一种核酸检测的复合物及其制备方法与核酸检测的方法与流程

本发明涉及核酸检测领域，特别涉及一种核酸检测的复合物及其制备方法与核酸检测的方法。

背景技术：

众所周知，核酸与病原基因和遗传疾病、基因表达调控、细胞增殖和凋亡以及癌症的发生、发展存在着重要的联系。生物的组织、细菌、病毒均具有独特的核酸序列，这些特定序列的检测在基因分析、疾病诊断、食品污染、法医鉴定和环境监测等领域起着重要作用。研究新的核酸检测技术对促进生物功能研究、疾病诊断以及相关基因药物开发具有重大意义。

在过去的几十年中，特定核酸序列的检测方法具有用时长、操作复杂、费时费力的技术缺陷。

伴随着生物放大技术和纳米技术的迅速发展，利用新颖的生物放大技术和特殊性质的纳米探针，构建基于双倍信号放大的超灵敏核酸传感器是当前的发展方向。但是由于核酸序列没有可显示的信号，核酸的检测方法，总要对核酸进行复杂的信号标记，这使得检测变得更为复杂。因此研发一种高灵敏的、无标记的核酸检测方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

目前所知的纳米粒子具有催化的特殊性质，因此，能应用于很多有机反应。而纳米粒子的催化活性完全依赖于其表面性质，其表面微小的形态变化可以影响其催化行为，进而影响催化产物的数量。基于上述原理，利用纳米粒子的表面性质和催化产物数量的对应关系，可以作为新的设计思路研发一种高灵敏的、无标记的核酸检测产品。

技术实现要素：

有鉴于此，为了解决上述的技术问题，本发明公开了一种核酸检测复合物以及制备方法与核酸检测的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种核酸检测复合物，包括核酸、金纳米粒子和氧化石墨烯；所述核酸负载在纳米粒子修饰的氧化石墨烯上。

作为优选，所述核酸为单链DNA或RNA。

本领域技术人员可以理解，所述核酸检测复合物中所述核酸的含量依赖于所述负载金纳米粒子氧化石墨烯的含量，而所述纳米粒子的含量依赖于所述氧化石墨烯的含量，以达到饱和负载为止。

本发明还提供了所述核酸检测复合物的制备方法，金纳米粒子与氧化石墨烯结合，得到金纳米粒子负载的氧化石墨烯，然后与核酸分子结合得到核酸检测复合物。

本发明还提供了一种核酸检测的组合物，包括本发明上述的核酸检测的复合物和3-(羟乙基哌嗪)-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)。

本发明还提供了一种核酸检测的方法，包括以下步骤：

步骤1，将待测样品加入缓冲溶液中，得到待测溶液；

步骤2，将权利要求1所述核酸检测的复合物溶液与3-羟乙基哌嗪-2-羟基丙磺酸溶液混合，然后与待测溶液混合，检测其紫外可见吸收光谱；

其中所述核酸检测的复合物中的核酸序列为与待测样品中的核酸序列特异性结合的序列。

3-(羟乙基哌嗪)-2-羟基丙磺酸可以吸附于金纳米粒子的表面，并被金催化得到具有紫外吸收(340nm)的催化产物-酸酐类衍生物。但当核酸序列(单链的核酸)吸附于金纳米粒子表面时，由于核酸分子和金纳米粒子的相互作用，阻止了金纳米粒子表面和HEPPSO的作用，没有催化产物产生。当与待测溶液混合时，由于待测溶液中的核酸分子和金纳米粒子表面核酸分子的相互作用发生特异性结合，形成互补配对结合的双链核酸，会导致金纳米粒子表面的核酸分子脱离下来，使得HEPPSO和金纳米粒子表面再发生相互作用，诱导催化产物的出现，其紫外吸收强度升高。根据待测溶液中的核酸分子的数量与催化产物吸收强度增加的对应关系，可以定量检测核酸分子。

此外，3-(羟乙基哌嗪)-2-羟基丙磺酸还可以判断所述核酸检测的复合物中的核酸分子和金纳米粒子是否充分反应，判断该核酸检测的复合物是否可用于核酸检测。所述核酸检测的复合物与HEPPSO反应，所述复合物在340nm不出现吸收峰时，即反应充分，可用于核酸检测。

其中，所述3-羟乙基哌嗪-2-羟基丙磺酸溶液的制备方法为HEPPSO溶解于水中，氢氧化钠水溶液调节pH至7.4-7.5。

作为优选，所述核酸检测的复合物的工作浓度为0.5mg/mL-1mg/mL，所述3-(羟乙基哌嗪)-2-羟基丙磺酸的工作浓度为25mmol/L。

作为优选，所述核酸检测的方法中，所述待测样品为体液或血清。

所述待测样品中的核酸包括但不限于病毒核酸或细菌核酸，还可以为疾病的标志物的核酸。如肿瘤标志物的核酸。

进一步，所述待测样品中的核酸为单链DNA或RNA。

作为优选，所述单链DNA或RNA的浓度为1.0×10^-11mol/L-2.5×10^-7mol/L。

本发明所述核酸检测的方法中所述检测波长优选为340nm。

与现有技术相比，本发明提供的核酸检测复合物及核酸检测的组合物化学性质稳定，同时在室温条件下可长时间保存，应用方便。本发明提供的核酸检测的方法无需对样品进行预处理，操作简单、识别灵敏度高，广泛适用于医院临床疾病和健康状况诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例2中核酸复合物中加入核酸后催化产物的紫外可见吸收光谱图，吸收强度随着分析物浓度的增加而增强；

图2示实施例2中核酸复合物对核酸检测的浓度范围曲线图。

具体实施方式

本发明公开了一种核酸复合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种核酸检测的复合物及其制备方法与核酸检测的方法，其中所用原料及试剂均可由市场购得。

HEPPSO溶液的配制：将HEPPSO溶解在二次蒸馏水中，利用摩尔浓度为6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH,得到浓度为100mmol/L，pH值为7.5的HEPPSO溶液

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：核酸检测的复合物的制备：

将浓度为6nmol/L Au纳米粒子与浓度为0.5mg/mL的氧化石墨烯充分反应，然后离心纯化，最后得到负载有Au纳米粒子的石墨烯复合物，最终其浓度调节为0.5mg/mL，再把浓度为1μmol/L与待测核酸反向互补的核酸序列(序列为5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’，SEQ ID NO.1)负载到所述纳米粒子氧化石墨烯的复合结构上，离心2次去除多余核酸分子，得到核酸检测的复合物。

将制得的核酸检测的复合物与浓度为25mmol/L的HEPPSO反应，若所述复合物在340nm不出现吸收峰，则该复合物中的金纳米粒子和核酸分子充分反应，可用于核酸检测。

实施例2：检测核酸分子：

将待测核酸(序列为5’-AACTCTGCTCGACGGATT-3，SEQ ID NO.2)溶于缓冲溶液中，配成0.01mol/L的核酸储备溶液，用缓冲溶液将所述待测核酸储备液分别稀释为1.0×10^-11，5.0×10^-11，1.0×10^-10，5.0×10^-10，1.0×10^-9，5.0×10^-9，1.0×10^-8，5.0×10^-8，1.0×10^-7，5.0×10^-7，1.0×10^-6，2.5×10^-6，1.0×10^-5，2.0×10^-5，3.0×10^-5和1.0×10^-4mol/L。取17份实施例1制备的核酸复合物，编号为1-17，每份180μL，向第2-17份核酸复合物中分别加入20μL上述各个浓度的核酸储备溶液，第1份核酸复合物中添加20μL缓冲溶液，混匀放置1小时后，将各溶液在6000rmp下离心15分钟，取上清液，测定各上清液的吸收光谱，结果参见图1。图1为本发明实施例提供的试剂混合液中加入核酸以后催化产物的紫外可见吸收光谱图。

参见图1，图1中的曲线由下到上分别为空白的上清液、含1.0×10^-12mol/L、5.0×10^-12mol/L、1.0×10^-11mol/L、5.0×10^-11mol/L、1.0×10^-10mol/L、5.0×10^-10mol/L、1.0×10^-9mol/L、5.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、5.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L、2.5×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、2.0×10^-6mol/L、3.0×10^-6mol/L和1.0×10^-5mol/L待测核酸的核酸复合物的上清液的紫外可见吸收光谱图。由图1可知，吸收强度随着分析物浓度的增加而增强。当核酸浓度达到5.0×10^-12mol/L时，催化产物吸收光谱在340nm开始出现；随着核酸浓度的增加，催化产物吸收光谱的增加程度更加明显；当浓度达到1.0×10^-5mol/L时，吸收光谱最强。因此，本发明提供的核酸复合物检测核酸的灵敏度可达5.0×10^-12mol/L，灵敏度较高。

参见图2可知，从1.0×10^-11mol/L-2.5×10^-7mol/L可以很好的线性拟合，因此本发明提供的核酸复合物检出核酸的浓度线性范围为1.0×10^-11mol/L-2.5×10^-7mol/L。

综上所述，本发明解决了现有技术中检测特定核酸序列的费时费力的技术问题。本发明提供的检测方法无需对样品进行预处理，操作简单、识别灵敏度高。同时，本发明提供的核酸检测复合物化学性质稳定，在室温条件下可长时间保存，应用方便，可用于医院临床疾病和健康状况诊断。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所

<120> 一种核酸检测的复合物及其制备方法与核酸检测的方法

<130> MP1621579

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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