一种筛选新型脂肪酸合成抑制剂的方法与流程

本发明属于药物筛选领域，特别涉及一种利用产油微生物为模型筛选脂肪酸合成抑制剂的方法。

背景技术：

在体内各组织中，脂肪酸的合成参与细胞增殖、分化和机体能量代谢、脂类代谢等重要生命活动。在脂肪组织，脂质物质的主要合成场所肝脏，以及多种脂质合成密切相关的癌症如乳腺癌、前列腺癌组织中脂肪酸合成相关酶都高度表达。因此，抑制脂肪酸的合成成为治疗肥胖及肿瘤的新靶点。

至今，已批准上市并用于临床治疗肥胖的药物仅有三种。即5-羟色胺去甲肾上腺素重摄取抑制剂——西布曲明、选择I型大麻受体拮抗剂——利莫那班和胰脂肪酶抑制剂——奥利司他。这些药物对肥胖症有较好的疗效，但也会产生一些副作用。因此，为了研究开发出副作用小、安全性高，更符合肥胖患者需求的脂肪酸抑制剂，有必要建立一种高效、快速、简单的脂肪酸合成抑制剂筛选方法。

目前，筛选脂肪酸合成抑制剂可以使用细胞实验或动物实验来完成。但是该手段培养周期长、条件严格、费用相对较高。因此建立一个高效、准确筛选脂肪酸合成抑制剂的体外方法是十分必要的。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种适合于在体外环境中，直观、快速、高效、低成本的筛选脂肪酸合成抑制剂的方法，该方法利用产油微生物作为一个有效的工具从植物提取物、天然产物以及各种化合物中筛选出新型的脂肪酸合成抑制剂，同时可测量蛋白量以及生物量确保所筛选的抑制剂对菌体的正常生长影响很小。脂肪酸合成抑制剂的寻找对于治疗脂肪相关疾病如肥胖、癌症具有一定的帮助。

为达到上述目的，提供以下技术方案：

本发明所述筛选脂肪酸合成抑制剂的方法，是以产油微生物为工具，经过培养活化后，等量加入微孔板中，同时在相应的微孔中加入脂质染色剂以及所要筛选的抑制剂，培养一段时间后观察并用图像分析软件以及分光光度计或酶标仪对微孔显色结果进行分析，染色越浅的微孔对应的脂肪酸合成抑制剂的抑制效果越好。

该方法中，微孔的染色深度直观地显示了相应的微孔在培养一段时间后脂肪酸的含量，通过对显色结果分析，可知染色越浅的微孔对应的脂肪酸合成抑制剂的抑制效果越好。

在具体操作时，本发明所述筛选脂肪酸合成抑制剂的方法，包括以下步骤：

1)产油微生物活化培养，并用打碎机打匀菌液；

2)将步骤1)中所述活化的菌液等量加入微孔板中，在实验组中等量加入将要筛选的抑制剂，在对照组和实验组中等量加入染色剂；

3)将步骤2)中所述微孔板中的菌体培养72小时后肉眼观察结果，将有明显颜色变化的筛选抑制剂用图像分析软件及酶标仪对显色结果进行分析，染色越浅的微孔对应的脂肪酸合成抑制剂的抑制效果越好。

上述的方法中，还包括步骤4)将筛选出的抑制剂加入菌体培养基培养菌体，检测生物量、蛋白量的变化，检测抑制剂对菌体正常生长情况的影响。

上述的方法中，步骤1)中产油微生物可以是高山被孢霉、裂殖壶菌、卷枝毛霉中的至少一种；且所述产油微生物采用液体培养基培养。

上述的方法中，步骤2)中设计对照组与实验组，对照组为只加菌液和只加菌液、染色剂的微孔，实验组为加入菌液、抑制剂和染色剂的微孔。

上述的方法中，步骤2)中脂肪酸染色剂为TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)，加入TTC的质量与液体培养基的体积之间的百分比为0.05％～0.5％，脂质含量越多则TTC染色结果越红。

上述的方法中，步骤2)中抑制剂加入量根据其性能强弱及降解能力添加。

上述的方法中，步骤3)中所使用的图像分析软件可以是image j，Adobe Photoshop CS6中的至少一种。

本发明通过上述筛选脂肪酸抑制剂的方法，筛选除了一种新的脂肪酸抑制剂丁香乙醇提取物，经过检测可知丁香乙醇提取物可降低高山被孢霉中的C14.0，C16.0，C18.0等多种脂肪酸，可降低人类肝癌细胞HepG2与人前列腺癌细胞LNCaP中总脂肪酸的生成量，同时对于各种种类的脂肪酸的量也有明显的降低作用。

本发明使用产油微生物作为筛选工具，由于高山被孢霉拥有一套完整的脂质合成基因，已被发现可用于高产脂肪酸。因此，高山被孢霉可以作为一个有效的工具用来筛选新型的脂肪酸合成抑制剂。相对于动物、细胞实验，所需周期短，培养条件相对简易，在筛选多种不同抑制剂时使用微孔板操作更加方便。

本发明在大量筛选未知物抑制剂前期可直接用肉眼分辨颜色差别，选出可行性新型抑制剂后使用图像分析软件、酶标仪及分光光度计对显色结果进行分析，不需要高效液相色谱等昂贵复杂仪器设备。因此，结果观察直观、简单、方便、快速。本发明在筛选脂肪酸抑制剂抑制效果的同时，还检测了菌种生物量、蛋白量是否受到影响，影响小的抑制剂在一定程度上保证了其温和性。筛选得到的抑制剂对于医学上治疗肥胖及其相关疾病有一定的研究作用。

综上可知，本发明具有以下有益效果：1、本发明采用产油微生物为模板来筛选脂肪酸合成抑制剂，周期短、培养条件简易、筛选操作方便；2、可用肉眼分别颜色差别，也可以结合仪器检测，结果观察直观、简单、方便、快速；3、还通过检测菌种蛋白量以及生物量确保所筛选的抑制剂对生物体的影响较小；4、丁香乙醇提取物可用作脂肪酸抑制剂，脂肪酸合成抑制剂的寻找对于治疗脂肪相关疾病如肥胖、癌症具有一定的帮助。

附图说明

图1为本发明实施例1中使用TTC筛选脂肪酸抑制剂时微孔板的图像；

图2为本发明实施例2中使用TTC筛选脂肪酸抑制剂时微孔板的图像；

图3为本发明实施例3中测定的脂肪酸合成抑制剂丁香乙醇提取物对高山被孢霉脂肪酸含量的减少结果；

图4为本发明实施例4中测定的脂肪酸合成抑制剂丁香乙醇提取物对哺乳动物前列腺癌细胞LNCaP脂肪酸含量的减少结果；

图5为本发明实施例5中测定的脂肪酸合成抑制剂丁香乙醇提取物对哺乳动物肝癌细胞HepG2脂肪酸含量的减少结果；

其中ns：P＞0.05，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：

将已知的脂肪酸合成抑制剂Cerulenin溶于二甲亚砜中并保存于-20℃，作为实验阳性参照物备用，TTC粉末以5mg/mL的浓度溶解于无菌水中保存。

设计等量的二甲亚砜溶液作为对照组，用于表明二甲亚砜对菌体生长没有影响。

下面进行脂肪酸抑制剂的筛选：

1)将培养于Broth液体培养基(葡萄糖，20g/L；蛋白胨酵母提取物，50g/L；KH₂PO₄，1g/L；MgSO₄，0.25g/L；KNO₃，10g/L)中的高山被孢霉用打碎机打碎，并用紫外分光光度计测定吸光度(OD)稀释至所需浓度，分别为OD＝0.2、OD＝0.5、OD＝0.8；

2)将上述菌液等量接种于96孔板中。每种浓度的高山被孢霉孔设置加入不同浓度TTC组(TTC的浓度分别为0.02％，0.05％，0.1％，0.15％)与加入TTC跟阳性参照物Cerulenin(1μM)组；

3)上述96孔板在28℃下培养72小时后，肉眼观察结果，将有明显颜色变化的筛选抑制剂用图像分析软件及酶标仪对显色结果进行分析，染色越浅的微孔对应的脂肪酸合成抑制剂的抑制效果越好。图1为加入不同浓度TTC(0.02％，0.05％，0.1％，0.15％)和一定浓度的阳性对照抑制剂(C75，Ceulenin)于微孔板不同浓度的高山被孢霉培养液中(接种OD为0.2，0.5，0.8)，28℃培养72小时。

实验结果：根据颜色变化选择最优的筛选条件为0.05％TTC与接种OD为0.5的高山被孢霉。

实施例2：

在96孔板中接种实施例2中的OD为0.5的打碎的高山被孢霉，并在相应微孔中加入0.5％的TTC溶液和适量药食同源功能成分或化学合成类药物，并设置溶剂阴性对照组与Cerulenin(1μM)和C75(1μM)阳性对照组，放置于28℃暗处培养72小时，观察微孔颜色变化。

图2为本实施例使用TTC筛选脂肪酸抑制剂时微孔板的图像。

实验结果：加入阳性参照物的微孔红色明显较弱，说明脂肪酸合成量减少，证明了该方法的可行性。其中有几个天然产物(丁香乙醇提取物)及化和药物的微孔红色较弱，说明筛选到了一定的脂肪酸合成抑制剂成分。

实施例3：

实施例2中筛选到的丁香乙醇提取物对高山被孢霉脂肪酸含量的减少作用测定：

1)菌体培养：M.alpina ATCC32222接种于Potato Dextrose Agar(PDA)培养基上在28℃条件下培养20-30天。加入5mLBroth培养基，将孢子从壁上刮下。

吸取3mL孢子悬浮液到45mL的Broth培养基中，在25℃、200rpm的摇床中培养两天。第三天加入丁香乙醇提取物(200mg/L)，并设置DMSO溶剂对照组，继续培养4小时。

2)菌体脂肪酸含量测定：收取菌体并过滤，冻干后菌体研磨并称重。约50mg菌体中加入标准样品用来定量。随后加入HCl，80℃水浴1小时。-80℃冷冻15分钟，重复一次后于80℃水浴30分钟。加入甲醇与氯仿萃取，离心分离，用氮气将溶剂吹干后加入10％的盐酸甲醇溶液甲酯化，60℃，2小时。甲酯化后加入正己烷萃取，分离后将溶剂用氮气吹干后溶于1mL正己烷，得到样品用GCMS分析。

图3为本实施例中测定的脂肪酸合成抑制剂丁香乙醇提取物对高山被孢霉脂肪酸含量的减少结果。

实验结果：该发放筛选到的脂肪酸合成抑制剂丁香乙醇提取物可降低高山被孢霉中的C14.0，C16.0，C18.0等多种脂肪酸。

实施例4：

实施例2中筛选到的丁香乙醇提取物对对哺乳动物前列腺癌细胞LNCaP脂肪酸含量、哺乳动物肝癌细胞HepG2脂肪酸含量的减少作用测定：

1)肿瘤细胞株：人类肝癌细胞HepG2及人前列腺癌细胞LNCaP为本实验室冻存。细胞培养基MEM和RPMI1640及牛血清为Thermo公司产品。

2)受试药物：取丁香干物料粉碎，丁香与75％乙醇比为1:20混合，37℃、200rpm震荡提取12小时，过滤且残渣重复上述步骤两次，合并三次滤液旋转蒸发，以100mg/mL浓度溶于二甲亚砜用于细胞实验。

3)细胞培养：细胞用含体积分数10％的胎牛血清及1％的双抗(康青霉素和抗链霉素)的RPMI1640或MEM培养液常规培养。每72小时用0.25％胰酶消化，1:2～1:3扩瓶传代。传代后24小时细胞贴壁，加入丁香乙醇提取物(100mg/L)，并设置溶剂对照组，培养三天。

4)细胞脂肪酸提取：倒掉细胞中培养基，加入PBS刮下细胞，同时加入标准品用来定量。加入4mL甲醇，2mL氯仿，用盐酸调节pH，室温反应1小时，加入2mL水与2mL氯仿震荡离心，分离。重复该步骤。得到物质合并，氮气吹干，加入2mL乙醇与200μL 50％KOH，75℃水浴1小时。加入2mL水与6mL正己烷震荡离心，加入6mL正己烷，震荡离心并分离，氮气吹干。加入2mlNaOH甲醇，100℃水浴，加入BF₃，100℃水浴。加入4mL正己烷，2mL饱和NaCl，震荡离心，分离后GCMS分析。

图4为本实施例中测定的脂肪酸合成抑制剂丁香乙醇提取物对哺乳动物前列腺癌细胞LNCaP脂肪酸含量的减少结果；图5为实施例中测定的脂肪酸合成抑制剂丁香乙醇提取物对哺乳动物肝癌细胞HepG2脂肪酸含量的减少结果。其中ns：P＞0.05，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

实验结果：该方法筛选到的脂肪酸合成抑制剂丁香乙醇提取物可降低人类肝癌细胞HepG2与人前列腺癌细胞LNCaP中总脂肪酸的生成量，同时对于各种种类的脂肪酸的量也有明显的降低作用。