分泌抗小麦矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗小麦矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术：

小麦矮缩病(Wheat dwarf disease)是目前危害小麦生产的主要病毒病害之一。1961年Vacke在捷克斯洛伐克发现小麦出现了矮化现象，他认为这是由叶蝉传播的一种病毒引起的，并将其命名为小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus，WDV)。在中国小麦矮缩病最早于2007年在陕西韩城发现，当时发病面积达到1万亩，发病田平均病株率达到80％。目前，该病在河北、云南、山西、甘肃、河南等我国的13个主要小麦生产省份也相继发生。

小麦矮缩病病株在田间常呈块状出现，其典型症状是植株严重矮缩、黄化、条斑、分蘖增多、抽穗减少或不抽穗等，使小麦产量大幅度降低，最高可减产80％以上。小麦在拔节前受到WDV侵染会造成植株矮缩，轻者株高20cm，重者仅10cm，且植株不再增高；拔节后的小麦受侵染会造成分蘖长短不一，根部产生众多的小分蘖。发病严重的植株在拔节前即死亡，发病较轻的植株虽能拔节，但多不抽穗，即使抽穗，籽粒也不实。

小麦矮缩病毒属于双生病毒科(Geminiviridae)玉米线条病毒属(Mastrevirus)。病毒粒子呈现孪生颗粒状态，颗粒直径为18nm，20面体对称。WDV基因组是由2739-2750个核苷酸组成的环状单链DNA，由4个编码区和2个非编码区组成。WDV的病毒链含有V1和V2两个开放阅读框，分别编码运动蛋白(MP)和衣壳蛋白(CP)；反义链含有C1和C2两个开放阅读框，分别编码两个复制酶相关蛋白酶(Rep和Rep A)。非编码区由短非编码区(Short intergenic region，SIR)和长非编码区(Long intergenic region，LIR)组成。

WDV的主要传播介体是异沙叶蝉(Psammotettix alienus Dahlb)，以持久性非增殖方式在田间传播。异沙叶蝉秋季时在多种秋作作物和杂草上产卵以越冬，卵在春季开始孵化。初春时小麦返青，带毒的异沙叶蝉在麦田危害并传播WDV。夏季小麦收割后，成虫迁至秋季作物及杂草上。此时，田间杂草和多种作物既是WDV的寄主，也是异沙叶蝉生息的场所，为WDV传播提供了毒源。秋季杂草枯萎，异沙叶蝉转移到新出苗的小麦田，小麦出苗越早，叶蝉对其危害越重，若此时叶蝉带毒，小麦发病会很严重。温度等环境因素是影响异沙叶蝉的关键性因素。当温度超过15℃时，异沙叶蝉群体数量显著增加，秋季低温可以降低叶蝉的传毒能力。

小麦作为我国第二大粮食作物，其产量直接关乎民生。作为麦类主要病毒病之一的小麦矮缩病毒近年来危害严重，造成麦类作物严重减产。目前根据症状观察判断田间小麦矮缩病的发生情况仍然是最主要的方法，但是由于多种病毒病造成的症状极为相似，而且常与其他病毒病复合侵染，因此仅依靠症状观察得到的结果缺乏准确度。电镜观察病毒粒子需要昂贵的仪器，且不同病毒病的病毒粒子大小和形态有相似性，导致其仅作为一种辅助检测手段。基于PCR方法的分子检测技术虽然灵敏，但是不适于田间检测。相对而言，血清学方法简单易操作、快速、灵敏、成本较低，且能够应用于田间样品的大规模检测，是目前理想的植物病毒的检测技术，但血清学方法必须依赖于特异、灵敏的优质抗体。因此，本发明专利主要针对小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其检测应用开展工作，利用杂交瘤技术制备了1株能分泌抗WDV单抗杂交瘤细胞23F4，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，从而为我国小麦矮缩病毒的检测、诊断和科学指导防控提供物质和技术支持。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗小麦矮缩病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

分泌抗小麦矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株23F4，它能分泌抗小麦矮缩病毒的特异性单抗,杂交瘤细胞株23F4于2016年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13297。

抗小麦矮缩病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-9，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单抗与小麦矮缩病毒30kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染WDV小麦病叶的灵敏度分别达到1:163 840和1:5 120倍稀释(w/v,g/mL)。

抗小麦矮缩病毒的单克隆抗体仅与小麦矮缩病毒有特异性免疫反应，而与大麦黄矮病毒GPV株系、大麦黄矮病毒GAV株系、大麦黄矮病毒PAV株系、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒以及健康小麦植物组织均不发生任何免疫反应。

抗小麦矮缩病毒的单克隆抗体在小麦矮缩病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株23F4分泌抗小麦矮缩病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测小麦矮缩病毒；2)利用本发明所制备的单抗检测小麦矮缩病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单抗可有效地用于田间小麦等植物中小麦矮缩病毒的检测。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测小麦WDV的灵敏度分析；

图2是dot-ELISA方法检测WDV的特异性分析：1列上下2个点为1个感染WDV小麦植物样品的2个生物学重复；2列上下2个点为重组表达WDV CP蛋白的2个生物学重复；3列上下2个点为1个感染小麦黄花叶病毒小麦植物样品的2个生物学重复；4列上下2个点为1个感染中国小麦花叶病毒小麦植物样品的2个生物学重复；5列上下2个点为1个感染大麦黄矮病毒GAV株系小麦植物样品的2个生物学重复；6列上下2个点为1个感染大麦黄矮病毒GPV株系小麦植物样品的2个生物学重复；7列上下2个点为1个感染大麦黄矮病毒PAV株系小麦植物样品的2个生物学重复；8列上下2个点为1个感染大麦黄花叶病毒小麦植物样品的2个生物学重复；9列上下2个点为1个健康小麦植物组织样品的2个生物学重复。

图3是dot-ELISA方法检测小麦田间样品中WDV的代表性结果。

生物保藏

分类命名：分泌抗小麦矮缩病毒(WDV)单抗杂交瘤细胞；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日为2016年11月30日，保藏号为CGMCC No.13297。

具体实施方式

分泌抗小麦矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株23F4于2016年11月30日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13297，它能分泌抗小麦矮缩病毒的单克隆抗体。

抗小麦矮缩病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-9，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，能与小麦矮缩病毒的30kDa外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染WDV小麦植物病叶的灵敏度分别达到1:163 840和1:5 120倍稀释(w/v,g/mL)。

抗小麦矮缩病毒的单克隆抗体仅与小麦矮缩病毒有特异性免疫反应，而与大麦黄矮病毒GPV株系、大麦黄矮病毒GAV株系、大麦黄矮病毒PAV株系、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒以及健康小麦植物组织均不发生任何免疫反应。

抗小麦矮缩病毒的单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株23F4能大量分泌抗小麦矮缩病毒的单抗，且其分泌的单抗效价高、特异性强、灵敏度高、稳定性好。以该单抗为核心建立的检测WDV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间WDV的检测，从而为我国小麦矮缩病毒的检测、预警和科学防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

根据已报道的WDV编码外壳蛋白的基因序列(登录号：JQ836568)设计一对特异引物：

WDV-CP-F(5’-GGATCCATGGTGACCAACAAGGACTCCCGA-3’，划线部分为BamHI酶切位点)和WDV-CP-R(5’-AAGCTTTTATTGAATCCCAATGGATTTGA-3’，划线部分为HindIII酶切位点)，并由杭州擎科生物技术有限公司合成。利用常规CTAB法提取感染WDV的小麦病叶的总DNA，参照TOYOBO公司的说明书进行PCR反应扩增WDV CP 基因，反应体系为：

PCR反应参数如下：预变性98℃2min，变性98℃10s，退火55℃30s，延伸72℃45s，循环扩增30次，最后68℃延伸10min，最后16℃5min结束PCR反应。将扩增产物于0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分析，并用PCR凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收DNA片段，具体操作参照产品试剂盒说明书进行。将纯化的PCR产物末端加A与克隆载体pMD-18T vector连接，重组质粒命名为pMD-18T-CP，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用质粒提取试剂盒(Axygen公司)提取重组质粒，对提取的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，并通过测序验证重组克隆载体pMD18-T-CP中所携带的CP基因序列及读码框的正确性，序列分析软件为DNAstar、NCBI-BLAST，所用的数据库为GeneBank等。重组质粒pMD18-T-CP中CP基因片段经BamH I和Hind III双酶切后插入经同样酶切的pET-32a表达载体中。PCR、酶切筛选阳性克隆，并通过测序验证重组原核表达载体pET-32a-CP中所携带CP基因序列和读码框是否正确。若正确则将原核表达质粒pET-32a-CP 42℃热击转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，挑取单菌落接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例将培养物接种于含氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时加入终浓度为1mM IPTG诱导表达4h，离心收集菌体。部分菌体加入2×SDS上样缓冲液悬浮，沸水中变性5-l0min,12 000rpm离心后取10μL上清进行SDS-PAGE电泳分析，其余菌体经超声波破碎，收集上清按照产品说明书进行用Ni²⁺-NTA亲和层析柱(QIAGEN公司)纯化目的蛋白。SDS-PAGE电泳发现纯化到了大小约为50kD的重组蛋白条带，与预期结果相符。以纯化的重组CP蛋白作为免疫原和检测抗原。

2.免疫动物

用纯化的WDV CP蛋白免疫六周龄BALB/c雌性小鼠。即WDV纯化蛋白80μL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后经背腹部皮下多点注射0.16mL/只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射，再过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按6:1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1 500rpm离心5min去除培养基，用50％PEG(分子量1 500)作为融合剂，在37℃水浴中加入1mL，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1 500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，并置于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10-30％时，以WDV CP为抗原包被ELISA板，用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获116个阳性孔。选择3个呈强阳性反应的细胞孔，进行3次有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗WDV特异性单抗的杂交瘤细胞株23F4。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/c小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL降植烷(Sigma)，7-10d后腹腔注入6×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10d可见小鼠腹部明显膨大，针头采取腹水，3 000rpm离心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加入2倍体积0.06M pH4.8醋酸缓冲液稀释，室温下边搅边加辛酸(30uL/mL腹水)，4℃澄清1h，12 000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3 000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶解，在4℃冰箱中流动透析24h后即获纯化的单抗，-70℃保存。

6.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM、κ和λ轻链抗体进行DAS-ELISA分析，结果显示，23F4单抗类型和亚类为IgG1、kappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果表明23F4单抗腹水效价达到10^-9。

7.单克隆抗体的特异性检测

用感染大麦黄矮病毒GPV株系、大麦黄矮病毒GAV株系、大麦黄矮病毒PAV株系、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒的病叶粗提液包被ELISA板，以小麦的健康叶片粗提液作阴性对照，以感染小麦矮缩病毒的病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA方法测定单抗的特异性。ACP-ELISA方法的具体步骤为：上述病毒感染的病叶用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:30 (w/v,g/mL)倍加入包被缓冲液继续研磨匀浆，5 000rpm离心3min后取上清，100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤3次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤3次后加入适当稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色，2M氢氧化钠终止反应后用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，23F4单抗只对WDV有特异性反应，而与大麦黄矮病毒GPV株系、大麦黄矮病毒GAV株系、大麦黄矮病毒PAV株系、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒和健康小麦植物组织均无任何免疫反应。

二、检测WDV的免疫学方法及其试剂盒的建立

1.检测WDV的ACP-ELISA方法

1.1 ACP-ELISA方法的步骤：

1)植物组织称重后用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:30比例(w/v,g/mL)加入0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)继续研磨匀浆3min，5 000rpm离心3min，上清100μL/孔加入ELISA板中，以感染WDV小麦病叶为阳性对照，健康小麦叶为阴性对照，37℃2h或4℃过夜；

2)PBST洗涤3次后用3％脱脂奶粉封闭30min；

3)加入适当稀释后的单抗腹水，100μL/孔，37℃孵育1h；

4)PBST洗涤3次后加入适当稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)，100μL/孔，37℃孵育1h；

5)用PBST洗涤后加入PNPP硝基磷酸盐底物100μL/孔，室温放置30min；

6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性；或用2M氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD₄₀₅，以P/N>2.1作为阳性判断标准。

1.2 ACP-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定

用常规方阵试验确定ACP-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度，即ELISA板横向加用封闭液倍比稀释的单抗，纵向加用封闭液倍比稀释AP标记的羊抗鼠IgG二抗进行ACP-ELISA。试验表明23F4单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:6 000和1:8 000倍稀释，以抗体的最适工作浓度建立检测WDV的ACP-ELISA方法。对WDV病叶粗提液从1:160至655 360倍比稀释，分别以相应稀释度的健叶粗提液作阴性对照，分析ACP-ELISA方法的检测灵敏度。结果表明ACP-ELISA方法对1:163 840倍稀释(w/v,g/mL)的病叶粗提液仍呈阳性反应，即对病叶的检测灵敏度可达到1:163 840(w/v,g/mL)倍稀释，表明ACP-ELISA方法具有很高的灵敏度。用建立的ACP-ELISA方法检测WDV、大麦黄矮病毒GPV株系、大麦黄矮病毒GAV株系、大麦黄矮病毒PAV株系、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒和健康小麦植物组织，检测结果表明，建立的ACP-ELISA方法检测WDV呈强阳性反应，而检测大麦黄矮病毒GPV株系、大麦黄矮病毒GAV株系、大麦黄矮病毒PAV株系、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒和健康小麦植物组织均呈阴性反应，且阴阳性结果对比差异极显著，说明该方法的特异性很好。

2.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

2.1 dot-ELISA方法检测植物中WDV的操作步骤

将小麦植物样品的叶片称重后用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:20的比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后继续研磨、匀浆；匀浆液5 000rpm离心3min；取2.5μL上清点到硝酸纤维素膜(NC)上，同时设置健康和感染WDV的小麦叶片分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20min；NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记的羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025mol/L MgCl、pH9.5)中混匀，膜放入底物液中反应，显色10-20min，肉眼观察结果，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时，自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

2.2 dot-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定

用常规方阵试验确定dot-ELISA方法中WDV的单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明23F4单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5 000和1:8 000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测WDV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当WDV病叶稀释到1:5 120(w/v,g/mL)倍时，以23F4单抗建立的dot-ELISA方法检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:5 120倍稀释(w/v,g/mL)(图1)。特异性分析表明，该方法检测感染WDV的小麦植物呈强阳性反应，而与大麦黄矮病毒GPV株系、大麦黄矮病毒GAV株系、大麦黄矮病毒PAV株系、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒和健康小麦植物组织均呈阴性反应(图2)。

2.3 dot-ELISA方法的应用

用建立的dot-ELISA方法对2016年采自陕西省、青海省等田间疑似发病样品进行检测，结果发现，128个检测样品中有79个样品产生紫色的阳性斑点，代表性的检测结果如图3所示。这些样品同时用PCR方法进行分析，结果表明所有dot-ELISA检测到的阳性样品中均能扩增到WDV特异性的基因片段，而所有阴性样品中均未扩增到任何基因片段。PCR产物核酸测序表明阳性样品确实感染WDV，说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于植物样品中小麦矮缩病毒的检测。

3.小麦矮缩病毒dot-ELISA检测试剂盒

1)试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC) 10张

2)检测植物样品检测的操作步骤：

a.将植物样品称重后用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:20的比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后继续研磨、匀浆3min；

b.匀浆液5 000rpm离心3min；

c.取3μL上清点到NC上，同时设置健康和感染WDV的小麦组织粗提液分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；

e.NC膜放入1:3 000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

f.用PBST洗膜3-4次，每次3min，然后将NC膜放入1:5 000倍稀释的AP酶标记的羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；

g.用PBST洗膜4-5次，每次3min，66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl₂，pH9.5)中并混匀，膜放入底物液中显色，肉眼观察结果；

h.待阳性对照显色明显紫色，而阴性对照没有任何显色时用自来水漂洗NC膜终止反应，拍照记录结果。

3)保存及有效期

于2-8℃避光保存，有效期12个月。

4)缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH7.4)：

加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1000mL

ELISA洗涤液(0.01M PBST)：

1000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20

ELISA封闭液：

0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v) 。