本发明涉及一种促进红曲菌液态发酵生产红曲黄色素的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术：
目前，微生物发酵法和植物抽提法为生产天然黄色素的两种主要方法。植物来源的天然黄色素如：栀子黄色素、红花黄色素、姜黄色素、玉米黄色素、桔皮黄色素、南瓜黄色素等，这些植物来源的色素在生产过程中面临各方面的局限性，一方面抽提过程中要采用有机试剂，成本较高，产量及应用受限，另一方面其季节性很强，其生产在季节的影响下会导致设备的利用率低下，造成资源浪费。相反，利用微生物发酵法生产天然黄色素基本安全无毒，具有十分广阔的发展前景。
为提高红曲黄色素生产水平，国内外文献报道的论文或专利关注的重点主要集中在高产红曲菌种的诱变筛选方面，但收效不大。例如泰国Yongsmith的科研团队从20世纪90年代以来通过诱变选育到了单产黄色素的红曲菌，应用于液态发酵和固态发酵生产红曲黄色素。该菌株生产的红曲黄色素的最大吸收峰对应的波长是370nm。但液态发酵法黄色素生产水平非常低，至今尚未实现工业化生产。该菌固态发酵12天生产的红曲黄(米)色价达到2224.63U/gdw，虽然色素生产水平较高，但发酵时间过长。国内周波等人通过诱变选育出了红曲黄色素产生菌，该菌株生产的红曲黄色素的最大吸收峰对应的波长是410nm，液态发酵7天的发酵液黄色素色价值仅达110U/mL。以上几例由于发酵色素浓度偏低，发酵时间偏长，均不符合工业化生产的要求。
本实验室在发明专利“一种偶联原位萃取发酵红曲黄色素的双液相发酵方法”(专利号201410116854)中，通过设计合理的碳氮源组分、控制培养基中游离氨基酸的含量以及双液相发酵体系，将合成的红曲黄色素迅速富集到脂溶性溶剂中(所述脂溶性溶剂主要指甘油酯类物质)，从而大大提高红曲黄色素的生产效率。但是在实际生产过程中，发现仍然有产物抑制的现象，胞内色素的分泌仍然会受到限制，因此有必要使得黄色素产量得以进一步提高。
技术实现要素：
目前红曲菌发酵产红曲黄色素的合成途径仍然没有得到深入的研究，采用普通的液态发酵培养基成分，很难达到高产红曲黄色素的目的。在原位萃取发酵的基础上，产物抑制得到一部分的解除，同时传质以及传氧得以部分的提高，但是仍有进一步提高红曲黄色素产量的必要。本发明通过添加表面活性剂的方法，增大细胞膜的通透性，在解除底物抑制的同时增加细胞内的传质、氧传递系数。该方法操作简单，不增加额外的人工和设备，仅通过较低的附加投入，就可以提高目标产物的合成浓度，因而具有重大的经济效益。
本发明提供了一种促进红曲菌液态发酵生产红曲黄色素的方法，所述方法是在红曲菌的液态发酵初始或者发酵过程中加入表面活性剂。
在一种实施方式中，所述红曲菌是能够产红曲黄色素的红曲菌。
在一种实施方式中，所述表面活性剂为Span系列、Tween系列、Triton X-100、PEG系列或者皂角。所述表面活性剂有解除产物抑制以及提高溶氧的作用，可以大幅提高红曲菌对黄色素的合成能力和产率。
在一种实施方式中，所述表面活性剂为Span-80、Tween-20、Triton X-100、PEG中的任意一种。
在一种实施方式中，所述表面活性剂的添加量为0.1g/L-15g/L。
在一种实施方式中，所述表面活性剂的添加时机为液态发酵培养开始后0～96h内。
在一种实施方式中，所述表面活性剂的添加时机为液态发酵培养开始后24～96h内。
在一种实施方式中，所述发酵是在转速为180r/min，温度30℃条件下，发酵培养8d。
在一种实施方式中，所述方法是接种红曲菌种子液于液态发酵培养基中进行发酵；在液态发酵培养开始后0～96h内加入表面活性剂。
在一种实施方式中，所述液态发酵培养基是采用含有红曲菌生长所需营养成分的基本培养基。
在一种实施方式中，所述液态发酵培养基是由水相和萃取相组成的双液相萃取发酵体系，所述水相是含有红曲菌生长所需营养成分的基本培养基，所述萃取相含有甘油酯类物质。
在一种实施方式中，所述基本培养基含有玉米淀粉20-80g/L，黄豆粉0.05-10g/L，硫酸铵3-10g/L，NaNO32-6g/L，酵母膏0.05-5g/L，玉米浆粉0.05-10g/L，硫酸锌0.1-0.5g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L。
在一种实施方式中，所述萃取相中的甘油酯类物质作为萃取剂有提高溶氧的作用，可将附着在发酵液中及红曲菌球表面的色素萃取富集到萃取剂相中，大幅度提高红曲液态发酵合成黄色素产物的浓度和产率。
在一种实施方式中，所述甘油酯类物质是甘油三酯类物质，用量体积占基本培养基体积的10-40％。所述甘油三酯类物质可以是三辛酸甘油酯、三异辛酸甘油酯、植物油或其混合物。
在一种实施方式中，所述萃取相为10份大豆油、8份玉米油、1份三辛酸甘油酯、0.3份二辛酸甘油酯、0.2份辛酸甘油酯的混合。
在一种实施方式中，所述甘油酯类物质除甘油三酯类物质，同时还包括甘油二酯类物质、甘油单酯类物质或其混合物。
本发明的优点和效果：
本发明的提高红曲黄色素产量的方法，经济高效，且不会改变色素的结构，是一种理想的生产方法，在工业大规模生产中的可行性较高。
具体实施方案
黄色素色价的测定方法：
色价为色素浓度的一种表示方法，大小等于稀释倍数与稀释后的色素溶液在其吸收峰处对应的OD值的乘积，单位为U/mL。
用无水乙醇对待测溶液稀释适当倍数(将OD值控制在0.2-0.8之间)，并以无水乙醇的吸光度为空白对照在200-600nm范围内进行全波长扫描，测定400-440nm之间峰值的OD值。
黄色素色价＝OD410nm×总稀释倍数(U/mL)
实施例1：
选择紫色红曲菌sjs-6、CICC编号为40225、CICC编号为40937、CICC编号为5042的紫色红曲菌，和CGMCC编号为3.4701、CGMCC编号为3.4652、CGMCC编号为3.465、CGMCC编号为3.4649的红色红曲菌为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得这八株菌sjs-6、CICC 40225、CICC 40937、CICC 5042、CGMCC 3.4701、CGMCC 3.4652、CGMCC 3.465、CGMCC 3.4649的红曲黄色素的色价分别为50U/mL、32U/mL、26U/mL、24U/mL、42U/mL、28U/mL、36U/mL、37U/mL。
实施例2：
选择紫色红曲菌sjs-6、CICC编号为40225、CICC编号为40937、CICC编号为5042的紫色红曲菌，和CGMCC编号为3.4701、CGMCC编号为3.4652、CGMCC编号为3.465、CGMCC编号为3.4649的红色红曲菌为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，同时分别在发酵初始时添加1g/L的span-80、Tween-20、Triton X-100、PEG在转速为180r/min，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后分别测得红曲黄色素的色价，结果如表1所示。
表1不同表面活性剂对菌株产红曲黄色素的影响
实施例3：
选择紫色红曲菌sjs-6、CICC编号为40225、CICC编号为40937、CICC编号为5042的紫色红曲菌为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，加入甘油脂类原位萃取相20mL(萃取相为10份大豆油、8份玉米油、1份三辛酸甘油酯、0.3份二辛酸甘油酯、0.2份辛酸甘油酯的混合)，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得红曲黄色素的色价210U/mL、160U/mL、180U/mL、110U/mL。
实施例4：
选择红曲菌sjs-6为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，加入甘油脂类原位萃取相20mL(同实施例3)，同时在发酵初始时添加1g/L的span-80、Tween-20、Triton X-100、PEG，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得红曲黄色素的色价，分别为360U/mL、240U/mL、274U/mL、168U/mL。与实施例3相比，分别提高了71.5％、50％、52％、53％。
实施例5：
选择红曲菌sjs-6为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，加入甘油脂类原位萃取相20mL(同实施例3)，同时发酵初始时添加3g/L的span-80，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得红曲黄色素的色价为400U/mL。
实施例6：
选择红曲菌sjs-6为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，加入甘油脂类原位萃取相20mL(同实施例3)，同时发酵初始时添加5g/L的span-80，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得红曲黄色素的色价为500U/mL。
实施例7：
选择红曲菌sjs-6为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，加入甘油脂类原位萃取相20mL(同实施例3)，同时发酵初始时添加7g/L的span-80，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得红曲黄色素的色价为390U/mL。
实施例8：
选择红曲菌sjs-6为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，加入甘油脂类原位萃取相20mL(同实施例3)，同时发酵24h添加5g/L的span-80，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得红曲黄色素的色价为520U/mL。
实施例9：
选择红曲菌sjs-6为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，加入甘油脂类原位萃取相20mL(同实施例3)，同时发酵48h添加5g/L的span-80，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得红曲黄色素的色价为560U/mL。
实施例10：
选择红曲菌sjs-6为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，加入甘油脂类原位萃取相20mL(同实施例3)，同时发酵96h添加5g/L的span-80，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得红曲黄色素的色价为570U/mL。
实施例11：
选择红曲菌sjs-6为摇瓶菌种，其发酵基本培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1；
处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵基本培养基的500mL三角瓶中，加入甘油脂类原位萃取相20mL(同实施例3)，同时发酵72h添加5g/L的span-80，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养8d。结束后测得红曲黄色素的色价为669U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。