一种海洋石油降解菌、菌剂及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程
技术领域：
，具体涉及一种海洋石油降解菌、菌剂及其应用。
背景技术：
：石油中的所包含的烷烃、芳香烃、含硫化合物以及含硫或含氮的杂环化合物等均具有毒性，对人类和环境的危害极大。而原油是未经加工的石油，是天然有机物质经过地质变迁而形成的一种粘稠的黑色或深棕色的液体或固体，一般情况下大多存在于地下或海底，且带有刺激性气味，主要成分是碳氢原子结合形成的链状化合物，其对水体具有极大的危害。目前，对石油污染的水体的修复技术主要有物理修复技术、化学修复技术、光催化修复技术和生物修复技术；生物修复技术是一个具有政策、经济和技术吸引力的处理方法，被认为是最具发展潜力的技术方法，并且逐步发展成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境污染问题的最有效的手段。普遍来说一种微生物仅能降解一种或少数几种原油烃，且不同微生物对同种污染组分的降解效果也不同，多种微生物在降解过程中还可能出现协同或竞争作用。但是原油和其炼油产物，所含的原油经种类非常复杂，而且不同源产地的原油其原油经成份也有很大的差异。因此微生物修复技术在迅速发展的同时还存在一些局限性，特定的微生物只能降解特定的化合物类型，微生物的繁殖与代谢活性受环境因素的影响较大，常常在投加至土壤的初始阶段出现大量死亡。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种可用于降解原油污染水体的海洋石油降解菌、菌剂，将该菌种直接投加入污染水体中，达到较好的降解效果，实现原油污染的治理。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。(一)一种海洋石油降解菌，已于2016年09月12日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13003；命名为海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1。将所述海洋石油降解菌在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，菌株6-10-1在牛肉膏蛋白胨的平板上呈圆形、边缘完整、光滑、不透明、奶白色，表面湿润，无特殊气味。菌体呈短杆状，大小为(0.41-1.02)μm×(0.41-1.53)μm，无鞭毛，为革兰氏阴性菌。海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1的16SrDNA测序结果如SEQIDNo.1所示。(二)一种海洋石油降解菌菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体菌剂，且以海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1为活性成分。(三)所述海洋石油降解菌在降解原油污染水体中的应用。(四)所述海洋石油降解菌菌剂在降解原油污染水体中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1对原油污染水体的降解能力强，环境适应能力强，可在大量有机物存在的条件下顺利生长；同时，该菌对原油污染水体降解过程中，对污染水体中的原油的降解浓度达1mL/100mL，可有效实现原油污染水体的恢复处理；其固体菌剂也可对原油污染土壤具有良好的降解修复效果，实现原油污染的修复处理，在原油污染的生物修复中展现了良好的应用前景。附图说明下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。图1为本发明的海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落形态图；图2为本发明的海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1在显微镜下的的菌体形态图，图中，放大倍数为1000倍；图3为本发明实施例3中I号原油的波长-吸光度曲线图；图中，横坐标为波长，单位为nm，纵坐标为吸光度，单位为1；图4为本发明实施例3中I号原油的标准曲线图；图中，横坐标为浓度，单位为mg/L，纵坐标为吸光度，单位为1；图5为本发明实施例4中II号原油的标准曲线图；图中，横坐标为浓度，单位为mg/L，纵坐标为吸光度，单位为1。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例1菌株的分离纯化(1)菌株来源本发明提供一种海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1，分离自延长原油集团的七里洞采油场集油站落地原油污染土壤中，土壤的理化性质为：铵态氮15.09ppm，硝态氮0.72ppm；氮含量15.81ppm，磷含量82.05ppm，钾含量17.45ppm，有机质含量1.43％，pH为7.65。(2)菌株的分离纯化将10g原油污染土壤样品加入100mL富集液体培养基中，28℃、130r/min摇床培养7d。待培养液混浊后，吸取5mL培养液重新转接入新鲜富集培养基中，与上述培养条件相同连续转接富集培养3次。取1mL上述菌悬液，用无菌水系列稀释后，分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，29℃左右恒温培养3d。其中，富集液体培养基的成分为：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸馏水1000mL，原油I号1％(体积比)，pH7.0。其中，I号原油采自延长原油集团七里洞采油场集油站，密度为0.65g/mL；牛肉膏蛋白胨培养基的成分为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4-7.6。待平板菌落有效分离后，根据菌落颜色、形态特征及表面湿度的不同，分别用接种针挑选单菌落进行平板划线纯化分离。将菌株接种于斜面，4℃冰箱冷藏备用。(3)溶油圈法筛选原油降解菌将上述菌种接种于含油无机盐固体培养基上，置于37℃培养箱中培养10-15d，观察有无嗜油圈，并根据嗜油圈直径(D)与菌落直径(d)的比值初步确定菌株的原油降解能力。将初步筛选的原油降解菌接种于斜面培养基，4℃冰箱冷藏备用。实施例2菌株的鉴定(1)菌株的形态特征如图1所示，将所述海洋石油降解菌在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃恒温培养24h后观察菌落形态，菌株6-10-1在牛肉膏蛋白胨的平板上呈圆形、边缘完整、光滑、不透明、奶白色，表面湿润，无特殊气味。如图2所示，菌体呈短杆状，大小为(0.41-1.02)μm×(0.41-1.53)μm，无鞭毛。(2)生化特性根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对海洋石油降解菌进行生理生化鉴定，鉴定结果如表1所示。表1海洋石油降解菌6-10-1菌株的生理生化鉴定结果指标特性革兰氏染色—葡萄糖+木糖+果糖+醋酸盐+乳糖+麦芽糖—蔗糖—氧化酶+过氧化氢酶+脲酶+硝酸盐还原性—注：“—”表示反应为阴性；“+”表示反应为阳性。(3)菌株的16SrDNA鉴定用DNA提取试剂盒提取菌株海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1的基因组DNA，然后进行16SrDNA基因克隆、测序，其16SrDNA测序结果如SEQIDNo.1所示，具体如下：GCAGCGGGAAAGTAGCTTGCTACTTTTGCCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATCTTAGGACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCAGGGAAGAAAAGGTTTCGGATAATACCCGGAACTGATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTACCGAACTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGCCCTTCGGGGCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCTGAAGAGATTTAGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACATTTAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTTGCCAAACCGCAAGGTGGAGCTAATCTCATAAACCCGATCGTAGTCCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGGGGGCGATACCACG之后在GenBank中进行Blast比对，结果显示，与其序列相似度达到98.56％均为海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)，将其归属为单胞菌类并命名海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1。实施例3海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1对I号原油污染水体的降解试验方法：(1)海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1菌悬液的制备在无菌条件下，挑取分离纯化获得的海洋石油降解菌，接种于100mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，摇床扩大培养48h；其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分是：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4-7.6。pH值用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L氯化氢调至要求值。其中，培养基灭菌条件是：温度为121～126℃，时间为25min。(2)I号原油最大吸收波长的测定石油及其产品在紫外光区有一定的吸收特征，石油组分中带有苯环的芳香族化合物波长一般为250～260nm，而带有共轭双键的化合物波长一般在215～230nm之间，有研究表明，在使用紫外分光光法测定时，255nm左右为原油和重质油的选择范围，225nm左右与为轻质油及炼油厂的油品的选择范围。在100mg/L浓度下，依据获得的波长与吸光度数据，绘制供试I号原油的波长-吸光度曲线如图3所示，其中，I号原油采自延长石油集团七里洞采油场集油站，密度为0.65g/mL。(3)I号原油标准曲线的绘制分别取0、2、2.5、5、6、7mgI号原油于50mL比色管中，用石油醚定容，此时的浓度分别为0、40、50、100、120、140mg/L，在258nm波长下，以石油醚为参比溶液，测定标准浓度的吸光度。横坐标为浓度(mg/L)，纵坐标为吸光度。绘制I号原油的浓度(mg/L)-吸光度(A)的标准曲线如图4所示。(4)原油降解率的测定取扩大培养的6-10-1菌悬液3mL，接种于100mL含油无机盐液体培养基中，含油无机盐培养基的成分是：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸馏水1000mL，I号原油1.5mL，pH7.0；在30℃，120rpm恒温水浴振荡器中培养7d。培养液用5:1(V/V)的硫酸溶液调节pH值为2-3，加入甲醇2-4mL，用3×15mL的石油醚(60-90℃)萃取三次，萃取液经无水硫酸钠干燥后转入50mL容量瓶并定容。将石油醚萃取液经系列稀释后，以石油醚为参比，通过紫外分光光度法测定其相应的吸光度，根据I号原油的浓度(mg/L)-吸光度的标准曲线，确定石油醚提取液相应样品的浓度，依据浓度计算降解效率。原油降解率的计算方法参考以下公式：η(％)＝(1-Ct/Co)×100％其中：η-原油降解率；Ct-菌株存在下原油浓度；Co-对照原油浓度。试验结果：按照上述计算公式计算得本实施例的海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1对原油污染水体的降解率为75.85％。实施例4海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1对II号原油污染水体的降解试验方法：(1)海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1菌悬液的制备同实施例3。(2)II号原油标准曲线的绘制同实施例3。II号原油采自长庆油田，密度为0.87g/mL。II号原油的浓度(mg/L)-吸光度(A)的标准曲线如图5所示。(3)原油降解率的测定具体的测定方法同实施例3。试验结果：按照上述计算公式计算得1.2mL和4.2mL的海洋石油降解菌6-10-1菌悬液对II号原油污染水体的周降解率分别为7.03％和17.82％。实施例5包埋法制备海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1固体菌剂海藻酸钠(Sodiumalginate，SA)是一种具有前途和广泛类型的自然凝胶，并且被公认为价格便宜和对微生物具有无毒性。添加载体材料能增强机械强度、SA凝胶的耐受性以及为微生物提供吸附位点。以海藻酸钠为包埋材料，CaCl2溶液为交联剂，α-乳糖为营养物吸附剂。制备方法按照以下步骤进行：①将4g海藻酸钠、1.5g生物质碳、0.5g的α-乳糖混合，并加入100mL蒸馏水缓缓搅拌，搅拌时注意将活性炭搅拌均匀外，搅拌幅度不宜过大，防止大量气泡进入海藻酸钠溶液，搅拌结束后将该溶液置于121℃条件下高压灭菌20min。②待灭菌之后，将其冷却至30℃左右，分别加入20mL的按照实施例3中海洋石油降解菌6-10-1菌悬液制备方法所得到的已活化36h的海洋石油降解菌6-10-1菌悬液，分别将其混合均匀，分别得到混合液。③分别用10mL一次性注射器将混合液挤入质量百分数为4％的CaCl2溶液中，交联24h，形成固定微球，即为包埋法制备的海洋石油降解菌6-10-1固体菌剂。④过滤，然后用无菌水洗涤三次，浸泡在生理盐水中，4℃保存备用。实施例6吸附法制备海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1固体菌剂以生物质材料及其对应生物炭为目标载体，通过吸附法固定原油降解混合菌。固定方法按照以下步骤进行：①将1.5g生物质碳加入装有100mL牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，并分别加入20mL的按照实施例3中所得到的已活化36h的海洋石油降解菌6-10-1菌悬液，混合。②将锥形瓶置于30℃条件下转速为120r/min的摇床中，固定18小时。③然后在3000rpm条件下离心10min，去掉上清液，将下层沉淀用无菌水水清洗2次。④将其置于培养皿内于30℃烘箱中烘干，即为吸附法制备的海洋石油降解菌6-10-1固体菌剂，将其浸泡在生理盐水中，4℃保存备用。实施例7海洋石油降解菌6-10-1固体菌剂对II号原油污染水体的降解将实施例5和实施例6所制备的海洋石油降解菌6-10-1固体菌剂用于降解原油污染水体，具体如下：分别取5g包埋法和吸附法制备的海洋石油降解菌6-10-1固体菌剂，分别接入1mLII号原油/100mL原油无机盐培养基中30℃、120r/min恒温培养7d后，测定其对原油的去除效果，并与海洋石油降解菌6-10-1菌悬液对II号原油污染水体的降解率进行对比，结果如表2所示。表2海洋石油降解菌6-10-1固体菌剂和菌悬液对II号原油污染水体的降解率由表2可知，海洋石油降解菌6-10-1的固体菌剂对II号原油污染水体也具有降解修复的作用，将其与菌悬液的降解效果相对比，结果表明固体菌剂的降解效果较佳，且吸附法制备的固体菌剂的降解效果优于包埋法制备的固体菌剂的降解效果。虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。SEQUENCELISTING<110>长安大学<120>一种海洋石油降解菌、菌剂及其应用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1402<212>DNA<213>海洋石油降解菌（Advenellakashmirensis）6-10-1<400>1GCAGCGGGAAAGTAGCTTGCTACTTTTGCCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATC60GGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTGGCTAATACCGCATACGCCC120TACGGGGGAAAGGGGGGGATCTTAGGACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTA180GCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGA240CCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATT300TTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGT360TGTAAAGCACTTTTGTCAGGGAAGAAAAGGTTTCGGATAATACCCGGAACTGATGACGGT420ACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCA480AGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTG540AAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTACCGAACTAGAGTATGTCAGAG600GGGGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCGATGGC660GAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG720ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGCCCTTCGGG780GCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAA840AACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGC900AACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCTGAAGAGATTTAGGAGTGC960TCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT1020TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACATTTAGTTGAGCAC1080TCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG1140CCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTTGCCAAACCGC1200AAGGTGGAGCTAATCTCATAAACCCGATCGTAGTCCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTG1260CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGG1320TCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAA1380CCGCAAGGGGGGCGATACCACG1402当前第1页1 2 3