一种原油降解混合菌、菌剂及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程
技术领域：
，具体涉及一种原油降解混合菌、菌剂及其应用。
背景技术：
：石油中的所包含的烷烃、芳香烃、含硫化合物以及含硫或含氮的杂环化合物等均具有毒性，对人类和环境的危害极大。而原油是未经加工的石油，是天然有机物质经过地质变迁而形成的一种粘稠的黑色或深棕色的液体或固体，一般情况下大多存在于地下或海底，且带有刺激性气味，主要成分是碳氢原子结合形成的链状化合物，其对水体、土壤、空气等人类生存的环境具有极大的危害。目前，对石油污染的水体、土壤等的修复技术主要有物理修复技术、化学修复技术、光催化修复技术和生物修复技术；生物修复技术是一个具有政策、经济和技术吸引力的处理方法，被认为是最具发展潜力的技术方法，并且逐步发展成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境污染问题的最有效的手段。普遍来说一种微生物仅能降解一种或少数几种原油烃，且不同微生物对同种污染组分的降解效果也不同，多种微生物在降解过程中还可能出现协同或竞争作用。但是原油和其炼油产物，所含的原油经种类非常复杂，而且不同源产地的原油其原油经成份也有很大的差异。因此微生物修复技术在迅速发展的同时还存在一些局限性，特定的微生物只能降解特定的化合物类型，微生物的繁殖与代谢活性受环境因素的影响较大，常常在投加至土壤的初始阶段出现大量死亡。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种原油降解效果良好的原油降解混合菌、菌剂及其应用。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。(一)一种原油降解混合菌，其特征在于，包括海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1或弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3中的至少两种。所述海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1于2016年09月12日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13003。所述缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8于2016年09月12日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13002。所述苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1于2016年09月12日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13005。所述弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3于2016年09月12日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13004。所述海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1的16SrDNA测序结果如SEQIDNo.1所示。所述缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8的16SrDNA测序结果如SEQIDNo.2所示。所述苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1的16SrDNA测序结果如SEQIDNo.3所示。所述弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3的16SrDNA测序结果如SEQIDNo.4所示。(二)一种原油降解混合菌菌剂，其特征在于，其活性成分包括海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1或弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3中的至少两种。优选地，所述原油降解混合菌菌剂为固态菌剂。(三)所述原油降解混合菌菌剂在原油污染水体降解中的应用。(四)所述原油降解混合菌菌剂在原油污染土壤降解中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的原油降解混合菌和原油降解混合菌菌剂易于规模化生产，对原油污染水体和原油污染土壤均具有较强的降解效果；该菌剂环境适应能力强，能在大量有机物存在的条件下顺利生长，以原油为碳源，从而达到较好的降解效果；在实现原油污染废水和原油污染土壤的修复中展现了良好的应用前景。附图说明下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。图1为本发明的海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落形态图；图2为本发明的海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1在显微镜下的的菌体形态图，图中，放大倍数为1000倍。图3为本发明的缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落形态图；图4为本发明的缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8在显微镜下的的菌体形态图，图中，放大倍数为1600倍。图5为本发明的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落形态图；图6为本发明的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1在显微镜下的的菌体形态图，图中，放大倍数为4000倍。图7为本发明的弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落形态图；图8为本发明的弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在显微镜下的的菌体形态图，图中，放大倍数为1000倍；图9为本发明实施例3中I号原油的波长-吸光度曲线图；图中，横坐标为波长，单位为nm，纵坐标为吸光度，单位为1；图10为本发明实施例3中I号原油的标准曲线图；图中，横坐标为浓度，单位为mg/L，纵坐标为吸光度，单位为1；图11为本发明实施例6中II号原油的标准曲线图；图中，横坐标为浓度，单位为mg/L，纵坐标为吸光度，单位为1。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例1菌株的分离纯化(1)菌株来源本发明的原油降解混合菌分别分离自延长原油集团七里洞采油场集油站落地原油污染土壤。采用梅花布点法采集距地表20cm左右表层土壤，将样品放入4℃冰箱无菌保藏，其理化性质为：铵态氮15.09ppm，硝态氮0.72ppm；氮含量15.81ppm；磷含量82.05ppm；钾含量17.45ppm；有机质含量1.43％；pH为7.65。(2)菌株的分离纯化将10g原油污染土壤样品加入100mL富集液体培养基中，28℃、130r/min摇床培养7d；待培养液混浊后，吸取5mL培养液重新转接入新鲜富集培养基中，与上述培养条件相同连续转接富集培养3次。取1mL上述菌悬液，用无菌水系列稀释后，分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，29℃左右恒温培养3d；其中，富集液体培养基的成分为：NaNO31.5g，(NH4)SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸馏水1000mL，原油I号1％(体积比)，pH7.0。牛肉膏蛋白胨培养基的成分为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4-7.6。待平板菌落有效分离后，根据各菌落颜色、形态特征及表面湿度的不同，分别用接种针挑选单菌落进行平板划线纯化分离。将各单菌株接种于斜面，4℃冰箱冷藏备用。(3)溶油圈法筛选原油降解菌将上述单菌菌种分别接种于含油无机盐固体培养基上，置于37℃培养箱中培养10～15d，观察有无嗜油圈，并根据嗜油圈直径(D)与菌落直径(d)的比值初步确定菌株的原油降解能力；其中，含油无机盐固体培养基的成分为：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸馏水1000mL，原油1.5mL，pH7.0，pH值用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L氯化氢调至要求值。将初步筛选的原油降解菌接种于斜面培养基，4℃冰箱冷藏备用。实施例2菌株的鉴定(1)菌株的形态特征如图1所示，将所述海洋石油降解菌在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃恒温培养24h后观察菌落形态，菌株6-10-1在牛肉膏蛋白胨的平板上呈圆形、边缘完整、光滑、不透明、奶白色，表面湿润，无特殊气味。如图2所示，菌体呈短杆状，大小为(0.41-1.02)μm×(0.41-1.53)μm，无鞭毛。如图3所示，将所述缺陷短波单胞菌在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃恒温培养24h后观察菌落形态，菌株1-8在牛肉膏蛋白胨的平板上呈浅黄色，随着培养时间的延长，菌落颜色略有加深，表面光滑、湿润，菌落呈圆形，中央突起，边缘整齐，呈现半透明状。如图4所示，菌体细胞呈短杆、棒状，细胞呈单个排列，大小为0.5μm×(0.1-0.3)μm。如图5所示，将所述苏云金芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃恒温培养24h后观察菌落形态，菌株3-1在牛肉膏蛋白胨的平板上呈圆形，边缘呈锯齿状，中间凸起，乳黄色，表面光滑，湿润。如图6所示，菌体为短杆状，大小为(1.2-1.5)μm×(3-5)μm。如图7所示，将所述弯曲假单胞菌在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃恒温培养24h后观察菌落形态，菌株3起初呈淡黄色，随着菌龄的增加，颜色越来越深，最后呈黄色。该菌落特征为针尖大小的淡黄色菌落，呈规则圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，革兰氏染色后，不易着色。如图8所示，菌体细胞呈短杆、棒状，大小为(1-1.5)μm×0.5μm，为革兰氏阴性菌。(2)生化特性根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对海洋石油降解菌、缺陷短波单胞菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌进行生理生化鉴定，鉴定结果如表1-4所示。表1海洋石油降解菌6-10-1菌株的生理生化鉴定结果指标特性革兰氏染色—葡萄糖+木糖+果糖+醋酸盐+乳糖+麦芽糖—蔗糖—氧化酶+过氧化氢酶+脲酶+硝酸盐还原性—注：“—”表示反应为阴性；“+”表示反应为阳性。表2缺陷短波单胞菌1-8菌株的生理生化鉴定结果注：“—”表示反应为阴性；“+”表示反应为阳性。表3苏云金芽孢杆菌3-1菌株的生理生化鉴定结果注：“—”表示反应为阴性；“+”表示反应为阳性表4弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3的菌株生理生化鉴定结果注：“—”表示反应为阴性；“+”表示反应为阳性(3)菌株的16SrDNA鉴定用DNA提取试剂盒分别提取海洋原油降解菌的基因组DNA，然后进行16SrDNA基因克隆、测序，其16SrDNA测序结果如SEQIDNo.1所示；提取缺陷短波单胞菌的基因组DNA，然后进行16SrDNA基因克隆、测序，其16SrDNA测序结果如SEQIDNo.2所示；提取苏云金芽孢杆菌的基因组DNA，然后进行16SrDNA基因克隆、测序，其16SrDNA测序结果如SEQIDNo.3所示；提取弯曲假单胞菌的基因组DNA，然后进行16SrDNA基因克隆、测序，其16SrDNA测序结果如SEQIDNo.4所示。实施例3原油降解混合菌菌悬液对原油污染水体的降解在无菌条件下，挑取分离纯化获得的海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1和弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3分别接种于100mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，摇床扩大培养培养48h；其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分是：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4-7.6。pH值用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L氯化氢调至要求值。培养基灭菌条件是：温度为121～126℃，时间为25min。(1)原油降解混合菌菌悬液的制备1)取扩大培养的海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1菌液8mL、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8菌液3mL、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1菌液1mL均匀混合在一起，得1#原油降解混合菌悬液；2)取扩大培养的海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1菌液4mL、弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3菌液1mL、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1菌液1mL均匀混合在一起，得2#原油降解混合菌悬液。3)取扩大培养的缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8菌液4mL、弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3菌液1mL、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1菌液1mL均匀混合在一起，得3#原油降解混合菌悬液。4)取扩大培养的海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1菌液6mL和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1菌液2mL均匀混合在一起，得4#原油降解混合菌悬液。5)取扩大培养的海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1菌液3mL和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1菌液3mL均匀混合在一起，得5#原油降解混合菌悬液。6)取扩大培养的海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1菌液3mL和弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3菌液3mL均匀混合在一起，得6#原油降解混合菌悬液。(2)原油降解混合菌菌悬液对原油污染水体的降解试验方法：(1)I号原油最大吸收波长的测定石油及其产品在紫外光区有一定的吸收特征，石油组分中带有苯环的芳香族化合物波长一般为250～260nm，而带有共轭双键的化合物波长一般在215～230nm之间，有研究表明，在使用紫外分光光法测定时，255nm左右为原油和重质油的选择范围，225nm左右与为轻质油及炼油厂的油品的选择范围。在100mg/L浓度下，依据获得的波长与吸光度数据，绘制供试I号原油的波长-吸光度曲线如图9所示，其中，I号原油采自延长石油集团七里洞采油场集油站，密度为0.65g/mL。(2)I号原油标准曲线的绘制分别取0、2、2.5、5、6、7mgI号原油于50mL比色管中，用石油醚定容，此时的浓度分别为0、40、50、100、120、140mg/L，在258nm波长下，以石油醚为参比溶液，测定标准浓度的吸光度。横坐标为浓度(mg/L)，纵坐标为吸光度。绘制I号原油的浓度(mg/L)-吸光度(A)的标准曲线如图10所示。(3)原油降解率的测定分别取6mL的1#原油降解混合菌悬液、2#原油降解混合菌悬液、3#原油降解混合菌悬液、4#原油降解混合菌悬液、5#原油降解混合菌悬液、6#原油降解混合菌悬液，并分别接种于I号原油1mL/100mL无机盐液体培养基中，在30℃，120rpm恒温水浴振荡器中培养7d，培养液用5:1(V/V)硫酸溶液调pH值为2～3，加入甲醇2-4mL，用15mL的原油醚在60～90℃条件下萃取三次，萃取液经无水硫酸钠干燥后转入50mL容量瓶并定容。将石油醚萃取液经系列稀释后，以石油醚为参比，通过紫外分光光度法测定其相应的吸光度，根据I号原油的浓度(mg/L)-吸光度的标准曲线，确定石油醚提取液相应样品的浓度，依据浓度计算降解效率。在计算原油降解混合菌对I号原油的降解率的同时，采用相同的方法分别测定各单菌的原油降解率。原油降解率的计算方法参考以下公式：η(％)＝(1-Ct/Co)×100％其中：η-原油降解率；Ct-菌株存在下原油浓度；Co-对照原油浓度。在进行上述原油混合菌对原油污染水体的降解效果时，同时分别以等量的海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)3-1对原油污染水体进行降解，将其降解结果进行对比。试验结果：按照上述计算公式计算得1#、2#、3#、4#、5#、6#原油混合菌菌悬液的降解率，如表5所示。表5原油混合菌菌悬液对原油污染水体的周降解率编号降解率/％1#74.122#78.923#65.224#72.355#65.286#74.01由表5可知，2#原油混合菌对原油I号污染水体的周降解率最高，在装液量100mL、总接种量6mL、原油浓度1％的液体无机盐培养基中，7d内原油降解率可达78.92％，比单一菌种6-10-1、3、3-1在同一条件下周降解率都高，表明这三种菌之间存在一定的协同作用，1#原油混合菌也表现出相同的结果。而3#原油混合菌在同一条件下对原油I号污染水体的周降解率较单一菌种都低，说明1-8、3与3-1之间的协同效果不佳，6#原油混合菌和4#原油混合菌也表现出相同的结果，降解效果良好。实施例4包埋法制备原油降解混合菌固体菌剂海藻酸钠(Sodiumalginate，SA)是一种具有前途和广泛类型的自然凝胶，并且被公认为价格便宜和对微生物具有无毒性。添加载体材料能增强机械强度、SA凝胶的耐受性以及为微生物提供吸附位点。以海藻酸钠为包埋材料，CaCl2溶液为交联剂，α-乳糖为营养物吸附剂。制备方法按照以下步骤进行：①将4g海藻酸钠、1.5g生物质碳、0.5g的α-乳糖混合，并加入100mL蒸馏水缓缓搅拌，搅拌时注意将活性炭搅拌均匀外，搅拌幅度不宜过大，防止大量气泡进入海藻酸钠溶液，搅拌结束后将该溶液置于121℃条件下高压灭菌20min。②待灭菌之后，将其冷却至30℃左右，分别加入20mL的按照实施例3中原油降解混合菌菌悬液制备方法所得到的已活化36h的1#、2#、4#、6#原油混合菌菌悬液，分别将其混合均匀，分别得到1#、2#、4#、6#混合液。③分别用10mL一次性注射器将1#、2#、4#、6#混合液挤入质量百分数为4％的CaCl2溶液中，交联24h，形成1#、2#、4#、6#固定微球，即为包埋法制备的1#、2#、4#、6#原油降解混合菌固体菌剂。④过滤，然后用无菌水洗涤三次，浸泡在生理盐水中，4℃保存备用。实施例5吸附法制备原油降解混合菌固体菌剂以生物质材料及其对应生物炭为目标载体，通过吸附法固定原油降解混合菌。固定方法按照以下步骤进行：①将1.5g生物质碳分别加入6个装有100mL牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，并分别加入20mL的按照实施例3中原油降解混合菌菌悬液制备方法所得到的已活化36h的1#、2#、4#、6#原油混合菌菌悬液，混合。②将各锥形瓶置于30℃条件下转速为120r/min的摇床中，固定18小时。③然后在3000rpm条件下离心10min，去掉上清液，将下层沉淀用无菌水水清洗2次。④将其置于培养皿内于30℃烘箱中烘干，即为吸附法制备的1#、2#、3#、4#、5#原油降解混合菌固体菌剂，将其浸泡在生理盐水中，4℃保存备用。实施例6原油降解混合菌固体菌剂对原油污染水体的降解将实施例4和实施例5所制备的1#、2#、4#、6#原油降解混合菌固体菌剂分别用于降解原油污染水体，具体如下：分别取5g包埋法制备的1#、2#、4#、6#原油降解混合菌固体菌剂和5g吸附法制备的1#、2#、4#、6#原油降解混合菌固体菌剂，分别接入1mLII号原油/100mL原油无机盐培养基中30℃、120r/min恒温培养7d后，测定其对原油的去除效果；其中，II号原油采自长庆油田，密度为0.87g/mL，且II号原油的最大吸收波长的测定和标准曲线图的绘制同实施例3中的I号原油，II号原油的标准曲线如图11所示。与此同时，分别采用与实施例4和实施例5相同的包埋法和吸附法制备海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1和缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8的固体菌剂，并使用海洋原油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1和缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8的固体菌剂对原油污染水体进行降解，并对比其与1#、2#、3#、4#、5#原油降解混合菌固体菌剂的降解效果进行对比，降解效果见表6。另外，分别取1.2mL和4.2mL的1#原油降解混合菌悬液、2#原油降解混合菌悬液、4#原油降解混合菌悬液、6#原油降解混合菌悬液，并分别接种于II号原油1mL/100mL无机盐液体培养基中，培养方法同实施例3，将其降解效果与固体制剂的降解效果进行对比，结果见表6。表6原油混合菌固体菌剂和原油混合菌菌悬液对II号原油污染水体的降解率由表6的试验结果可知，同一条件下，原油混合菌的固体菌剂以及其菌悬液、原油降解单菌6-10-1、1-8的固体菌剂以及其菌悬液对原油污染水体均具有降解修复的效果，且包埋法和吸附法制备的1#、2#、3#、4#、5#原油混合菌固体菌剂对原油污染水体的降解效果更佳。这是因为微生物固定化技术是将游离细胞定位于限定的区域内，使其保持活性并可反复利用的技术，且具有微生物密度高、作用时间长、抗不良环境能力强、微生物流失少等优点，所以单位固定化菌剂比液体菌剂降解效果更佳。另外，对比两种方法制备的固体菌剂的降解效果可知，同一条件下，吸附法制备的固体菌剂的降解效果优于包埋法制备的固体菌剂对II号原油污染水体的降解效果。这是因为两种方法制备的固体菌剂中的生物质炭上吸附的微生物量不相同所造成的，微生物数量越多，其固体菌剂对原油污染水体的降解效果越佳。实施例7原油降解混合菌固体菌剂对原油污染土壤的降解将实施例4和实施例5所制备的1#、2#、3#、4#、5#原油降解混合菌固体菌剂分别用于降解原油污染土壤，具体如下：原油污染土样：称取过1mm筛子晾干的土样，按原油污染度及称取土样的质量进行称取加入土样中搅匀，原油污染度为10g/kg，按照C：N：P为100：10：1比例拌入(NH4)2SO4和KH2PO4做为N源和P源。确切来说，微生物的营养物质还包括C，但是石油污染导致了C源的大量增加，足以保证其供应，不需要额外投加。土样的理化性质为：铵态氮5.75ppm，硝态氮4.70ppm；氮含量10.45ppm；磷含量16.41ppm；钾含量76.45ppm；有机质含量2.35％；pH为7.27。试验方法：分别取5g包埋法制备的2#和4#原油降解混合菌固体菌剂和5g吸附法制备的2#和4#原油降解混合菌固体菌剂，分别接入含水率控制在12％-15％的100gII号原油污染浓度为1％的土壤中、120r/min、30℃恒温培养7d、14d、21d后测定其对II号原油的去除效果，得出其降解率。土壤中石油烃含量测定方法，按以下步骤进行：①称取5g风干土样，放入50mL塑料离心管中。②用移液管加入10mL四氯化碳(分析纯)，超声萃取1h(温度不超过30℃)，浸提液经无水硫酸钠干燥后过滤到25mL容量瓶中，继续用2×10mL四氯化碳热浸俩次，每次20min，滤液经干燥后并入容量瓶，用四氯化碳定容。③分光光度计在288nm波长，以四氯化碳为参比测定样品的吸光度值，对照标准曲线反推原油的浓度。在进行2#和6#原油降解混合菌固体菌剂对原有污染土壤的降解效果的试验时，同时以缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8的固体菌剂作为对照样品，由试验结果得原油降解混合菌固体菌剂对原油污染土壤的降解结果如表7所示。表7原油降解混合菌固体菌剂对原油污染土壤的降解率由上述表7的试验结果可知，包埋法和吸附法制备的2#和4#原油混合菌固体菌剂对原油污染土壤也均具有降解修复的效果，且随着时间的延长，降解效率越佳，其与降解效果良好的缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)1-8的固体菌剂的降解效果对比，本发明的原油混合菌固体菌剂对原油污染土壤的降解效果更佳。采用上述实施例3-7的试验方法考察海洋原油降解菌6-10-1、缺陷短波单胞菌1-8、苏云金芽孢杆菌3-1或弯曲假单胞菌3的其它组合的混合菌对原油污染水体和原油污染土壤的降解修复作用，结果发现，其均具有降解修复作用。虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。SEQUENCELISTINGSEQIDNo.1<110>长安大学<120>一种原油降解混合菌、菌剂及其应用<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1402<212>DNA<213>海洋石油降解菌（Advenellakashmirensis）6-10-1<400>1GCAGCGGGAAAGTAGCTTGCTACTTTTGCCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATC60GGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTGGCTAATACCGCATACGCCC120TACGGGGGAAAGGGGGGGATCTTAGGACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTA180GCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGA240CCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATT300TTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGT360TGTAAAGCACTTTTGTCAGGGAAGAAAAGGTTTCGGATAATACCCGGAACTGATGACGGT420ACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCA480AGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTG540AAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTACCGAACTAGAGTATGTCAGAG600GGGGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCGATGGC660GAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG720ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGCCCTTCGGG780GCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAA840AACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGC900AACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCTGAAGAGATTTAGGAGTGC960TCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT1020TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACATTTAGTTGAGCAC1080TCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG1140CCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTTGCCAAACCGC1200AAGGTGGAGCTAATCTCATAAACCCGATCGTAGTCCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTG1260CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGG1320TCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAA1380CCGCAAGGGGGGCGATACCACG1402SEQIDNo.2<210>2<211>1206<212>DNA<213>缺陷短波单胞菌（Brevundimonasdiminuta）1-8<400>2GGTGAGTAACACGTGGGAACGTGCCTTTAGGTTCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTA60ATGCCGAATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCTTTAGAGCGGCCCGCGTCTGATT120AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATG180ACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT240CTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGA300TTGTAAAATTCTTTCACCGGGGACGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAA360CTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCG420TAAAGGGCGCGTAGGCGGATCGTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAA480CTGCCTTTGATACTGGCGATCTTGAGTATGAGAGAGGTATGTGGAACTCCGAGTGTAGAG540GTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACATACTGGCTCATTAC600TGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC660CGTAAACGATGATTGCTAGTTGTCGGGCTGCATGCAGTTCGGTGACGCAGCTAACGCATT720AAGCAATCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC780CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCACCTTT840TGACATGCCTGGACCGCCACGGAGACGTGGCTTTCCCTTCGGGGACTAGGACACAGGTGC900TGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA960CCCTCGCCATTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGAACTCTAATGGGACTGCCGGTGCTAAGC1020CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACAGGGTGGGCTACACACGT1080GCTACAATGGCAACTACAGAGGGTTAATCCTTAAAAGTTGTCTCAGTTCGGATTGTCCTC1140TGCAACTCGAGGGCATGAAGTGGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCCGCATGCCGCGGTGA1200ATACGTSEQIDNo.3<210>3<211>1404<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）3-1<400>3TAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCC60CATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCA120TGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAG180CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAT240CGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCT300TCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTC360GTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGT420ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA480AGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTG540AAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAG600GAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGC660GAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG720ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCG780CCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCT840GAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA900GCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTC960TCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT1020TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCA1080CTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATG1140CCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCG1200CGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCT1260ACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGG1320GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTA1380ACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAA1404SEQIDNo.4<210>4<211>1319<212>DNA<213>弯曲假单胞菌（Pseudomonasgeniculata）3<400>4AGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAA60TCTACTCTGTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACG120GGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTA180GTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAG240CCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGG300ACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTA360AAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCTGGCTAATACCCGGTTGGGATGACGGTACCC420AAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCG480TTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAG540CCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGTGTGGTAGAGGGTA600GCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAG660GCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA720GATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCAC780GCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAA840CTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAA900CGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCT960TCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGG1020TTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACT1080CTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGC1140CCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCG1200ACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCC1260ATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGG1319当前第1页1 2 3