一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体内容涉及一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株及其应用。技术背景在现代工业中果胶是一种重要的物品，例如它可以在诸如果酱制品的视频工业中用作增稠剂或胶凝剂。在细胞壁的果胶降解过程中各种果胶酶都发挥了独特作用。其中果胶溶酶(PL)能够水解果胶产生水溶性果胶，切断聚甲氧基半乳糖醛酸和阿拉伯糖之间的化学键；多聚半乳糖醛酸酶(PG)能切断果胶酸的a-1,4糖苷键形成游离的半乳糖醛酸；果胶甲酯酶(PME)的作用位点具体地说，是果胶分子的还原性末端或其邻近的游离羧基，对多聚半乳糖醛酸甲酯有高度的专一性，能水解水溶性果胶分子中甲氧基(-OCH2)与半乳糖醛酸之间的酯键，沿着分子以单链机制进行，从而形成对二价阳离子异常敏感的果胶酸和甲醇，再经过PG作用形成游离的半乳糖醛酸。果胶甲酯酶(Pectinmethylesterase,PME)是一种能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇的重要的果胶酶，普遍存在于高等植物的不同组织器官，如根、茎、叶、果实等。其对细胞壁组成和降解，细胞游离、花粉发育、种子萌发、根尖延伸、种子开裂、果实软化成熟、抗病等方面具有重要作用。目前在食品加工、茶饮料、造纸等生产工艺中已广泛利用果胶甲酯酶的活性来改善产品品质。对果胶酯酶结构和基因方面的研究，目前研究的最多的是蕃茄和柑橘中的果胶酯酶。但也有不少学者将果胶酯酶从草莓、烟草以及一些真菌中得到克降与表达。随着基因工程技术的发展，从微生物中克隆果胶甲酯酶基因，构建高效表达体系，诱导果胶甲酯酶表达，这是获得大量果胶甲酯酶的新途径之一。例如，从菊欧文氏菌B374克隆果胶甲酯酶，在枯草芽孢杆菌中进行表达，可以获得没有外源污染的果胶甲酯酶。从米曲霉KBN616克隆果胶甲酯酶基因(pmeA)，在黑曲霉中进行超量表达，其果胶甲酯酶可用于降解大豆果胶，制备豆酱。较于国外，国内对果胶甲酯酶基因工程的研究还比较缓慢，通过基因工程手段改造宿主细胞，提高果胶甲酯酶的表达量，以促进酶工业和食品工业的进一步发展是本发明的研究重点。技术实现要素：本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株。申请人在出发菌黑曲霉Su（AspergillusnigerSu）中敲除了EG、PL、PG1和PG2四个基因，构建得到新的宿主菌黑曲霉Su4，并在黑曲霉Su4中过表达果胶甲酯酶，能大大提高果胶甲酯酶的产量，为该酶的广泛应用奠定了基础。本发明一方面涉及一种新的宿主细胞黑曲霉Su4（AspergillusnigerSu4），其缺失了糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶、葡聚糖酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶1和聚半乳糖醛酸酶2七个基因。所述糖化酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:3；所述α淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:4；所述高峰淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:5；所述葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:6；所述果胶裂解酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:7；所述聚半乳糖醛酸酶1基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:8；所述聚半乳糖醛酸酶2基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:9。本发明另一方面涉及一种重组菌株，是将携带有果胶甲酯酶基因的表达载体转化入上述宿主细胞获得的。所述果胶甲酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO：1，其编码核苷酸序列为SEQIDNO：2。所述重组菌株命名为黑曲霉Su4-PME（AspergillusnigerSu4-PME），已于2016年12月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016778。所述重组菌株在果胶甲酯酶生产中的应用。本发明构建的以黑曲霉Su为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su-PME，其摇瓶发酵上清液中果胶甲酯酶活力为33u/ml，20L罐发酵上清液中果胶甲酯酶活力为256u/ml；以黑曲霉Su4为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su4-PME，其发酵上清液中果胶甲酯酶活力高达58u/ml，比黑曲霉Su-PME提高了75.8%，20L罐发酵上清液中果胶甲酯酶酶活高达421u/ml，比黑曲霉Su-PME提高了64.5%。从而说明本发明通过敲除宿主菌黑曲霉Su中的EG、PL、PG1和PG2四个基因，能显著提高果胶甲酯酶基因的表达效率，使果胶甲酯酶的表达量提高60%以上，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉重组菌株可广泛应用于果胶甲酯酶的生产，从而有利于降低果胶甲酯酶的生产成本，促进其在果汁加工领域中的推广与应用。附图说明图1为质粒pGAU图谱；图2为黑曲霉菌株发酵液SDS-PAGE蛋白电泳图：其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1、2分别为黑曲霉Su-PME、Su4-PME发酵上清液；图3为黑曲霉菌株Su-PME、Su4-PME20L罐发酵曲线。具体实施方式本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。本发明实施例中所选用的宿主细胞黑曲霉Su（AspergillusnigerSu），是发明人徐晓东于2015年3月在野生型黑曲霉的基础上敲除了糖化酶（glucoamylase）、α淀粉酶（α-amylase）、高峰淀粉酶（TAKA-amylase）3个基因得到的菌株，所述三个基因的编码核苷酸序列分别为SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5。下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。实施例1葡聚糖酶（endoglucanase，简称EG）基因敲除以黑曲霉Su（AspergillusnigerSu）基因组为模板，利用引物EGU-F、EGU-R扩增葡聚糖酶基因上游序列，利用引物EGD-F、EGD-R扩增葡聚糖酶基因下游序列。葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:6。PCR引物和反应条件如下：引物EGU-F：TCAAAATCTCGGAAGGAC引物EGU-R：GGACGAAGTAAGCCAACTA引物EGD-F：TTAAATTCCGAGCCAGTC引物EGD-R：AACAAGAAATACGCACCC扩增条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列EGU大小为1434bp，下游序列EGD大小为1506bp。将上述获得的上下游序列EGU、EGD片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrE连接，构建敲除载体pQC-EG，其中上下游序列EGU、EGD分别位于筛选标记pyrE两侧。原生质体制备：接种宿主菌黑曲霉Su于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到108个/ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体pQC-EG，加入50ul25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物EGYZ-F1、EGYZ-R1、EGYZ-F2、EGYZ-R2进行PCR验证。引物EGYZ-F1、EGYZ-R1为葡聚糖酶基因内部引物，如果葡聚糖酶基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为441bp的条带；引物EGYZ-F2、EGYZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为1311bp的条带。引物EGYZ-F1：GAGGGAACAGTGAAAAGC引物EGYZ-R1：CTGGGTGAGATAGTTGAAGA引物EGYZ-F2：ATGGCGCAACCTGCTATAGC引物EGYZ-R2：GGATTACCTTTCAAGGAAAG通过上述PCR验证，申请人筛选到葡聚糖酶（EG）基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su1（AspergillusnigerSu1）。实施例2黑曲霉Su1尿嘧啶营养缺陷型筛选2.1原理：5-氟乳清酸可以诱导菌体缺失尿嘧啶核苷酸合成途径中的乳清核苷酸转移酶或乳清苷单磷酸脱羧酶，从而使5-氟乳清酸无法形成有毒的物质5-氟尿嘧啶核苷酸，从而产生了对5-氟乳清酸的抗性，其嘧啶核苷酸营养可以通过向培养基中添加尿嘧啶进行补充，因此利用5-氟乳清酸诱导形成的尿嘧啶营养缺陷型菌株可以在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的培养基中生长；而野生型菌株因不具备对5-氟乳清酸的抗性，无法在含有5-氟乳清酸的培养条件下生长。因此常用5-氟乳清酸来筛选尿嘧啶缺陷型的突变株。筛选方法分别将实施例1筛选到的黑曲霉Su1的孢子用浓度为0.1%的吐温-20溶液稀释至约1×107个/mL；然后将孢子悬液均匀涂布于含有1.5g/mL5-氟乳清酸和1.87g/mL尿嘧啶核苷（Uridine）的基本固体培养基（2%葡萄糖，0.5%(NH4)2SO4,1.5%KH2PO4,0.06%MgSO4,0.06%CaCl2，1.5%琼脂）平板上，避光30℃培养7d以上。结果显示，平板上都有一定数量的菌落长出，说明这些菌落有可能是黑曲霉Su1的尿嘧啶缺陷型菌株。分别挑取平板上长出的菌落，将每个菌落分别涂布于基本培养基平板和含有1.87g/mLUridine的基本培养基平板进行验证。真正的尿嘧啶缺陷型菌株只能在含有Uridine的基本培养基平板上生长，而在缺少Uridine的基本培养基平板上无法生长。最终，申请人筛选到1株生长状态相对最好的尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su1-1（AspergillusnigerSu1-1）。实施例3果胶裂解酶（pectatelyase，简称PL）基因敲除以尿嘧啶缺陷型菌株黑曲霉Su1-1（AspergillusnigerSu1-1）基因组为模板，利用引物PLU-F、PLU-R扩增果胶裂解酶基因上游序列，利用引物PLD-F、PLD-R扩增果胶裂解酶基因下游序列。果胶裂解酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:7。PCR引物和反应条件如下：引物PLU-F：ATGATTGCTCCCACCCTC引物PLU-R：AACCGTTGATTCTTCTCG引物PLD-F：GGATGTAATCAGGGGACG引物PLD-R：GGATAAGGCGTAGGCACT反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列PLU大小为1568bp，下游序列PLD大小为1457bp。将上述获得的上下游序列PLU、PLD片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrE连接，构建敲除载体pQC-PL，其中上下游序列PLU、PLD分别位于筛选标记pyrE两侧。原生质体制备：接种黑曲霉Su1-1（AspergillusnigerSu1-1）于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到108个/ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体pQC-PL，加入50ul25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物PLYZ-F1、PLYZ-R1、PLYZ-F2、PLYZ-R2进行PCR验证。引物PLYZ-F1、PLYZ-R1为果胶裂解酶基因内部引物，如果果胶裂解酶基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为423bp的条带；引物PLYZ-F2、PLYZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为1746bp的条带。引物PLYZ-F1：CGTCTACCCCGACACTAT引物PLYZ-R1：AATGACACCGAGTATAACCTA引物PLYZ-F2：ATGGCGCAACCTGCTATAGC引物PLYZ-R2：GGATTACCTTTCAAGGAAAG通过上述PCR验证，申请人筛选到果胶裂解酶（PL）基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su2（AspergillusnigerSu2）。实施例4聚半乳糖醛酸酶1（polygalacturonase，简称PG1）基因敲除采用实施例2所述方法将黑曲霉Su2菌株通过5-氟乳清酸筛选，获得尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su2-2（AspergillusnigerSu2-2）。以尿嘧啶缺陷型菌株黑曲霉Su2-2基因组为模板，利用引物PG1U-F、PG1U-R扩增聚半乳糖醛酸酶1基因上游序列，利用引物PG1D-F、PG1D-R扩增聚半乳糖醛酸酶1基因下游序列。聚半乳糖醛酸酶1基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:8。PCR引物和反应条件如下：引物PG1U-F：AGTCGTGACATTAGGTGGGT引物PG1U-R：TTCTTGGCTGGCAGTAGG引物PG1D-F：ACATAGGACGATGCTGG引物PG1D-R：GTTCTGGCGTGGTGAC反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列PG1U大小为1696bp，下游序列PG1D大小为1495bp。将上述获得的上下游序列PG1U、PG1D片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrE连接，构建敲除载体pQC-PG1，其中上下游序列PG1U、PG1D分别位于筛选标记pyrE两侧。原生质体制备：接种黑曲霉Su2-2于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到108个/ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体pQC-PG1，加入50ul25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物PG1YZ-F1、PG1YZ-R1、PG1YZ-F2、PG1YZ-R2进行PCR验证。引物PG1YZ-F1、PG1YZ-R1为聚半乳糖醛酸酶1基因内部引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为459bp的条带；引物PG1YZ-F2、PG1YZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为1492bp的条带。引物PG1YZ-F1：ATCCTAACGCTCTGG引物PG1YZ-R1：GAACTTGGGCTTCGTC引物PG1YZ-F2：CAAGGAGTATAAAATGAGCA引物PG1YZ-R2：TTTATGTTTGCAGCTCAAGT通过上述PCR验证，申请人筛选到聚半乳糖醛酸酶1基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su3（AspergillusnigerSu3）。实施例5聚半乳糖醛酸酶2（polygalacturonase，简称PG2）基因敲除采用实施例2所述方法将黑曲霉Su3通过5-氟乳清酸筛选，获得尿嘧啶缺陷型菌株，命名为黑曲霉Su3-3（AspergillusnigerSu3-3）。以尿嘧啶缺陷型菌株黑曲霉Su3-3基因组为模板，利用引物PG2U-F、PG2U-R扩增聚半乳糖醛酸酶2基因上游序列，利用引物PG2D-F、PG2D-R扩增聚半乳糖醛酸酶2基因下游序列。聚半乳糖醛酸酶2基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:9。PCR引物和反应条件如下：引物PG2U-F：GTTCCCCAGCAACTCA引物PG2U-R：GGATAGAGCATCTCAACG引物PG2D-F：ACTGCCATAGTGTTAGTGAA引物PG2D-R：GCGGCGACAAATAGAC反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列PG2U大小为1434bp，下游序列PG2D大小为1691bp。将上述获得的上下游序列PG2U、PG2D片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrE连接，构建敲除载体pQC-PG2，其中上下游序列PG2U、PG2D分别位于筛选标记pyrE两侧。原生质体制备：接种黑曲霉Su3-3于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到108个/ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的敲除载体pQC-PG2，加入50ul25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。扣取少量菌丝体，提取基因组，通过引物PG2YZ-F1、PG2YZ-R1、PG2YZ-F2、PG2YZ-R2进行PCR验证。引物PG2YZ-F1、PG2YZ-R1为聚半乳糖醛酸酶2基因内部引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增无条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为402bp的条带；引物PG2YZ-F2、PG2YZ-R2为上下游两端的验证引物，如果基因被敲除掉则PCR扩增出大小为2421bp的条带，如果基因未被敲除掉则PCR扩增出大小为1502bp的条带。引物PG2YZ-F1：CTGTCGGCTCCCTCGTCT引物PG2YZ-R1：CCGTTGGTGCCCTTGC引物PG2YZ-F2：AAACTCTCCAGGACTTCCGT引物PG2YZ-R2：TATCGAGCAAAGCTCCATTA通过上述PCR验证，申请人筛选到聚半乳糖醛酸酶2基因被敲除的黑曲霉菌株，并将其命名为黑曲霉Su4（AspergillusnigerSu4）。实施例6果胶甲酯酶（Pectinmethylesterase，简称PME）基因的克隆以黑曲霉Su基因组为模板，利用引物1和引物2扩增出果胶甲酯酶基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：2，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO：1。PCR引物和反应条件如下：引物1（F）：ATGGTTAAGTCAATTCTT引物2（R）：TTAGTTGATGTAGCTAGT反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的PME基因大小为1322bp。实施例7重组载体的构建PCR扩增上述果胶甲酯酶基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：引物3（F）：GCTCTAGAATGGTTAAGTCAATTCTT引物4（R）：GCTCTAGATTAGTTGATGTAGCTAGTPCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，PME基因为大小1322bp的片段。将上述获得的果胶甲酯酶PME基因片段与表达载体pGAU分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：PCR片段酶切体系（50ul）质粒pGAU酶切体系（50ul）PCR片段20ulpGAU质粒20ul10*M5ul10*M5ulBSA5ulBSA5ulXbaI2ulXbaI2ulddH2O18ulddH2O18ul37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ulddH2O。用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：PCR片段2ulpGAU2ul10*Buffer1ulT4DNAligase1ulddH2O4ul总体积10ul22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有果胶甲酯酶PME的重组载体pGAU-PME。实施例8果胶甲酯酶PME的重组表达1、原生质体制备：分别接种宿主菌黑曲霉Su和在黑曲霉Su基础上敲除EG、PL、PG1和PG2四个基因获得的黑曲霉Su4于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%；琼脂粉1.5%）平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridine1%）培养基中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。转化：将上述获得的黑曲霉Su和Su4原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到108个/ml；每200ul原生质体中分别加入10ul准备好的重组载体pGAU-PME，加入50ul25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml25%的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基（麦芽糖12%；豆饼粉0.85%；玉米浆1%；硫酸铵0.5%；磷酸二氢钾0.35%；磷酸氢二钾0.75%；七水硫酸镁0.03%）中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。结果如图2所示，箭头所指处的蛋白条带即为重组表达的果胶甲酯酶。分别检测各阳性转化子发酵上清液中果胶甲酯酶酶活力，筛选出酶活最高的阳性转化子，分别命名为黑曲霉Su-PME（AspergillusnigerSu-PME）和黑曲霉Su4-PME（AspergillusnigerSu4-PME）。（1）果胶甲酯酶酶活单位的定义在30℃、pH值为4.8的条件下，每分钟使甲酯化果胶去甲基而产生1μmol果胶酸的酶量，定义为一个酶活力单位U。（2）酶活测定方法0.25%果胶底物：秤取柑橘类果胶（DE>69%，GA>65%或等同）2.50g，将约800ml的水加热到约40℃，强烈搅拌下缓慢加入秤取的柑橘类果胶溶解。将悬浊液加热到60℃，搅拌直到果胶全部溶解，保持搅拌直至溶液冷却到室温。然后用10%盐酸调节pH到4.8.将溶液转移到1000ml的容量瓶中定容备用。酶液：用缓冲液稀释至适当倍数，控制酶活约为10~20U/ml，每分钟滴定滴定液体积为0.1-0.4ml。（1）按照去离子水、滴定液的顺序冲洗全自动滴定仪的所有管路，校正pH电极；校正pH电极的方法：在电位滴定仪上按下“标定”键，首先将温度电极和pH电极同时放置于pH4.0的校正液中，待数值显示稳定后按“F2”键，仪器显示“两点标定吗”，按“F2”键，仪器进入二点标定，两支电极取出并用去离子水冲洗干净，然后放置于pH6.8的校正液中，待数值显示稳定后按“F2”键，仪器显示标定结束及斜率E0值，再按确认键结束标定。此时将两支电极放入pH6.86的校正液中，读数须在6.86±0.04范围内，如果超出此范围，需要重新标定。（2）在滴定皿中加入50ml、30℃预热的果胶溶液及一支小转子，并在水浴锅中预热3min；（3）将滴定皿放置在滴定仪相应位置，并将pH电极、温度电极放置于溶液中，按“搅拌”键，待显示温度30℃稳定后，用10%盐酸或10%氢氧化钠调节pH至4.8，此时按“F3”键；（4）设定滴定程序：选择预设终点滴定，设置滴定终点（pH4.8）和延时时间（500s），按“开始”键；（5）待pH稳定在4.8时，加入100ul稀释至适当倍数的酶液，并同时按下计时器，记录时间为0、1、2、3min时的滴定体积。酶活计算公式：X=(V×N×1.05×D×1000)/(W×t)式中：X——样品的酶活力，单位为U/ml；V——数据记录时间1-3min之间加入滴定液的体积，ml；N——滴定液的浓度，mol/L；1000——mol/L到μmol/L的单位转换因子；1.05——修正因子；D——稀释倍数；t——反应时间，2min；W——样品的体积ml；4、酶活结果分析酶活检测结果显示，以黑曲霉Su为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su-PME，其发酵上清液中果胶甲酯酶活力为33u/ml，而以黑曲霉Su4为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su4-PME，其发酵上清液中果胶甲酯酶活力高达58u/ml，提高了75.8%。进一步将黑曲霉Su-PME（AspergillusnigerSu-PME）和黑曲霉Su4-PME（AspergillusnigerSu4-PME）分别进行20L罐发酵，发酵曲线如图3所示，发酵180h后，黑曲霉Su-PME发酵上清液中果胶甲酯酶酶活达到256u/ml，而黑曲霉Su4-PME发酵上清液中果胶甲酯酶酶活高达421u/ml，提高了64.5%。上述结果表明，本发明通过敲除宿主菌黑曲霉Su中的EG、PL、PG1和PG2四个基因，能显著提高果胶甲酯酶基因的表达效率，使果胶甲酯酶的表达量提高60%以上，取得了意料不到的技术效果。申请人已于2016年12月22日将黑曲霉Su4-PME（AspergillusnigerSu4-PME）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016778。黑曲霉Su4-PME可广泛应用于果胶甲酯酶的生产，从而有利于降低果胶甲酯酶的生产成本，促进其在果汁加工领域中的推广与应用。SEQUENCELISTING<110>青岛蔚蓝生物集团有限公司<120>一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株<130><160>9<170>PatentInversion3.5<210>1<211>331<212>PRT<213>1<400>1MetValLysSerIleLeuAlaSerValLeuPheAlaAlaThrAlaLeu151015AlaAlaSerArgMetThrAlaProSerGlyAlaIleValValAlaLys202530SerGlyGlyAspTyrAspThrIleSerAlaAlaValAspAlaLeuSer354045ThrThrSerThrGluThrGlnThrIlePheIleGluGluGlySerTyr505560AspGluGlnValTyrIleProAlaLeuSerGlyLysLeuIleValTyr65707580GlyGlnThrGluAspThrThrThrTyrThrSerAsnLeuValAsnIle859095ThrHisAlaIleAlaLeuAlaAspValAspAsnAspAspGluThrAla100105110ThrLeuArgAsnTyrAlaGluGlySerAlaIleTyrAsnLeuAsnIle115120125AlaAsnThrCysGlyGlnAlaCysHisGlnAlaLeuAlaValSerAla130135140TyrAlaSerGluGlnGlyTyrTyrAlaCysGlnPheThrGlyTyrGln145150155160AspThrLeuLeuAlaGluThrGlyTyrGlnValTyrAlaGlyThrTyr165170175IleGluGlyAlaValAspPheIlePheGlyGlnHisAlaArgAlaTrp180185190PheHisGluCysAspIleArgValLeuGluGlyProSerSerAlaSer195200205IleThrAlaAsnGlyArgSerSerGluSerAspAspSerTyrTyrVal210215220IleHisLysSerThrValAlaAlaAlaAspGlyAsnAspValSerSer225230235240GlyThrTyrTyrLeuGlyArgProTrpSerGlnTyrAlaArgValCys245250255PheGlnLysThrSerMetThrAspValIleAsnHisLeuGlyTrpThr260265270GluTrpSerThrSerThrProAsnThrGluAsnValThrPheValGlu275280285TyrGlyAsnThrGlyThrGlyAlaLysGlyProArgAlaAsnPheSer290295300SerGluLeuThrGluProIleThrIleSerTrpLeuLeuGlySerAsp305310315320TrpGluAspTrpValAspThrSerTyrIleAsn325330<210>2<211>996<212>DNA<213>2<400>2atggttaagtcaattcttgcatccgttctctttgcagcgaccgcgctggccgcgagccgc60atgacggctccttccggtgcgattgtcgttgccaagtccggaggtgactacgacacgatc120agcgctgccgttgatgctctgagcactacttcgaccgagacccagaccatcttcattgag180gagggatcctacgacgagcaggtgtacattcctgctctcagtggaaagctgattgtctac240ggtcagactgaggacaccactacctacactagcaacctggtcaacatcacccatgccatc300gcgttggccgatgtcgacaatgacgatgagactgcaacccttcgtaactacgctgagggc360tcggccatctacaaccttaacattgccaacacctgcggtcaggcctgccaccaggctctc420gccgtgagcgcctatgccagcgagcagggatactacgcctgccagttcaccggataccag480gacacccttctggccgagaccggctaccaggtttacgccggaacctacatcgagggtgcc540gttgacttcatcttcggacagcacgcccgcgcctggttccacgagtgcgacatccgcgtc600ctcgagggccccagctccgcctccatcaccgccaacggtcgctcctccgagtcggacgac660tcttactacgtgatccacaagtccaccgtcgctgctgctgatggcaacgatgtttcctcc720ggcacctactacctcggccgcccctggtcccagtacgctcgcgtctgcttccagaagacc780tccatgaccgatgtgatcaaccacctcggctggactgagtggtcgacctccactcccaac840accgagaacgtcaccttcgttgaatacggcaacaccggcactggcgccaagggtccccgt900gctaacttctcttctgagctgactgagcccatcactatctcttggcttctcggatctgac960tgggaggattgggttgatactagctacatcaactaa996<210>3<211>2169<212>DNA<213>3<400>3atgtcgttccgatctcttctcgccctgagcggccttgtctgctctgggttggcaagtgtg60atttccaag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