一种大麦亚端粒寡核苷酸探针及其应用的制作方法

本发明涉及分子细胞遗传学领域，特别是涉及大麦染色体原位杂交(FISH)过程中亚端粒的标记，具体地是能够快速、有效地标记大麦亚端粒区域的寡核苷酸探针Oligo-HvT01。

背景技术：

高等生物染色体序列复杂多样，在不同区间存在大量的重复序列，这为标记与鉴定染色体提供了新的思路与方法。在分子细胞遗传学领域，可通过构建重复序列探针对染色体进行标记，分析染色体上探针信号的分布状态，从而区分基因组与染色体组。此外，通过比较染色体上探针信号的变化亦是分析染色体行为的普遍做法。

目前，已经报道的大麦亚端粒探针仅有HvT01，其是通过扩增大麦基因组亚端粒重复序列而得到的(Schubert et al.The Plant Journal 1998,14:494)。然而，通过标记扩增产物制作FISH探针流程复杂，耗时费力，且受多种因素影响使得标记效果往往不理想。尤其是在进行大量试验操作时，这一方法将在很大程度上影响试验进程与效果。

技术实现要素：

为克服现有技术的上述不足，本发明提供一种能稳定标记大麦亚端粒区域的核苷酸探针以及该探针在原位杂交中检测大麦材料亚端粒区域中的应用。

基于以上目的，本发明根据Schubert et al.(The Plant Journal 1998,14:494)对大麦染色体亚端粒区的研究结果确定的引物，

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)，利用该引物对栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027全基因组DNA进行PCR扩增反应，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现其产物存在如图1所示的4条较亮条带。选取其250bp左右条带回收并构建质粒进行测序，结果显示，其序列长度为113-116bp，说明所回收的核苷酸中存在两个前后相连的相似性极高的片段。利用DNAMAN5.0软件对测序结果进行序列比对分析，并从其3’端选取出一段相对保守的全长为52bp的核苷酸用于探针制备，其碱基序列为：

5’-CCGCTGCGATCCAAACGTTTCGGGAACCCCGGGGGCCGGTTACGGGAACTCT-3’，将其命名为Oligo-HvT01，合成该序列并对其进行荧光标记物质标记用于制作探针。本发明提供了上述寡核苷酸探针在大麦荧光原位杂交中的应用。

本发明的寡核苷酸探针可用于检测大麦材料染色体亚端粒区域。

本发明提供了上述寡核苷酸探针在检测大麦材料染色体亚端粒区域的应用，是用上述寡核苷酸探针对大麦染色体开展荧光原位杂交试验，若在荧光显微镜下大麦染色体亚端粒区域检测出信号，说明寡核苷酸探针Oligo-HvT01能用于标记大麦染色体亚端粒区域，为一种新的大麦亚端粒区域探针。

本发明提供了检测大麦材料染色体亚端粒区域的寡核苷酸探针，即Oligo-HvT01，探针核苷酸序列为：

5’-CCGCTGCGATCCAAACGTTTCGGGAACCCCGGGGGCCGGTTACGGGAACTCT-3’。(SEQ ID NO.3)

进一步地，提供了Oligo-HvT01在检测大麦材料染色体亚端粒区域的应用。

本发明提供了Oligo-HvT01探针在鉴定大麦染色体亚端粒区域形态中的应用。

本发明提供了Oligo-HvT01探针在大麦荧光原位杂交中的应用。

本发明提供了Oligo-HvT01探针在大麦种质资源改良中的应用。

本发明提供了一种检测大麦材料染色体亚端粒区域的检测方法，用寡核苷酸探针Oligo-HvT01对大麦材料染色体开展荧光原位杂交试验，若在荧光显微镜下大麦染色体亚端粒区域检测出信号，说明寡核苷酸探针Oligo-HvT01能用于标记大麦染色体亚端粒区域。

其中，所述荧光原位杂交方法反应程序为：于光学显微镜下检查染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片，变性处理后脱水晾干，滴加混合杂交液于载玻片上，盖盖玻片，置于潮湿的黑暗中孵育，清洗，滴加染液盖盖玻片，于荧光显微镜下观察染色体。

具体地反应程序为：于光学显微镜下检查染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片，滴加70μl 70％甲酰胺变性剂，盖盖玻片于80℃下变性2min，迅速甩掉盖玻片于-20℃下70％、95％、99％酒精梯度脱水，每梯度脱水5min，取出后自然晾干。滴加10μl(0.35μl 1OD/ml Oligo-HvT01探针与9.65μl杂交液)混合杂交液于晾干的载玻片上，盖盖玻片，置于潮湿的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC缓冲液清洗杂交液两次，ddH₂O洗1次，滴加10μl DAPI染液，盖盖玻片，于OLYMPUS BX63DP80荧光显微镜下观察染色体并使用OLYMPUS DP80CCD相机拍摄照片。上述杂交液为：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠。

在本发明的实施例中，采用羟基荧光素(FAM)标记本发明的寡核苷酸探针，利用该探针对大麦材料染色体开展荧光原位杂交试验，若在荧光显微镜下大麦染色体亚端粒区域出现绿色信号，说明寡核苷酸探针Oligo-HvT01能用于标记大麦染色体亚端粒区域。

本发明提供了上述方法在大麦细胞学中的应用。

本发明所开发的大麦染色体亚端粒区域寡核苷酸探针，可直接对大麦染色体亚端粒区域进行检测。该方法不仅具有灵敏度高、检测效果好的特点，同时还克服了传统的质粒标记方法所带来的流程复杂、标记效果受干扰较大的不足，这就检测大麦染色体亚端粒区域而言是一种很好的探针。利用本发明的鉴定方法，将使后续研究操作更加便捷有效。

附图说明

图1为栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027PCR扩增凝胶电泳检测图，从左到右依次为Marker、Baudin、CN4027。图中从100bp-500bp间存在4条较亮条带，250bp左右条带为回收条带。

图2为栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027扩增序列对比结果。各材料从涂板中选取24株长势较好菌落涂板，再从涂板中挑选3条菌落条带测序，Baudin1、Baudin9、Baudin21分别表示材料Baudin第1、9、21条菌落条带，CN402711、CN402717、CN402719分别表示材料CN4027第11、17、19条菌落条带。

图3为寡合苷酸序列探针Oligo-HvT01在栽培大麦Baudin(左)、野生大麦CN4027(右)染色体上的标记效果图，其中灰色区域为DAPI标记的大麦染色体，亚端粒高亮区域为Oligo-HvT01信号点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所使用的大麦材料：栽培品种Baudin、野生品种CN4027，均来自四川农业大学资源学院。本发明所使用生化试剂均为市售。本发明各试剂及配方如下：

DNA提取试剂盒：TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit(TaKaRa)。

PCR扩增试剂盒：EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(TaKaRa)。

cDNA回收试剂盒：TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(TaKaRa)。

质粒：pMD^TM19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)。

感受态细胞：Agrobacterium tumefaciens LBA4404Electro-Cells(TaKaRa)。

琼脂糖凝胶：采用0.5％琼脂糖凝胶检验gDNA，2.0％琼脂糖凝胶检验cDNA。其具体配方如表1。

表1

LB培养基(pH 7.0)：1％(W/V)tryptone,0.5％(W/V)Yeast Extract,1％(W/V)NaCl。

2×SSC缓冲液：0.3M NaCl,0.03M柠檬酸钠。

70％甲酰胺变性剂：70％甲酰胺，溶于2×SSC缓冲液中。

杂交液：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠。

实施例1大麦亚端粒重复序列分析及寡核苷酸探针序列的确定

1、大麦基因组DNA的提取

选取待测材料Baudin、CN4027幼嫩叶片，采用柱式法(TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit)提取DNA，提取步骤如下：

a)取150mg新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉迅速加入500μl的Buffer HS I和10μl的50×DTT Buffer混匀，然后加入10μl的RNase A(10mg/ml)，充分振荡混匀，于56℃水浴中温育10分钟。

b)加入62.5μl的Buffer KAC，充分混匀。冰上放置5分钟，12,000rpm离心5分钟。取上清，加入与上清液等体积的Buffer GB，充分混匀。

c)将Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至Spin Column中。12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

d)将500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

e)将700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

f)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。

g)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入预热至65℃的40μl Elution Buffer，室温静置5分钟。

h)12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。

i)0.5％琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量。

2、PCR扩增

根据文献(Schubert I,Shi F,Fuchs J,et al.An efficient screening for terminal deletions and translocations of barley chromosomes added to common wheat.The Plant Journal,1998,14:494.)对大麦染色体亚端粒标记探针的研究结果，参考其公布的引物HvT01，其核苷酸序列如下：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)；

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)。利用该引物对Baudin、CN4027进行PCR扩增反应。PCR反应体系：

PCR反应程序：

扩增结果如图1。

3、寡核苷酸探针核苷酸序列的确定与探针制备

图1中存在4条明显条带，选择250bp左右条带回收，构建质粒后送样测序，结果如图2。测序结果显示碱基序列为113-115bp，说明图1中存在的间断条带极有可能为连续相接的重复序列。用DNAMAN6.0进行序列比对，从3’端选取一段全长为52bp的相对保守的序列，其碱基序列为：

5’-CCGCTGCGATCCAAACGTTTCGGGAACCCCGGGGGCCGGTTACGGGAACTCT-3’，将其命名为Oligo-HvT01，合成该序列并对其进行及羟基荧光素(FAM)标记用于制作探针。

本发明的寡核苷酸探针可便捷快速地鉴定大麦染色体亚端粒区域。

实施例2寡核苷酸探针Oligo-HvT01对大麦染色体亚端粒区域检测方法的建立

1、大麦根尖细胞染色体制片

选取发芽后根长1-2cm根尖于N₂O中处理4h，醋酸灭活，ddH₂O洗净，切取分生区于37℃酶混合液(纤维素酶：果胶酶＝1:1)中酶解37min，吸除酶液后依次用ddH₂O、无水乙醇各洗2次。每1根尖加入20μl乙酸充分搅拌至细胞呈现悬浮状，于每张载玻片上滴10μl悬浮液。光学显微镜检测染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片并做好标记于4℃冰箱中保存备用。

2、染色体原位杂交(FISH)

取出载玻片自然晾干，滴加70μl 70％甲酰胺变性剂，盖盖玻片于80℃下变性2min，迅速甩掉盖玻片于-20℃下70％、95％、99％酒精梯度脱水，每梯度脱水5min，取出后自然晾干。

混合杂交液按每张片子0.35μl 1OD·ml^-1Oligo-HvT01探针与9.65μl杂交液的比例配置，用移液枪将混合杂交液反复吸放打匀，吸取10μl混合杂交液滴于片子上，盖盖玻片于湿润暗盒中37℃孵育2h。取出后避光条件下2×SSC洗2次、ddH₂O洗1次，每次5min。自然晾干后每张片子滴加10μl DAPI，盖盖玻片于OLYMPUS BX63荧光显微镜下观察染色体并使用OLYMPUS DP80CCD相机拍摄照片。

结果如图3，大麦各染色体亚端粒区域均存在显著的信号点(荧光显微镜下，显示为绿色信号)，表明本发明开发的寡核苷酸探针Oligo-HvT01对大麦亚端粒区域具有显著地标记效果，能够快捷、准确地用于检测大麦染色体亚端粒区域。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种大麦亚端粒寡核苷酸探针及其应用

<130> KHP161119237.5Q

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaaactcgc attttggcc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagttcccg taaccggccc 20

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 大麦

<400> 3

ccgctgcgat ccaaacgttt cgggaacccc gggggccggt tacgggaact ct 52