一种制备重组内参GAPDH抗体的表达载体的构建方法与流程

本发明涉及表达载体技术领域，具体涉及一种制备重组内参GAPDH抗体的表达载体的构建方法。

背景技术：

要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。通常会使用内参抗体来检测实验系统，或者校准实验结果。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)几乎在所有组织中都能高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作Western blot等实验操作的标准化的内参。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种制备重组内参GAPDH抗体的表达载体的构建方法，该方法构建的表达载体能够进行高效表达，以解决GAPDH表达量低的问题。

本发明通过以下技术方案实现：一种制备重组内参GAPDH抗体的表达载体的构建方法，包括以下步骤：

步骤(1)：以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为免疫原对小鼠进行免疫后，提取脾脏总RNA，在两端序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区；

步骤(2)：将助表达序列的基因、组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因分别连接到重链可变区和轻链可变区得到目的片段，所述助表达序列的基因序列见序列表1；

步骤(3)：在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点，通过PCR技术将目的片段克隆到载体pFUSEss-CHIg-hG1上，即获得重组内参GAPDH表达载体。

作为进一步优选的，所述步骤(2)中，通过SOE-PCR方法或平端连接方法将助表达序列的基因连接到重链可变区的上游，将组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因连接到轻链可变区下游。

作为进一步优选的，所述步骤(3)中，通过PCR技术将目的片段克隆到载体pFUSEss-CHIg-hG1上，将产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落，提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒。

本发明的有益效果为：本发明构建的表达载体能够在系统中进行高效表达，通过重组抗体技术制备表达量高的内参GAPDH抗体，应用于WB(Western Blot)实验中检测或校准实验系统，能避免现有技术中采用多克隆抗体易出现批间差、杂带较多受样本质量干扰影响较大、单克隆抗体细胞株容易丢失，丢失后重新制备周期长等问题。

附图说明

图1为以实施例1构建的表达载体制备的重组内参GAPDH抗体的WB验证结果图；

图2为以实施例1构建的表达载体制备的重组内参GAPDH抗体的IF验证结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

本发明的一种制备重组内参GAPDH抗体的表达载体的构建方法，包括以下步骤：

步骤(1)：以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为免疫原对小鼠进行免疫后，提取脾脏总RNA，在两端序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区；

步骤(2)：将助表达序列的基因、组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因分别连接到重链可变区和轻链可变区得到目的片段，所述助表达序列的基因序列见序列表1；

步骤(3)：在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点，通过PCR技术将目的片段克隆到载体pFUSEss-CHIg-hG1上，即获得重组内参GAPDH表达载体。

步骤(2)中，通过SOE-PCR方法或平端连接方法将助表达序列的基因连接到重链可变区的上游，将组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因连接到轻链可变区下游。β2微球蛋白基因能将不易表达的外源蛋白连接在β2m基因下游，能使外源蛋白高效表达。

步骤(3)中，在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别用内切酶进行双酶切引入双酶切位点，载体pFUSEss-CHIg-hG1用同样的内切酶双酶切，然后用T4DNA连接酶将载体和目的片段进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落，提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒。

实施例1

本发明的一种制备重组内参GAPDH抗体的表达载体的构建方法，包括以下步骤：

步骤(1)：以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为免疫原对小鼠进行免疫，在取小鼠脾脏前3d加强免疫一次，测定抗血清效价，取效价高的小鼠，提取脾脏总RNA，在两端序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区；扩增反应条件如下:94℃预变性5min，94℃45s，58℃1min，72℃45s，共进行30个循环，72℃延伸10min；

步骤(2)：通过SOE-PCR方法或平端连接方法将助表达序列的基因连接到重链可变区的上游，将组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因连接到轻链可变区下游得到目的片段，所述助表达序列的基因序列见序列表1；PCR反应如下:首先在常规PCR反应体系(50μL)中加入等摩尔VL、VH基因,94℃预变性5min，94℃45s，68℃1min，72℃45s，共进行10个循环，72℃延伸10min；

步骤(3)：在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别用内切酶AgeI和NcoI进行双酶切引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ酶切位点，37℃过夜，载体pFUSEss-CHIg-hG1用同样的内切酶双酶切，然后用T4DNA连接酶将载体和目的片段进行连接，16℃下过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落，扩增提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒。

表1核苷酸序列表

实施例2

通过实施例1构建的表达载体制备重组内参GAPDH抗体的方法如下：将获得的pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒质粒混合，通过PEI缓释液转染至293T细胞中，转染前将293T细胞传代，保证细胞汇合度达到80％～85％，将DNA稀释液和PEI稀释液混合，静置5min后加入293T细胞中，放于37℃的二氧化碳培养箱中培养，转染48h取样检测抗体是否表达，根据检测情况确定收样时间；用抗性筛选含有两种质粒的细胞株293T细胞，培养细胞株后得到GAPDH抗体。

1、通过ELISA检测293T细胞株

以抗人KAPPA链抗体用包被酶标板，4℃包被过夜，5％牛奶封闭液封闭2h；，分别加入正常未转染293T细胞上清(-)和人IgG标准品(100ng/mL---+)和293T细胞表达上清，各100μL，37℃孵育30min，用ELISA洗涤液洗5次，3min/次；将HRP标记的羊抗人IgG Fcγ特异性抗体用ELISA稀释液稀释后，分别加入孔中，37℃孵育30min，用ELISA洗涤液洗5次，3min/次；加入显色液100μL/孔，37℃避光显色10min，最后加入50μL/孔2mol/L硫酸终止，用酶标仪上机检测。根据酶标仪检测结果确定抗生素双筛选的293T细胞株的抗体分泌能力。

2、用Western blot方法检测实施例2筛选出来的GAPDH抗体

WB选取HepG2细胞，A549细胞，HEK293细胞，Jurkat细胞和K562细胞，裂解后，使用制得的重组抗体作为一抗，进行WB试验。结果如图1所示。

3、用免疫荧光检测实施例2筛选出来的GAPDH抗体

采用石蜡切片和SABC法进行，结果如图2所示。

<110> 武汉华美生物工程有限公司

华, 权高

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu

1 5 10 15

Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr

20 25