一种用于强化高粘性微生物多糖发酵的系统装置及应用的制作方法

本发明涉及微生物发酵技术领域。更具体地，涉及一种用于强化高粘性微生物多糖发酵的系统装置及应用。

背景技术：

微生物胞外多糖是指微生物在代谢活动中分泌到细胞壁外的多糖或多糖混合物，是近20年来陆续开发的发酵新产品，具有特殊的流变学特性和优良的生物活性，安全无毒。许多高粘性微生物多糖因具有增稠性、稳定性、凝聚性和悬浮性而被广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。随着现代社会对环境保护与人类健康的重视程度不断增加，对于该类微生物多糖产品的需求量正在快速增长。据估计，全世界目前微生物多糖工业产值高达100亿元，其产量和年增长量均在10％以上，一些新兴高粘性多糖年增长量在30％以上，市场潜力巨大，其中黄原胶被认为是生产规模最大和用途最广的高粘性多糖。我国作为世界上高粘性微生物多糖生产量最大的国家，生产规模与生产设备、工艺控制技术等不相匹配，脱节现象严重，研发新型高粘性微生物多糖的生产技术和工艺，提高生产效率是一项紧迫任务。

微生物高粘性多糖的发酵过程多为好氧代谢过程，大多数产高粘性多糖的微生物是好氧菌，需要利用分子态的氧作为呼吸链电子传递系统末端的电子受体或作为中间体直接参与一些生物合成反应。高粘性微生物多糖呈现非牛顿流体的特性，随着发酵过程粘多糖的合成，发酵液粘度呈逐渐增加的趋势，使传质和混合受限，导致该类产品产率低、产品质量差、发酵周期长等。因此，如何强化高粘性多糖生物发酵过程中溶解氧传质一直是其规模化生产中需要解决的一项关键技术难题。

目前，通过强化溶解氧传质提高高粘性多糖产量和品质的方法主要有提高搅拌转速、增加气提流速、改进搅拌桨结构及添加携氧剂(如双氧水等)。但在实际运行过程中，依旧存在大量死区、混合效率低、传质受限等问题，导致产品分布不均，细胞活性变差。因此，改良并开发适用于高粘度发酵体系中的新型发酵设备尚需深入地研究。

本发明提出一种用于强化高粘性微生物多糖发酵的系统装置，并将其用于发酵生产高粘性胞外多糖，克服了现有高粘性多糖发酵技术传质和混合受限的缺陷，解决了高粘度多糖发酵周期长、转化率和产量低等问题，具有重要的现实意义和良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种用于强化高粘性微生物多糖发酵的系统装置。近年来超重力技术已经在吸收、解吸以及纳米材料制备等领域得到广泛应用。本发明是将超重力旋转床应用于强化微生物发酵过程领域，结合定-转子反应器与内循环反应器的优势研制了新型超重力发酵设备，强化溶解氧传质和气-液-固三相的混合。

本发明的另一个目的在于提供一种用于强化高粘性微生物多糖发酵的系统装置的应用。由于现有高粘性多糖发酵技术的传质和混合受到限制，并且存在高粘度多糖发酵周期长、转化率和产量低的问题，本发明提供了一种强化高粘性发酵体系的传质和混合的新方法与工艺。

为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于强化高粘性微生物多糖发酵的系统装置，所述系统装置包括罐体、罐盖、冷却夹层、空气分布器、第一电机、第二电机、超重力旋转床装置和耐高温液下泵；

罐体内部中心纵向设有转轴；转轴的上端穿出罐盖与第一电机传动连接，下端伸入罐体内与超重力旋转床装置连接；

所述超重力旋转床装置横向装于罐体内部中心，；所述超重力旋转床装置下端设有空气分布器，所述空气分布器为环形管道；罐体内部下端一侧设有耐高温液下泵；所述耐高温液下泵一端通过管路连接超重力旋转床装置，另一端连接第二电机的转轴；罐体外部设有冷却夹层。

优选地，所述超重力旋转床装置包括定子、转子、提升器、环状受液槽和液体分布器；所述定子由端盖和第一柱销组成；所述转子由转盘和第二柱销组成；

所述端盖固定连接罐体内壁，端盖的顶面设有环状受液槽，底面设有第一柱销和多个液体分布器；所述环状受液槽与多个液体分布器连接；所述多个液体分布器以转轴为中心等距离环绕设置；

所述转盘连接转轴，顶面设有第二柱销，底面的中心连接提升器；

所述第一柱销和第二柱销均为多层均布的同心环，且第一柱销和第二柱销交错设置；转子的转速为250～2500rpm。

耐高温液下泵安装在罐体底部，当发酵液粘度急剧升高时，依靠提升器作用将釜底发酵液提升至旋转床空腔中受到限制，使得发酵体系的循环液量降低，溶解氧传质效果急剧下降差。此时开启液下泵，可以将高粘性发酵液输送至旋转床的空腔中，再由转子转动将气液混合物甩出，发酵液流回釜底，进一步强化发酵液的传质与混合。

超重力旋转床依靠提升器随转轴一起旋转产生的提升力，将釜底发酵液提升至旋转床空腔中，再由转子的转动产生的离心力将液体分散并甩出，最后沿釜壁流回釜底，进行充分混合。发酵液进入定子和转子共存区时，由于定子扰流的作用，增加了流体表面更新速率及流体的湍动程度，同时改善了发酵液沿径向流动过程中的周向分布。

罐体中的液体分布器将液体在空腔内分段流出，再通过离心力的作用通过旋转床，达到强化过程。

优选地，所述罐盖一侧设有温度传感器、pH电极和溶解氧电极；

优选地，所述罐盖设有接种口、补料口和排气管路。

优选地，所述罐体外部下端设有封头，并在封头底部设有取料口。

优选地，所述空气分布器为环形管道，在该环形管道的一侧连有空气/蒸汽输入管路；所述空气/蒸汽输入管路穿出罐盖并设有阀门.

优选地，所述强化粘度范围为1.0×10³～1.6×10⁵mPa·s。

为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于强化高粘性微生物多糖发酵的系统装置的应用，采用所述装置对强化粘度范围为1.0×10³～1.6×10⁵mPa·s的胞外多糖生物进行发酵的工艺，包括如下步骤：

1)将保藏于4℃冰箱中的斜面菌种接入装有种子培养基的50mL/250mL摇瓶中，放置于恒温培养振荡器中，于温度为25～40℃和转速为150～200rpm下培养12～26h作为一级种子，将一级种子接入二级种子培养基中，同样条件下培养12～26h作为种子液。

2)将发酵培养基用自来水配制，从接种口倒入发酵罐罐体中，加入适量消泡剂，校正并接好pH电极和溶氧电极，从空气/蒸汽输入管路通蒸汽121℃灭菌20min。灭菌结束，待冷却至发酵温度，将培养好的种子液按8％～10％的接种量从接种口接入发酵罐罐体中；

3)发酵过程中转速范围为300～800rpm，通气量为2～6L/min。在发酵中后期，开启液下泵，依靠提升器和液下泵的双重作用，强化高粘性发酵液的传质和混合。

优选地，步骤2)中所述培养基中含有葡萄糖时，需使用灭菌锅115℃单独灭菌30min；所述发酵罐的罐压为0.03～0.05MPa，发酵温度为25℃～40℃；发酵过程中通过从补料口自动添加酸液或碱液控制pH值。

优选地，步骤3)中当发酵液粘度超过3.0×10⁴～5.0×10⁴mPa·s时，开启液下泵。

优选地，发酵过程中，可根据实际情况向发酵罐中以定期或流加的方式补加营养物质。

将培养好的种子液接种于优化好的发酵培养基中，由于转速和通气量是发酵过程中影响供氧的重要因素，发酵过程中根据溶解氧变化情况，适当提高转速和通气量。在发酵中后期，由于发酵液粘度急剧升高，单纯依靠提升器作用将釜底发酵液提升至旋转床空腔中受到限制，使得发酵体系的循环液量降低，溶解氧传质效果急剧下降差，当发酵液粘度超过3.0×10⁴～5.0×10⁴mPa·s时，开启液下泵，将高粘性发酵液输送至旋转床的空腔中，再由转子转动将气液混合物甩出。通过超重力旋转床装置和液下泵的双重作用强化发酵体系中溶解氧传递过程。

本发明的有益效果如下：

(1)采用超重力旋转床装置可以使气-液-固三相充分混合，能够保证溶解氧良好、均匀传递，有利于菌体的快速生长。

(2)系统装置内存在强烈循环，可以强化高粘性液相反应物的混合、扩散、传热和传质，同时减少死区出现。

(3)对于绝大多数非牛顿流体，有较均匀的剪切力，可降低表观粘度，强化氧的传递过程。

(4)当发酵液粘度急剧升高时，依靠提升器作用将釜底发酵液提升至旋转床空腔中受到限制，通过开启液下泵，可以将高粘性发酵液输送至旋转床的空腔中，再由转子转动将气液混合物甩出，发酵液流回釜底，进一步强化发酵液的传质与混合。

(5)通过强化溶解氧传质、气-液-固三相的混合，以及优化转速、通气量等工艺条件，可极大缩短发酵周期，提高粘多糖的产量及质量，并显著降低成本。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出用于强化高粘性微生物多糖发酵的系统装置的示意图。

图中，1-罐体、2-罐盖、3-补料口、4-接种口、5-排气管路、6-第二电机、7-第一电机、8-空气/蒸汽输入管路、9-温度传感器、10-pH电极、11-溶氧电极、12-环状受液槽、13-端盖、14-冷却夹层、15-转盘、16-空气分布器、17-取料口、18-耐高温液下泵、19-提升器、20-液体分布器、21-第一柱销、22-第二柱销。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1

参见图1所示，一种用于强化高粘性微生物多糖发酵的系统装置，包括罐体1、罐盖2、补料口3、接种口4、排气管路5、第二电机6、第一电机7、空气/蒸汽输入管路8、温度传感器9、pH电极10、溶氧电极11、环状受液槽12、端盖13、冷却夹层14、转盘15、空气分布器16、取料口17、耐高温液下泵18、提升器19、液体分布器20、第一柱销21、第二柱销22。

罐体1内部中心纵向设有转轴，转轴的上端穿出罐盖2与第一电机7传动连接，下端伸入罐体1内与超重力旋转床装置连接；超重力旋转床装置横向装于罐体1内部中心，包括定子、转子、提升器19、环状受液槽12和液体分布器20；定子由端盖13和第一柱销21组成；转子由转盘15和第二柱销22组成；端盖13固定连接罐体1内壁，端盖13的顶面设有环状受液槽12，底面设有第一柱销21和多个液体分布器20；环状受液槽12与多个液体分布器20连接；多个液体分布器20以转轴为中心等距离环绕设置；转盘15连接转轴，顶面设有第二柱销22，底面的中心连接提升器19；第一柱销21和第二柱销22均为多层均布的同心环，且第一柱销21和第二柱销22交错设置；

超重力旋转床装置下端设有空气分布器16，空气分布器16为环形管道，在该环形管道的一侧连有空气/蒸汽输入管路8；空气/蒸汽输入管路8穿出罐盖2并设有阀门；罐体1内部下端一侧设有耐高温液下泵18；耐高温液下泵18一端通过管路连接超重力旋转床装置，另一端连接第二电机6的转轴；罐体1外部设有冷却夹层14；

罐盖2一侧设有温度传感器9、pH电极10和溶氧电极11；罐盖设有接种口4、补料口3和排气管路5；罐体1外部下端设有封头，并在封头底部设有取料口17。

采用图1所示装置发酵生产高粘性胞外多糖，包括如下具体步骤：

1)将保藏于4℃冰箱中的斜面菌种接入装有种子培养基的50mL/250mL摇瓶中，放置于恒温培养振荡器中，于温度为25～40℃和转速为150～200rpm下培养12～26h作为一级种子，将一级种子接入二级种子培养基中，同样条件下培养12～26h作为种子液。

2)将发酵培养基用自来水配制，从接种口4加入到发酵罐的罐体1中，校正并接好pH电极10和溶氧电极11，从空气/蒸汽输入管路8通蒸汽121℃灭菌20min，若培养基中含有葡萄糖需使用灭菌锅单独灭菌(115℃，30min)。灭菌结束，待冷却至发酵温度，分别将葡萄糖溶液和培养好的种子液从接种口4倒入发酵罐的罐体1中。发酵罐的罐压为0.03～0.05MPa，发酵温度为25℃～40℃。发酵过程中通过从补料口3自动添加酸液或碱液控制pH值为6.0～7.0。

3)为保证体系中充足的溶解氧，同时又能提高混合效率，发酵过程中转速范围为300～800rpm，通气量为2～6L/min。在发酵中后期，由于发酵液粘度急剧升高，当粘度达4×10⁴～5.0×10⁴mPa·s时，开启液下泵，依靠提升器和液下泵的双重作用，强化高粘性发酵液的传质和混合。

实施例2

以黄原胶为代表采用实施例1的系统装置强化粘度范围为5.0×10⁴～1.6×10⁵mPa·s的胞外多糖生物发酵过程，具体步骤如下：

斜面培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉粉3g/L、琼脂20g/L。

种子培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉粉3g/L。

发酵培养基：蔗糖20g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，氯化钾25g/L，硫酸镁8g/L，碳酸钙10g/L，柠檬酸0.25g/L，磷酸二氢钾0.06g/L。

1)将保藏于4℃冰箱中的斜面菌种黄单胞菌BT-112接入装有种子培养基的摇瓶中(50mL/250mL)，放置于恒温培养振荡器中，于30℃、190rpm的条件下培养26h作为一级种子，将上述种子液接入二级种子培养基中，同样条件下培养24h。

2)将发酵培养基用自来水配制，加入到图1所示装置中，校正并接好pH电极和溶氧电极，通蒸汽121℃灭菌20min，葡萄糖单独灭菌(115℃，30min)。灭菌结束，待冷却至发酵温度30℃，将培养好的种子液按8％的接种量接到发酵罐中。发酵过程中采用3mol/L的NaOH自动补料维持pH为6.8～7.0，罐压维持0.04～0.05MPa，发酵72h。

3)为保证体系中充足的溶解氧，同时又能提高混合效率，发酵过程中转速范围为300～800rpm，通气量为2～5L/min。在发酵中后期，由于发酵液粘度急剧升高，当粘度达5×10⁴mPa·s左右时，开启液下泵，依靠提升器和液下泵的双重作用，强化高粘性发酵液的传质和混合。

本发明的具体实施效果见表1。

表1超重力强化黄原胶生物发酵的工艺条件及实施效果

从表中可以看出，采用本发明提出的适用于高粘性胞外多糖发酵体系的系统装置和方法，当转速为300～800rpm、通气量为2～5L/min时，黄原胶的产量最高能达到42.7g/L，表观粘度最高达1.39×10⁵mPa·s，转化率最高达85.4％，发酵周期为48h。

实施例3

以类透明质酸为代表采用实施例1的系统装置强化粘度范围为1.0×10³-5.0×10⁴mPa·s的胞外多糖生物发酵过程，具体步骤如下：

斜面培养基：蔗糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，谷氨酸钠2g/L，琼脂20g/L。

种子培养基：蔗糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，谷氨酸钠2g/L，碳酸氢钠1g/L。

发酵培养基：蔗糖40g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，谷氨酸钠2.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L。

1)将保藏于4℃冰箱的斜面菌种克雷伯氏菌H-112接入种子培养基中于34℃、160rpm的条件下培养13h作为一级种子，将上述种子液接入二级种子培养基中，34℃、160rpm的条件下培养12h。

2)将发酵培养基用自来水配制，加入到如图1所示装置中，校正并接好pH电极和溶氧电极，通蒸汽121℃灭菌20min。灭菌结束，待冷却至发酵温度32℃。将培养好的种子液接到发酵罐中，发酵过程中采用3mol/L的NaOH自动补料控制pH为6.0，罐压维持0.04～0.05MPa，发酵80h。

3)为保证体系中充足的溶解氧，同时又能提高混合效率，转速范围为300～600rpm，通气量为2～6L/min。

本发明的具体实施效果见表2。

表2超重力强化类透明质酸生物发酵的工艺条件及实施效果

从表中可以看出，采用本发明提出的适用于高粘性胞外多糖发酵体系的系统装置和方法，当转速为300～600rpm、通气量为2～6L/min时粘多糖A的产量最高能达到6.3g/L，表观粘度最高能达到4.0×10⁴mPa·s，转化率最高达15.8％，发酵周期60h。

对比例1

采用传统搅拌式发酵罐发酵生产黄原胶，具体步骤如下：

斜面培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉粉3g/L、琼脂20g/L。

种子培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉粉3g/L。

发酵培养基：蔗糖20g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨4g/L，氯化钾25g/L，硫酸镁8g/L，碳酸钙10g/L，柠檬酸0.25g/L，磷酸二氢钾0.06g/L。

1)将保藏于4℃冰箱的斜面菌种黄单胞菌BT-112接入装有种子培养基的烧瓶中(50mL/250mL),放置于恒温培养振荡器中，于30℃、190rpm的条件下培养26h作为一级种子，将上述种子液接入二级种子培养基中，同样条件下培养24h。

2)将发酵培养基用自来水配制，加入到传统搅拌式发酵罐中，校正并接好pH电极和溶氧电极，通蒸汽121℃灭菌20min,葡萄糖单独灭菌(115℃，30min)。灭菌结束，待冷却至发酵温度30℃，将培养好的种子液按10％的接种量接到发酵罐中，发酵过程中采用3mol/L的NaOH自动补料维持pH为6.8～7.0，罐压维持0.04～0.05MPa,发酵72h。

3)发酵过程中转速范围为300～800rpm，通气量为2～5L/min。

采用传统搅拌式发酵罐微生物发酵生产黄原胶的具体实施效果见表3。

表3传统搅拌式发酵罐发酵生产黄原胶的工艺条件及实施效果

对比表1的实施效果，可以看出在所分析的转速和通气量的范围内，采用本发明提出的装置发酵生产黄原胶，产量提高6～7g/L，表观粘度明显增大，转化率提高12％～15.2％，发酵周期缩短12小时左右。表明本发明提出的系统装置强化粘度范围为5.0×10⁴～1.6×10⁵mPa·s的胞外多糖生物发酵过程，可以缩短发酵周期，并提高微生物多糖的产量。

对比例2

采用传统搅拌式发酵罐发酵生产类透明质酸，具体步骤如下：

斜面培养基：蔗糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，谷氨酸钠2g/L，琼脂20g/L。

种子培养基：蔗糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，谷氨酸钠2g/L,碳酸氢钠1g/L。

发酵培养基：蔗糖40g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，谷氨酸钠2.5g/L,碳酸氢钠0.5g/L。

1)将保藏于4℃冰箱的斜面菌种克雷伯氏菌H-112接入种子培养基中于34℃、160rpm的条件下培养13h作为一级种子，将上述种子液接入二级种子培养基中，同样的条件下培养12h。

2)将发酵培养基用自来水配制，加入到搅拌式发酵罐中，校正并接好pH电极和溶氧电极，通蒸汽121℃灭菌20min，灭菌结束，待冷却至发酵温度32℃，将培养好的种子液按10％的接种量接到发酵罐中，发酵过程中采用3mol/L的NaOH自动补料维持pH为6.0，罐压维持0.04～0.05MPa，发酵80h。

3)发酵过程中转速范围为300～600rpm,通气量为2～6L/min。

采用传统搅拌式发酵罐微生物发酵生产类透明质酸的具体实施效果见表4。

表4传统搅拌式发酵罐发酵生产类透明质酸的工艺条件及实施效果

对比表2实施效果，可以看出在所分析的转速和通气量的范围内，采用本发明提出的装置发酵生产类透明质酸，产量提高1～1.8g/L，表观粘度明显增大，转化率提高2.5％～4.5％，发酵周期缩短10小时左右。表明本发明提出的系统装置强化粘度范围为1.0×10³～5.0×10⁴mPa·s的胞外多糖生物发酵过程，可以缩短发酵周期，并提高微生物多糖的质量。

对比例3

生产黄原胶，采用装置以及实施步骤同实施例2，区别在于：

步骤3)中不开启液下泵。

具体实施效果见表5。

表5不开启液下泵生产黄原胶的工艺条件及实施效果

对比表1实施效果，可以看出在所分析的转速和通气量的范围内，采用本发明提出的装置，但是不开启液下泵发酵生产类黄原胶，产量降低9～12g/L，表观粘度明显降低，转化率降低15％～25％，发酵周期缩短到36小时左右，这是因为发酵后期粘度增大，单纯依靠提升器的作用不能将发酵液提至旋转床中，致使发酵终止。表明本发明提出的系统装置，如果不启用液下泵，虽然发酵周期缩短，但微生物多糖的质量降低。

综上所述：超重力旋转床装置和液下泵之间相互配合，协同作用，使其对微生物多糖发酵的作用效果最优。本发明的装置可极大缩短发酵周期，提高粘多糖的产量及质量，并显著降低成本。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。