一种体外高效扩增NK细胞的方法及其应用与流程

本发明涉及细胞培养和免疫治疗领域，特别涉及一种体外高效扩增NK细胞的方法及其应用。

背景技术：

自然杀伤细胞由造血干细胞分化发育而来，属于人体免疫细胞的一种，是具有细胞溶解作用、能够分泌免疫调节因子的效应淋巴细胞，医学上称之为“人体抗肿瘤和抗感染的第一道防线”。与T淋巴细胞和B淋巴细胞不同，NK细胞无须预先接触抗原即可杀伤靶细胞(包括细菌、病毒感染的宿主细胞和肿瘤细胞)，且其杀伤效应无MHC限制性，这种特性使得NK细胞在抗肿瘤反应和免疫监视病变细胞、癌变细胞过程中发挥着巨大的作用。大量临床实验数据表明，NK细胞治疗在骨肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌等癌症治疗中，起到了非常积极的治疗效果。

然而，如何在体外获得大量高纯度高质量的NK细胞一直限制着NK细胞免疫治疗在临床上的广泛应用。在健康人的外周血中，NK细胞大约占外周血淋巴细胞的5％-10％。传统地，通过磁珠去除外周血淋巴细胞中的T淋巴细胞，再用高剂量的细胞因子如高剂量的白介素2或饲养层细胞刺激NK细胞的方法所获得的NK细胞表现出低扩增倍数、细胞因子依赖性、细胞衰老等问题。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种能获得大量高纯度高质量的NK细胞的方法，即利用人工抗原递呈细胞（artifical Antigen Presenting Cell, aAPC）和细胞因子联合刺激外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC），获得大量高纯度高质量NK细胞的方法。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种体外高效扩增NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

Step1.通过传统的Ficoll-Paque密度梯度离心法从人的外周血中分离出PBMC；

Step2.将人工抗原递呈细胞经辐照处理后，液氮冻存；

Step3.将PBMC与辐照处理后的人工抗原递呈细胞按质量比为1:2的比例在添加有白介素2的RPMI 1640培养基的T75的细胞培养瓶内共培养，每2-3天更换新鲜培养基；

Step4.每隔7天，计算T75的细胞培养瓶内的总细胞数目，添加等细胞数目的辐照处理后的人工抗原递呈细胞再次刺激，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞。

通过采用上述技术方案，Ficoll-Paque密度梯度离心法利用颗粒之间存在沉降系数差，在一定的离心力下，在对应梯度取得纯度较高的PBMC；利用辐照后的人工抗原蛋白具有不同于普通抗原蛋白新性能；按比例添加后，人工抗原递呈细胞与低剂量的白介素2协同作用，相较于仅使用高剂量的白介素2，能够进一步刺激PBMC，使NK细胞在体外得到扩增，得到高纯度高质量的NK细胞，通过该种方法，可进行相对大规模的NK细胞的制备，使NK细胞的临床应用成为可能，每隔7天对细胞进行人工抗原递呈细胞再次刺激，使PBMC分化NK细胞的过程能够得到源源不断地刺激，使NK细胞具有较大的扩增量，经上述方法制得的扩增后的NK细胞，具有高纯度、高质量的特点，延长了NK细胞的寿命，使扩增后的NK细胞相较于未扩增前具有更好的活性功能。

作为优选，所述人工抗原递呈细胞为K562-mb.IL21＋CD137L细胞株，其包括稳定表达细胞膜结合型的白介素21和CD137配体的K562细胞株。

通过采用上述技术方案，K562-mb.IL21+CD137L细胞株能够在细胞膜表面稳定表达白介素21和CD137配体，同时，细胞膜结合型的白介素21的稳定效果更好，以此作为PBMC扩增的饲养细胞，能够直接扩增NK细胞，获得高纯度且扩增量大的NK细胞，CD137配体通过与表达在NK细胞、T细胞或其他免疫细胞表面上的公刺激分子CD137结合，起到促进NK细胞、T细胞或其他免疫细胞的活化的作用。

作为优选，所述细胞膜结合型的白介素21为白介素21与跨膜蛋白或铰链蛋白相连而成的融合蛋白，其结构由GM-CSF signal peptide、白介素21、IgG4和CD4相连而形成。

通过采用上述技术方案， GM-CSF signal peptide 为出膜信号肽，提供出膜信号给白介素21，引导白介素21出细胞膜；IgG4 Hinge+Fc 段连接白介素21，使白介素21在细胞膜外流动性不会过差，提升白介素21的灵活性；CD4TM为CD4的跨膜段，负责将白介素21固定在细胞膜上，使白介素21不会呈游离态脱离细胞膜表面，完整的氨基酸序列或具备其功能的氨基酸序列片段的GM-CSF signal peptide、白介素21、IgG4、CD4和CD137配体的氨基酸表达更加稳定。

作为优选，所述辐照处理的辐照强度为80~150Grays。

通过采用上述技术方案，处于80~150Grays辐照强度内进行辐照的K562-mb.IL21＋CD137L细胞株具有其突变对NK扩增的效果较好，辐照强度过大，细胞株的突变过多，所扩增制得的NK细胞的纯度较低，辐照强度过大，细胞株无法突变，无法起到提升NK细胞扩增的效果。

作为优选，所述白介素2的剂量为40~70IU/mL。

通过采用上述技术方案，白介素2计量过小或过大会导致培养基浓度过低或过高，细胞扩增和分化过程对培养基浓度要求十分苛刻，浓度过高会导致细胞失水，浓度过低细胞膜则容易涨破，均不利于细胞的扩增和分化。

作为优选，所述细胞膜结合型的白介素21和CD137配体通过T2A连接。

通过采用上述技术方案，细胞膜结合型的白介素21和CD137配体进通过T2A连接，当mb.IL21+CD137L细胞株的基因在细胞内翻译时会在T2A区域断裂成2个独立的片段。

作为优选，所述K562-mb.IL21＋CD137L细胞株的细胞系内整合有慢病毒载体，所述慢病毒载体上装载有可转录成上述氨基酸序列的基因序列。

通过采用上述技术方案，慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白，为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

作为优选，所述细胞膜结合型的白介素21和CD137配体都表达在K562细胞株的细胞系的细胞膜上。

通过采用上述技术方案，细胞膜结合型的白介素21和CD137配体在K562细胞株的细胞膜上表达，提高了NK细胞的扩增效率，使扩增后的NK细胞具有高纯度的特点。

作为优选，所述扩增后的NK细胞的平均扩增的倍数为10⁵~10⁷，NK细胞的端粒长度要比扩增之前的NK细胞的端粒长度长8~15倍。

通过采用上述技术方案，经扩增后的NK细胞的端粒长度较扩增之前加长，通过端粒长度可以推断NK细胞的活力与寿命，扩增后的NK细胞具有较之扩增前更长的寿命和更好的活力，其抗癌、抗衰老的效果也能得到提升。

本发明的第二个目的是提供一种体外高效扩增NK细胞的方法的应用，扩增后的NK细胞在抗衰老、抗病毒、抗癌方面的效果都十分好。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种体外高效扩增NK细胞的方法的应用，所述扩增后的NK细胞在抗衰老中应用具体表现为清除体内衰老细胞、病变细胞的一种或多种；所述扩增后的NK细胞在抗衰老中应用在抗病毒中的应用具体表现为治疗疱疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒的一种或多种；所述扩增后的NK细胞在抗肿瘤中的应用具体表现为治疗慢性髓系淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宫肌瘤、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、骨肉瘤中的一种或多种。

通过采用上述技术方案，扩增后的NK细胞在抗衰老、抗病毒、抗癌方面有着多种用处，且其杀伤效应无MHC限制性，这种特性使得NK细胞在抗肿瘤反应和免疫监视病变细胞、癌变细胞过程中发挥着巨大的作用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、该种NK细胞的扩增方法以辐照mb.IL21+CD137L细胞株作为饲养细胞，添加低剂量白介素2的RPMI 1640作为培养基，以此扩增NK细胞，相较于现有技术，NK细胞扩增后的纯度和细胞量都有着较大的提升；

2、经过辐照后的mb.IL21+CD137L细胞株还具有增强NK细胞端粒的效果，使扩增后的NK细胞回复活性，并增长了NK细胞的寿命，减缓了NK细胞的衰老过程；

3、该种扩增后的NK细胞除了对肿瘤细胞以及病毒细胞有着突出的清除率之外，在抗衰老方面同样有着极佳的效果。

附图说明

图1是全基因合成的mb.IL21＋CD137L的基因序列示意图；

图2是mb.IL21+CD137L细胞株在K562细胞上表达的流式细胞图；

图3是扩增前后NK细胞纯度的流式细胞图，主要示出了扩增21天后，扩增细胞中CD3和CD56的表达；

图4是NK细胞扩增倍数图，主要示出了NK细胞在K562-mb.IL21+CD137L细胞株和低剂量白介素2共同刺激下细胞数目的变化；

图5是扩增后NK细胞表面受体流式细胞图；

图6是NK细胞杀死肿瘤细胞系的杀伤图；

图7是扩增后NK细胞端粒长度的变化。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

密度梯度离心法分离PBMC

Step1.抽取40岁中年志愿者的外周血5mL置于无菌离心管中，加入0.5mL的柠檬酸钠混匀；

Step2.加入5mL1640细胞培养液再次混匀，稀释；

Step3.取5mL淋巴细胞分离液置于离心管中，用滴管将Step1中稀释的血液沿管壁缓慢加入分离液上，并使血液与分离液保持两相分离；

Step4.将离心管1800rpm/min离心25min；

Step5.用毛细吸管沿管壁插入单个核细胞层，洗出单个核细胞置于另一无菌离心管内；

Step6.加入5倍体积的1640细胞培养液，1500rpm/min，离心10分钟，取沉淀；

Step7.重复Step6两次后，用1640细胞培养液重悬细胞，制成细胞悬液备用。

＋CD137L细胞株的构建

参见图1，以K562细胞株作为载体，选取包含GM-CSF signal peptide完整氨基酸序列的GM-CSF signal peptide、包含IgG4完整氨基酸序列的IgG4、包含CD4完整氨基酸序列的CD4与包含白介素21完整氨基酸序列的白介素21（IL-21）相连形成融合蛋白，该融合蛋白为细胞膜结合型的白介素21。选取包含CD137配体(CD137L)完整氨基酸序列的CD137配体，通过T2A连接细胞膜结合型的白介素21和CD137配体，合成mb.IL21＋CD137L的基因。

GM-CSF signal peptide 为出膜信号肽，引导白介素21出细胞膜； IgG4 Hinge+Fc 段连接白介素21，使其在细胞膜外具有一定灵活性；CD4中包含有跨膜段CD4TM，负责将白介素21固定在细胞膜上；T2A连接白介素21和CD137配体，当mb.IL21＋CD137L的基因在细胞内翻译时，T2A会断裂使mb.IL21＋CD137L形成2个独立的片段；CD137配体能够与表达在NK细胞、T细胞或其他免疫细胞表面上的公刺激分子CD137结合，促进NK细胞、T细胞或其他免疫细胞的活化。

全基因合成mb.IL21＋CD137L的基因之后，将基因装载到慢病毒载体，包装慢病毒，感染K562细胞，培养4天后，通过Puro、Neo、GFP等标记基因，流式细胞仪检测mb.IL21和CD137配体在K562细胞细胞膜表面表达情况，参见图2，筛选具有稳定表达mb.IL21蛋白和CD137配体蛋白的稳定细胞株，液氮保存筛选的K562-mb.IL21＋CD137L细胞株。

细胞的扩增方法

Step1.通过传统的Ficoll-Paque密度梯度离心法从人的外周血中分离出PBMC；

Step2.将K562-mb.IL21＋CD137L细胞株经100Grays辐照处理后，液氮冻存；

Step3. 在T75的细胞培养瓶内制备50IU/mL白介素2的RPMI 1640培养基；

Step4.将PBMC与辐照处理后的K562-mb.IL21＋CD137L细胞株按质量比为1:2的比例在添加到T75的细胞培养瓶内共培养，每2-3天更换新鲜培养基；

Step5.每隔7天，计算T75的细胞培养瓶内的总细胞数目，添加等细胞数目的辐照处理后的人工抗原递呈细胞再次刺激，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞。

扩增后的NK细胞的纯度检测

参见图3，在辐照后的K562-mb.IL21＋CD137L细胞株和低剂量白介素2的共同作用下，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞用流式细胞仪对扩增细胞进行检测，从图3可知，扩增前的CD3-CD56⁺NK细胞比例仅占2.09%，扩增后，CD3-CD56⁺NK细胞的比例约占97%。

扩增后的NK细胞的数量检测

参见图4，在辐照后的K562-mb.IL21＋CD137L细胞株和低剂量白介素2的共同作用下，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞用以自动细胞计数仪进行检测，从图4可知，CD3^-CD56⁺NK细胞平均扩增的倍数为15000倍。

扩增后的NK细胞的表型检测

参见图5，在辐照后的K562-mb.IL21＋CD137L细胞株和低剂量白介素2的共同作用下，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞用流式细胞仪对NK细胞表面受体中激活型受体和抑制性受体的表达情况进行检测，从图5可知，几乎所有的扩增后的NK细胞都表达激活型受体，包括有NKG2D, DNAM-1, NKp46 和 NKp30。

扩增后的NK细胞对肿瘤细胞的裂解作用

参见图6，在辐照后的K562-mb.IL21＋CD137L细胞株和低剂量白介素2的共同作用下，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞通过钙黄绿素释放试验检测NK细胞杀死K562(人慢性髓系白血病细胞系)，A549(人非小细胞肺癌细胞系)，MCF-7（人乳腺癌细胞系），HCT116（人结直肠癌细胞系）能力，由图可知，扩增后的NK细胞在效：靶比为10:1时，对K562、A549的细胞溶解率均达到了85%以上，对MCF-7、HCT116的细胞溶解率也达到了70%以上，由此可知，扩增后的NK细胞对上述肿瘤细胞有较强的清除效果。

扩增后的NK细胞端粒长度检测

参见图7，在辐照后的K562-mb.IL21＋CD137L细胞株和低剂量白介素2的共同作用下，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞检测NK细胞端粒长度的变化，检测如图7中的实验组所示，结果表明本发明扩增后的NK细胞的端粒长度要比扩增之前的NK细胞的端粒长度长10倍；

按照现有技术，将只使用200IU/ml白介素2的培养基作为对照组，在不添加辐照后的K562-mb.IL21＋CD137L细胞株的情况下，连续培养21天，得到扩增的NK细胞端粒长度如图7中对照组所示，要比扩增之前的NK细胞的端粒长度短15倍。

通过上述扩增方法得到的扩增后的NK细胞，具有高纯度的特点，CD3-CD56⁺NK细胞的比例可以达到97%以上，且具有扩增效率高，21天左右的扩增的CD3^-CD56⁺NK细胞平均扩增的倍数能够达到15000倍以上，且扩增后的NK细胞的端粒长度比扩增之前的NK细胞的端粒长度长10倍，从端粒长度可以推断，扩增后的NK细胞具有较之扩增前活性更强，对衰老细胞、病毒细胞、肿瘤细胞有着较佳的清除率。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。