本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种HIV重组抗原、表达基因、表达载体以及HIV检测试剂盒。
背景技术：
HIV(Human immunodeficiency virus)的感染在全球广泛流行，严重威胁着人们的生命健康，因此，必须对HIV感染进行监控。研发简便、准确、快速的检测产品，及早检测艾滋病病毒感染，杜绝艾滋病的传播成为预防控制艾滋病的首要手段。
目前国内外用于检测艾滋病的方法有免疫学检验、核酸检测技术等。每种检测技术各有优缺，免疫学检测因为其操作简单、灵敏度和特异性好、成本低廉、检测时间短等特点，已经被各大血站、血液制品厂、医院等医疗结构所普遍采用，是应用最广的一项检测技术。
免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。
免疫分析经历了放射免疫检验、荧光免疫检验、酶标免疫检验等不同时期，化学发光免疫检验是免疫分析发展的一个新阶段，它环保、快速、准确的特点已得到人们的普遍认识。
放射免疫法(RIA)在中国兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院，产品处于衰退期，在国际上现已基本退出临床应用，产品生命周期已终结。酶联免疫法(ELISA)，在中国兴起于20世纪80年代，现普遍使用于各级临床机构，为我国临床免疫诊断的基本方法，产品处于成熟期；国际上兴起于20世纪70年代，现仍在临床应用，产品处于衰退期。化学发光免疫法(CLIA)20世纪90年代导入中国，现个别较大医院开展个别项目，产品处于导入期或成长期；国际上兴起于20世纪80年代，现已被临床普遍使用，成为临床免疫诊断的支柱方法产品处于成熟期，仪器自动化程度高，试剂系列化状态。
化学发光免疫分析根据其标记物的不同可分为三大类，即直接化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析、电化学发光免疫分析法。其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶(AP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂过量，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长，故检测方式简单、成本较低。
目前，对于HIV的检测方法较多，其中最常用的有ELISA法、胶体金，核酸检测等，随着医疗技术的发展，化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)开始用于HIV抗体的检测。相较于ELISA法，1)CMIA法的灵敏度更高：其灵敏度可达10-16mol/L(RIA为10-12mol/L)，又如化学发光底物(如AMPPD)可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5х105倍，因而对于血清中HIV抗体浓度较低的标本也可有效检出，减少假阴性的发生；2)CMIA具有更宽的线性动力学范围：发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系，这与显色的酶免疫分析吸光度(OD值)为2.0的范围相比，优势明显，虽然RIA也有较宽的线性动力学范围，但放射性限制了其应用；3)光信号持续时间长：辉光型(glow type)的CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。简化了实验操作及测量。4)使用期长：有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一个月，而酶联的底物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以提高劳动效率，也利于推广应用。5)CMIA法免去了ELISA反复加样、洗板等操作，可有效降低变异系数，提高可重复性；6)CMIA法采用全自动酶免疫分析仪，自动化程度高，可用于大量标本的快速、准确检测。
然而，目前市场上并没有特异性和灵敏度较好的采用CMIA法的HIV检测试剂盒出现。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种灵敏度较好的、可以应用于CMIA法检测HIV的HIV重组抗原。
此外还有必要提供用于表达上述HIV重组抗原的表达基因和表达载体，以及含有上述HIV重组抗原的HIV检测试剂盒。
一种HIV重组抗原，包括依次连接的HIV-2亚型段和HIV-1亚型段；
所述HIV-1亚型段为由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码得到的多肽；
所述HIV-2亚型段为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码得到的多肽。
在一个实施例中，所述HIV重组抗原还包括连接在所述HIV-2亚型段远离所述HIV-1亚型段的一端的OSMY。
一种表达基因，包括依次连接的HIV-2片段和HIV-1片段；
所述HIV-1片段的序列如SEQ ID No.1所示；
所述HIV-2片段的序列如SEQ ID No.2所示。
在一个实施例中，所述表达基因还包括连接在所述HIV-2片段远离所述HIV-1片段的一端的用于表达OSMY的序列。
一种表达载体，包括上述的表达基因。
在一个实施例中，所述表达载体为pET-24a(+)或pET-21(+)。
一种HIV检测试剂盒，包括上述的HIV重组抗原与磁微球的偶联物以及标记物标记的所述HIV重组抗原。
在一个实施例中，所述HIV重组抗原与磁微球的偶联物中，所述HIV重组抗原与磁微球通过化学交联法偶联。
在一个实施例中，所述HIV重组抗原与磁微球的偶联物中，磁微球带有氨基和羧基中至少一种。
在一个实施例中，所述标记物标记的所述HIV重组抗原中，标记物为碱性磷酸酶。
这种HIV重组抗原应用于HIV检测试剂盒后，通过CMIA法检测HIV抗体，经过试验验证，HIV检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、可测定范围宽、检测自动化程度高和无环境污染等优点。
附图说明
图1为实施例1中得到的第一HIV重组抗原以及第二HIV重组抗原的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为marker，泳道2为第一HIV重组抗原，泳道3为第二HIV重组抗原。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明公开了一实施方式的HIV重组抗原，包括依次连接的HIV-2亚型段和HIV-1亚型段。
HIV-2亚型段为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码得到的多肽。
HIV-1亚型段为由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码得到的多肽。
优选的，上述HIV重组抗原还包括连接在HIV-2亚型段远离HIV-1亚型段的一端的OSMY。即，上述HIV重组抗原包括依次连接的OSMY、HIV-2亚型段和HIV-1亚型段。
本发明还公开了用于表达上述HIV重组抗原的表达基因。
用于表达上述HIV重组抗原的表达基因包括依次连接的HIV-2片段和HIV-1片段。
HIV-1片段的序列如SEQ ID No.1所示，记为HⅠ。
HIV-2片段的序列如SEQ ID No.2所示，记为HⅡ。
优选的，用于表达上述HIV重组抗原的表达基因还包括连接在HIV-2片段远离HIV-1片段的一端的用于表达OSMY的序列(可记为OSMY片段)。
上述基因片段为采用基因工程技术手段，通过大量分子生物学分析软件分析筛选出来的优势表位基因区段。
HⅠ为HIV-1亚型的gp41蛋白的优势表位基因区段。
HⅡ为HIV-2亚型的gp36蛋白的优势表位基因区段。
本发明还公开了包括上述表达基因的表达载体。
包括上述表达基因的表达载体可以为pET-24a(+)或pET-21(+)。
具体的，上述表达基因的表达载体多克隆位点C端有His-tag。
包括上述表达基因的表达载体可以通过如下操作得到：按照上述表达基因的序列设计引物扩增目的片段，OSMY片段上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI酶切位点，HⅡ片段上游引物带有EcoRI位点，下游引物带有SalI酶切位点，HⅠ片段上游引物带有SalI位点，下游引物带有XhoI酶切位点，PCR的片段经回收用相应的限制性内切酶酶切，OSMY片段连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表达载体pET-24a(+)中，得到重组质粒pET-24a(+)-OSMY，之后用EcoRI及SalI酶切pET-24a(+)-OSMY，将HⅡ片段连入，之后用SalI及XhoI酶切pET-24a(+)-OSMY-HⅡ，将HⅠ片段连入，转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS，得到包括上述表达基因的表达载体pET-24a(+)-OSMY-HⅡ-HⅠ。经测序正确后用EcoRI及XhoI酶切重组质粒pET-24a(+)-OSMY-HⅡ-HⅠ，切下片段HⅡ-HⅠ，连入载体pET-21(+)中，转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS，得到包括上述表达基因的表达载体pET-21(+)-HⅡ-HⅠ。
包括上述表达基因的表达载体pET-21(+)-HⅡ-HⅠ以及包括上述表达基因的表达载体pET-24a(+)-OSMY-HⅡ-HⅠ均可以用于上述HIV重组抗原的表达。
上述HIV重组抗原可以应用于HIV检测领域，下面以应用于HIV检测试剂盒为例进行简单介绍。
本发明公开了一实施方式的HIV检测试剂盒，包括上述HIV重组抗原与磁微球的偶联物以及标记物标记的上述HIV重组抗原。
优选的，HIV重组抗原与磁微球的偶联物中，HIV重组抗原与磁微球通过化学交联法偶联。
优选的，HIV重组抗原与磁微球的偶联物中，磁微球带有氨基和羧基中至少一种。
优选的，标记物标记的HIV重组抗原中，标记物为碱性磷酸酶。
这种HIV检测试剂盒为第三代HIV检测试剂，通过CMIA法检测HIV抗体。将标记物(碱性磷酸酶)标记在HIV重组抗原上得到标记物标记的HIV重组抗原，将HIV重组抗原与磁微球偶联得到HIV重组抗原与磁微球的偶联物。HIV重组抗原与磁微球的偶联物、样本中HIV抗体以及标记物标记的HIV重组抗原形成的复合物，可以与发光底物(例如，3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷(AMPPD))作用，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。
经过试验验证，这种HIV抗体检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、可测定范围宽、检测自动化程度高和无环境污染等优点。
以下为具体实施例。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
实施例1、HIV重组抗原的制备
采用基因工程技术手段，通过大量的分子生物学分析软件分析筛选出HIV-1的gp41,HIV-2的gp36蛋白的优势表位基因区段，序列为SEQ ID No.1(命名为HⅠ)，SEQ ID No.2(命名为HⅡ)，设计引物扩增目的片段。OSMY全长片段上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI酶切位点，HⅡ片段上游引物带有EcoRI位点，下游引物带有SalI酶切位点，HⅠ片段上游引物带有SalI位点，下游引物带有XhoI酶切位点，PCR的片段经回收用相应的限制性内切酶酶切，OSMY片段连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表达载体pET-24a(+)中，得到重组质粒pET-24a(+)-OSMY，之后用EcoRI及SalI酶切pET-24a(+)-OSMY，将HⅡ片段连入，之后用SalI及XhoI酶切pET-24a(+)-OSMY-HⅡ，将HⅠ片段连入，转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS，得到包括上述表达基因的表达载体pET-24a(+)-OSMY-HⅡ-HⅠ。经测序正确后用EcoRI及XhoI酶切重组质粒pET-24a(+)-OSMY-HⅡ-HⅠ，切下片段HⅡ-HⅠ，连入载体pET-21(+)中，转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS，得到包括上述表达基因的表达载体pET-21(+)-HⅡ-HⅠ。
含有表达载体pET-21(+)-HⅡ-HⅠ的BL21(DE3)pLysS菌，用含100μg/mL氨苄青霉素(上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简称生工，货号A100741)的500mL LB培养基37℃振荡培养至OD600＝1.0左右，用终浓度为0.25mM的IPTG(生工，货号A100487)28℃诱导6小时。4℃7000rpm离心3分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20mL 50mM Tirs-HCl，pH8.0悬浮，超声破碎，4℃12000g离心20分钟，收集上清过Q sepharose fast flow柱(GE)(BufferA:50mM Tirs-HCl，pH8.0；BufferB:50mM Tirs-HCl+1MNaCl，pH8.0)。用5倍柱床体积的Buffer A平衡Q柱之后，加入裂解上清液，用5倍介质体积的Buffer A洗去未结合的蛋白，之后用10％BufferB洗去杂蛋白，35％BufferB洗脱目的蛋白；为了提高纯度及抗原特异性，Q柱洗脱后的样品继续过NI柱(BufferA:50mM Tirs-HCl，350mM NaCl，pH8.0；BufferB:50mM Tirs-HCl，350mM NaCl，200mM咪唑pH8.0，)，用5倍柱床体积的Buffer A平衡Ni-NTA亲和柱之后，加入Q柱洗脱蛋白样，用5倍介质体积的Buffer A洗去未结合的蛋白，之后用10％BufferB洗去杂蛋白，100％BufferB洗脱目的蛋白，纯度达90％左右，得到第一HIV重组抗原，-20℃保存备用。
含有表达载体pET-24a(+)-OSMY-HⅡ-HⅠ的BL21(DE3)pLysS菌用含100μg/mL硫酸卡那霉素(生工，货号A506636)的500mL LB培养基37℃振荡培养至OD600＝1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG(生工，货号A100487)37℃诱导4小时。4℃7000rpm离心3分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20mL裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl，pH8.0)重悬，超声破碎，4℃12000g离心20分钟，收集上清；用15％饱和硫酸铵冰浴沉淀杂蛋白，离心取上清用25％饱和硫酸铵冰浴沉淀目的蛋白，离心，沉淀用20mmPB PH7.4溶解，加入相应体积的5Xloadingbuffer后上样于8％SDS-PAGE，105V 4℃过夜电泳，第二天早上拆胶，取部分胶条5％CuCl2染色，根据染色结果切下目的蛋白，装入透析袋，用10mM PB+1/万SDS电洗脱，电压150V 4h，收样，得到第二HIV重组抗原，纯度90％左右，-20℃保存备用。
对第一HIV重组抗原以及第二HIV重组抗原进行SDS-PAGE电泳，得到图1。由图1可以看出，第一HIV重组抗原以及第二HIV重组抗原的分子量大小正确，纯度为90％以上。
实施例2、HIV测试剂盒(CMIA)的制备
1、AP标记第二HIV重组抗原的制备(采用采用NaIO4氧化法)
1)酶透析：配制10mg/mL的AP溶液，纯水透析4℃过夜。
2)氧化：吸出透析好的AP至广口玻璃瓶中，等体积缓慢滴加43mg/mL NaIO4溶液，4℃下放置30min。
3)终止氧化：加入与(2)中NaIO4溶液等体积的1％乙二醇，4℃下放置30min，终止氧化反应。
4)抗原交联：按质量比1：1加入第二HIV重组抗原，装入透析袋，置0.025mol/L，pH9.0碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜。
5)还原：取出透析袋中液体，按12.5:1体积比加入10mg/mLNaBH4，4℃2h。
6)提纯：等体积加饱和(NH4)2SO4(pH7.6)溶液沉淀结合物，置4℃2h后，4 000r/min离心30min，弃去上清。
7)将沉淀物溶于0.05M Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4中，装入透析袋，置0.05M Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4中，4℃透析过夜。
8)得到的AP标记第二HIV重组抗原等体积加入甘油，-20℃保存备用。
2、第一HIV重组抗原与磁微球的偶联物的制备
第一HIV重组抗原与磁微球的偶联采用化学交联法进行，步骤如下：
1)第一HIV重组抗原(1mg/mL×0.5mL)透析至活化缓冲液(50mM MES pH5.5)；
2)取磁微球(Merk公司，品名：Estapor EM1-100/40)0.1mL(100mg/mL)，用活化缓冲液(50mM MES pH5.5)洗涤4次，每次5mL，最后加1mL活化缓冲液，超声分散；
3)称取3mg EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，用0.3mL活化缓冲液(预冷)溶解至10mg/mL。立刻在振荡条件下往混合液中加入0.2mL EDC溶液，充分混匀。室温旋转(30rpm)反应0.5～1小时，磁分离，弃去上清；
4)加入透析后的第一HIV重组抗原，用50mM MES pH5.5补足1mL，室温旋转(30rpm)结合30分钟，弃去上清；
5)用洗涤液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl+0.05％Tween-20+0.1％ProClin300,pH7.4)洗2次，每次5mL；加5mL封闭液(洗涤液+1％BSA)，室温旋转(30rpm)反应4小时
6)用洗涤液洗3次，每次5mL；最后加1mL磁珠保存液(50mM Tris+1％BSA)重悬，得到第一HIV重组抗原与磁微球的偶联物，终浓度为10mg/mL固体含量，+2～+8℃保存。
3、检测方法
HIV测试剂盒包括AP标记第二HIV重组抗原以及第一HIV重组抗原与磁微球的偶联物。
这种HIV测试剂盒进行检测时，可以采用如下方法：在反应容器中加入磁微粒悬浮液25μL，样品稀释液50μL，样品50μL，反应15min，50mMTris+0.05％吐温20，pH7.5洗5次，加入100μL稀释后的pET-26b-OSMY-HIIHI-AP标记物，反应15min，50mM Tris+0.05％吐温20，pH7.5洗5次，加入发光底物100μL反应5min，读值。
实施例3、实施例2得到的HIV检测试剂盒的灵敏度和特异性测试
1、灵敏度
a)选取国内一家HIV抗体检测(CMIA)试剂盒为对照，进行了灵敏度测试对比，测试结果如表1所示。
表1：实施例2得到的HIV检测试剂盒与对照试剂盒的灵敏度对比
由表1可以看出，实施例2得到的HIV检测试剂盒的灵敏度及本底均正常，II型活性比对照试剂盒稍高，本底比对照试剂盒低；对照试剂盒对阳性HIV-I-1质控的反应性比实施例2得到的HIV检测试剂盒低一倍多，阳性HIV-I-2质控反应性稍低于实施例2得到的HIV检测试剂盒，对阴性质控的反应性较差。
另外，实施例2得到的HIV检测试剂盒还对122份确定的HIV阳性标本进行检测，均检出，说明实施例2得到的HIV检测试剂盒的灵敏度高。
b)实施例2得到的HIV检测试剂盒过国标盘(批号20140930)，具体检测数据如表2。
表2：实施例2得到的HIV检测试剂盒
由表2可以看出，本发明HIV抗体检测试剂盒可以过国标盘。
2、临床特异性
对2024份临床标本进行检测，实施例2得到的HIV检测试剂盒的假阳率为0.1％，远低于市场现有HIV双抗原夹心法ELISA产品的假阳率0.2％～1％，说明实施例2得到的HIV检测试剂盒的特异性好。
3、稳定性
对实施例2得到的HIV检测试剂盒进行37℃3天、6天热破实验，数据结果如表3所示。
表3：实施例2得到的HIV检测试剂盒的稳定性试验数据
由表3可以看出，实施例2得到的HIV检测试剂盒的稳定性试验数据波动均在10％以内，说明实施例2得到的HIV检测试剂盒的稳定性合格。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 菲鹏生物股份有限公司
<120> HIV重组抗原、表达基因、表达载体以及HIV检测试剂盒
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 384
<212> DNA
<213> HⅠ
<400> 1
gcagcaggaa gcactatggg cgcggcgtca ataacgctga cggtacaagc cagacaattg 60
ttgtctggta tagtgcaaca gcaaagcaat ttgctgagag ctatagaggc gcaacagcat 120
ctgttgcaac tcacagtctg gggcattaag cagctacaga caagagtcct ggctatagaa 180
agatacctaa aggatcaaca gctcctaggg ctttggggct gctctggaaa aaccatctgc 240
actactgctg taccttggaa ctccagttgg agtaacaaat ctcaacatga gatttgggat 300
aacatgacct ggctgcagtg ggataaggaa attagtaatt acacaaacac aatatacaag 360
ttgcttgaag actcgcaaat ccag 384
<210> 2
<211> 372
<212> DNA
<213> HⅡ
<400> 2
gggatagtgc agcaacagca acagctgttg gacgtggtca agagacaaca agagatgttg 60
cgactgaccg tctggggaac aaaaaatctc caggcaagag tcactgctat agagaagtac 120
ctaaaggacc aggcgcagct aaattcatgg ggatgtgcgt ttagacaagt ctgccacact 180
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aactggtttg ac 372