量能够达到国家规定的质量标准。实施例4猪盖他病毒灭活疫苗的安全性试验按照实施例3制备的猪盖他病毒灭活疫苗的方法制备3批疫苗，3批疫苗分别做安全性试验。试验方法：取GETV抗体阴性的2-3个月龄猪、配种后一周内妊娠母猪各10头。按照表5所示分组情况，随机选取2-3个月龄猪5头、妊娠母猪5头，于颈部肌肉注射2头份(2mL)；其余10头，各注射1头份(1mL)。疫苗从三个批次中各随机选择10头份。免疫前测量体温，免疫后7d每天测定体温；免疫后连续14d观察猪群采食情况，并触摸注射部位局部有无肿块。表5灭活疫苗安全性试验动物分组及免疫情况免疫后猪群体温没有出现升高的现象(图9)，而且猪群采食和精神正常。单倍剂量和双倍剂量疫苗注射后，经14d观察均未见注射部位有肿块出现。试验结果证明，本发明的灭活疫苗安全性良好。实施例5猪盖他病毒灭活疫苗的免疫原性试验5.1试验方法HI抗体效价测定：试验共选用GETV抗体阴性的2-3个月龄猪10头及配种后一周内的妊娠母猪10头，试验按表6中所设计进行分组，组B1、B2均颈部肌肉注射1mL灭活疫苗(1头份，含107TCID50)；组B3、B4为对照组，均颈部肌肉注射乳化后的DMEM培养基1mL。分别于免疫前及免疫后1、2、3、4周采血，测定HI抗体效价。攻毒保护试验：试验共选取GETV抗体阴性的1-2个月龄猪10头、后备母猪10头及配种前免疫猪盖他病毒灭活疫苗且抗体阳性的母猪所产3日龄吃初乳和未吃初乳的胎儿各10头。试验按表7中所设计的分组、免疫及攻毒方案进行。其中，DMEM为乳化后的DMEM，免疫及攻毒途径均为颈部肌肉注射。攻毒后连续观察记录仔猪的发病及死亡情况，并观察记录母猪产仔情况。表6HI抗体效价测定试验动物分组及免疫情况表7攻毒保护试验动物分组、免疫及攻毒情况测定HI抗体效价后对数据进行整理，结果见表8及图10。由表8可知，试验组(B1、B2)免疫1周后开始出现特异性抗体，2周后HI抗体效价基本达到免疫要求，3-4周仍呈增加趋势，4周内个别猪HI抗体效价最高可达1:256，对照组(B3、B4)HI抗体效价＜10。图10可反映出抗体水平的变化趋势，并可明显看出，随着试验天数增加，免疫组HI抗体效价逐渐高于未免疫组。试验结果证明该灭活疫苗能很好地使猪群产生抗体应答反应。但考虑到疫苗临床使用时的复杂情况，为保证疫苗实际使用的免疫保护效果，确定疫苗效力检验时，检验标准为免疫21日后，其血清HI抗体效价不低于1:64。表8灭活疫苗HI抗体效价测定结果攻毒后连续观察记录仔猪的发病及死亡情况，结果见表9。由表9可知，经免疫后的仔猪(组C2)在3-4月龄攻毒后保护率可达100％，而未免疫组(组C5)无保护率。吃经免疫后的母猪初乳的3日龄仔猪(组C1)攻毒后保护率也可达100％，而未吃经免疫后的母猪初乳的3日龄仔猪(组C4)无保护率。待母猪产仔时，观察并记录母猪产仔情况，结果见表10。由表10可知，未免疫的母猪(组C6)在配种一周内攻毒后发生流产、死产、木乃伊胎、弱仔等临床表现，而配种前免疫的母猪(组C3)攻毒后均能正常产仔，保护率可达100％。综合试验结果证明，猪盖他病毒灭活疫苗能很好的为猪群提供保护，免疫原性良好。表9灭活疫苗攻毒保护试验结果(一)表10灭活疫苗攻毒保护试验结果(二)SEQUENCELISTING<110>河南农业大学<120>一种猪盖他病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用<130>1<160>34<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>1aacccacccgtgcgcttgt19<210>2<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>2cgccgttgttgtctgattgagg22<210>3<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>3gctgatagcccattcctt18<210>4<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>4cgtcctaccgttcaccac18<210>5<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>5atgcgaaggttatgtggt18<210>6<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>6aaaggtggattgattaggtc20<210>7<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>7tgaataccgacgaggaaa18<210>8<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>8caagaacttgcaccagaca19<210>9<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>9gaggaatggcaagaagaa18<210>10<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>10aaagttagaaaacagcagga20<210>11<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>11cagagtcagcgagatggt18<210>12<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>12aatggaaaggaggagcac18<210>13<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>13acgccgattcgtctacgc18<210>14<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>14gggccatctgcatctttgc19<210>15<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>15tcgtaaggtcgctactgaa19<210>16<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>16tgatttgtggttggtggt18<210>17<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>17cgcttatctggacttggt18<210>18<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>18agtacggtggtttctcaca19<210>19<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>19gaggtcagacccgctaat18<210>20<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>20catgggtgtactttgaagc19<210>21<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>21gaaatcgagcaagtatgacc20<210>22<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>22cacgttgccactaccaca18<210>23<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>23cgcagcagtcaggtaatg18<210>24<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>24tgattgaggttcccgtag18<210>25<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>25tatgcaagcacgaccatg18<210>26<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>26tgcgttttgttactattcagg21<210>27<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>27tggttgcaggcacataggtac21<210>28<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>28ccgctagtgcctcgaacatg20<210>29<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>29ccatgacgtcttgtaggtccgtt23<210>30<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>30atggcaagataaccctgcatt21<210>31<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>31tgacatgggtgcagcgggtagccg24<210>32<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>32gaccacgcgtatcgatgtcgac22<210>33<211>38<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>33gaccacgcgtatcgatgtcgactttttttttttttttt38<210>34<211>11689<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>34atggcggacgtgtgacatcaccgttcgctctttctaggatcctttgctactccacatagt60gagagacaaacaacccaaatgaaggtaaccgtggacgttgaggctgatagcccattcctt120aaggcccttcagaaggcgtttcccgcctttgaggttgaatcacagcaggtcacaccgaat180gaccatgctaacgctagagcattttcgcatctggctactaaactgattgagcaagaggtt240ccaacaggcgtcaccatcctggacgtgggtagtgcacccgcaaggaggttgatgtctgac300cacacctaccactgcatctgccccatgaaaagtgcggaagacccagagaggctggcgaat360tacgctcggaagctggcgaaagcatcggggactgtgctagacaagaatgt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