用于从生物痕迹收集生物材料的装置的制作方法

文档序号:13426304
用于从生物痕迹收集生物材料的装置的制作方法

迄今,生物材料的收集装置(通常被称为取样试剂盒或收集试剂盒)由标准化拭子(如由Copan公司出售的FloqSwabs 4N6 Crime Scene Cat 3509C,在光滑管中的常规尖)制成,其变型在专利申请US 2014/0083213中描述。其采取杆的形式,其中末端覆盖有植绒尼龙纤维,形成约1cm2的用于收集生物材料的区域。

这些拭子用于需要收集和分析生物材料的许多领域中,如医疗分析领域,或例如在食品、化妆品、环境和医药领域中的细菌分析。这些拭子此外传统地供警察部门使用,例如在犯罪现场通过基因指纹用于基因分析或识别。

然而,这些拭子具有许多缺点。首先,这些拭子不允许从生物痕迹收集生物材料,具体来说在微痕迹,即具有约为1mm2的微表面或呈现约1微升的微体积的情况下。专利申请US 2014/0083213指示这些标准拭子仅可从5微升的体积使用,并且事实上不建议用于收集这类小体积的生物材料。此外,甚至对于约5mm2或5微升的表面或体积,使用这类拭子改变生物痕迹,使其难以或不可能二次采样(如果需要)或其它分析,如在接触痕迹情况下分析和识别指纹的乳头状图案,或确定痕迹的生物性质。

此外,使用这些拭子收集和分析和/或识别生物材料的方法需要许多步骤,并且具体来说在扩增之前至少一个细胞溶解和核酸(例如DNA)提取的步骤,其中有时在能够进行分析核酸扩增产物之前使扩增的反应稳定的步骤。每个分析步骤必须在实验室环境中执行并且还需要专业技术员工、场地和专用硬件。分析和识别的步骤,具体来说极污染所述核酸的提取步骤,需要免受污染的环境。这些限制排除在受保护的常规实验室周围外部使用标准分析器。这些条件由ENFSI(欧洲法医科学学会网络(European Network of Forensic Science Institutes))的欧洲建议以其处理DNA工作组的品质保证程序管控。分析的持续时间通常为约十个小时以获得从罪行现场(例如犯罪现场)采集的痕迹的几十个生物样本的结果。

这些拭子需要大量试剂用于细胞溶解和提取,并且随后用于扩增核酸,所述试剂极其昂贵。此外,这些步骤必须在分析实验室中进行。所有这些使得这些拭子的使用和使用所述拭子收集和用于分析和/或识别生物材料的方法长,可能经受污染和误处置错误,具体来说在从生物材料的收集部位到分析实验室期间,并且当然昂贵。

因此,现今需要允许在至少相同效率下收集并且还分析和/或识别用所述装置收集的所述生物材料的生物材料收集装置,

-以确保收集的生物材料具有最小化的污染风险,

-以使得生物材料的收集能够呈微痕迹或微体积的状态,

-以降低尤其在其中生物材料以痕迹存在的情况下采集的生物材料的量,以不完全改变或最低程度改变所述生物痕迹,尤其在指纹的情况下;

-以在细胞溶解和提取的常规步骤中的情况时防止从收集的生物材料损失核酸;

-以最小化使用成本;

-以最小化在生物材料的收集和分析结果和/或识别之间需要的时间;

-以使得能够在难以进入区域中精确收集生物材料,具体来说能够呈现微痕迹的小直径孔,如枪炮的枪管,例如直径为4.5mm,或骨腔,如从法医途径采集的人类肋骨的截面用于识别灾难受害者。

在收集生物材料之后尽可能快的DNA分析近来的开发不提供使其实现此目标的实际“万能”工具并且不具有优于常规拭子和分析方法的优点。

申请人已开发装置以及使用所述装置(本发明的目的)收集、分析和/或识别的方法,这解决了全部技术难题。具体来说,根据本发明的装置使得有可能通过较小的取样表面降低生物痕迹的变化,显著降低实验室分析时间,通过在样本和过渡到分析器之间去除提取核酸(具体来说DNA)的步骤降低污染障碍,并且因此允许在常规基因实验室外使用核酸序列分析器,由此提供最接近于取样现场的大量分析能力。通过此收集和分析方法,对于前二十一个收集的生物痕迹,在收集生物痕迹和确定基因分布之间的延迟低于三个小时。分析系统随后每二十到二十五分钟产生至少二十一个附加结果。

一方面,根据本发明的装置允许获得比在常规实验室分析的情形下快的多的结果,并且另一方面使得能够在常规基因实验室外部(尽可能接近于犯罪现场在移动实验室中,或在本地审判警察服务内)使用一个DNA分析器。因此,获得结果的时间显著降低同时维持连续分析产生几十样本的优点。

此外,使用此收集工具(本发明的目的)允许降低基因分析所需要的人力、设备和实验室消费品成本。

根据本发明的装置具体来说旨在用于设计和工业化通用生物材料取样装置,极易于使用,尤其通过第一级的技术和科学警察从业者,可能使用所述装置用于采集样本用于私人的或公共实验室或机构。

本发明的第一目的为生物材料收集装置,其特征在于所述装置包含至少在一个末端具有表面积在约1mm2与约3.14mm2之间的干燥吸收性主体的杆,所述吸收性主体包含表面活性剂和变性剂。

根据本发明,生物材料意指表示来自活体的任何材料,可呈分子、细胞器、体液、细胞片段或细胞形式,并且存在于生物或非生物支持物上。

生物支持物意指生物样本,其可来源于活有机体的全部或部分,所述活有机体在收集时可死亡或可未死亡,例如人类。

非生物支持物意指根据本发明表示非生命表面,如物品或惰性结构。这些表面提供环境样本,与生物支持物相比,其在不存在接触来自活体的生物材料或被其污染的情况下,不含核酸。因此,从含有核酸痕迹的非生物介质获得的样本为可通过本发明装置收集、分析和识别的接触生物体或被其污染的结果。这些非生物介质可具有任何性质,并且例如在警察部门在犯罪现场使用根据本发明的收集装置的情况下,所述非生物介质通常可为便携式电话、车门拉手、武器的枪管的触发尾部或内侧,或杯子。

根据本发明的装置特别适用于收集存在于非生物支持物上、存在于其中存在许多污染物的环境中的生物材料,例如其中警察部门执行识别生物材料的犯罪现场,并且这在生物材料呈生物微痕迹形式时尤其适用。

优选地,所述生物材料包含核酸,优选地DNA,其呈允许通过PCR(聚合酶链反应)扩增和分析和/或识别的形式。生物材料有利地选自由以下组成的群组:生理体液、人类或动物的细胞或悬浮液,具体来说接触痕迹、血液、骨髓、口腔细胞、降解或未降解的人类生物组织或植物的细胞悬浮液;细菌、真菌、质粒、寄生虫或病毒的液体产物、提取物或悬浮液;人类或动物身体组织的液体提取物或匀浆;衍生自核酸合成的介质;和化学或生物化学合成的核酸混合物。优选地,所述材料选自由生理体液、人类或动物的细胞或悬浮液组成的群组。以特别优选的方式,根据本发明生物材料具体来说为接触痕迹、血液、骨髓、口腔细胞、降解或未降解的人类生物组织。

根据本发明,核酸意指DNA和RNA。优选地,根据本发明,我们旨在意指DNA。

根据本发明,杆优选地旨在意指长度在约5cm与约20cm之间、更优选地在约5cm与约10cm之间的杆。有利地,杆的直径约为1mm。有利地,杆为长方体。杆可根据本领域的普通技术人员的一般知识由任何合适的材料制成,并且具体来说可由聚丙烯型塑料制成。优选地,根据本发明,杆为柔性的。

根据本发明的一个方面,杆的一个末端用作用于夹持并且操控装置的区域,而另一末端包含吸收性主体并用于收集生物材料。

根据本发明的第二方面,杆在每一末端包含吸收性主体,并且用于夹持并且操控装置的区域位于杆的中间。

吸收性主体意指根据本发明由吸收性天然或合成材料制成的干燥固体支持物。优选地,所述吸收性主体选自由以下组成的群组:纤维素、硝化纤维素、棉花、植绒合成纤维,如植绒尼龙纤维、亲水性聚合物、玻璃纤维、聚四氟乙烯、聚酯、尼龙、人造丝、棉花和多孔陶瓷。更优选地,吸收性主体选自纤维素和植绒合成纤维。以特别优选的方式,所述吸收性主体由植绒合成纤维,优选地植绒尼龙纤维构成,优选地直接在杆上。有利地,纤维粘附到杆。优选地,纤维测量值长度在1mm与1.5mm之间并且直径在0.01mm与0.5mm之间。此配置允许就收集生物材料和盐渍出所述生物材料的核酸而言获得与制造和使用的简单性相关联的最好结果。

根据本发明的一个方面,合成纤维直接植绒到杆上,优选地柔性杆。在本发明的另一个方面,合成纤维植绒到团粒,优选地柔性团粒上,其柔性适合于适应试样的物品支持物的表面状态,所述团粒附接到杆。优选地,团粒由柔性塑料,例如聚丙烯制成。

有利地,根据本发明,根据本发明的装置的合成纤维使得能够捕获所述生物材料的核酸,具体来说DNA,并且随后将其释放在液体介质中,具体来说水溶液,如核酸的PCR扩增反应混合物。

有利地,当吸收性主体由合成纤维,优选地植绒尼龙构成时,通过PCR扩增核酸可通过将吸收主体保存在核酸的PCR扩增反应介质中和在热循环仪中,或通过搅拌使吸收性主体与核酸PCR扩增反应介质接触并且随后去除所述吸收性主体,使得将所述核酸释放到所介质中来执行。

有利地,吸收性主体为柔性的,这有助于收集生物材料。杆的柔性使得有可能适应样本的物品支持物的表面状态。

根据本发明的吸收性主体具有约1mm2到约3.14mm2的表面积。

因此其可为对应于1.13mm2的表面的1,2mm直径的盘,或对应于3,14mm2的表面的2mm直径的盘。

具体来说,如果对潮湿生物材料执行收集,并且因此在收集之前不存在润湿生物材料或吸收性主体的步骤,那么表面将降低的越多,核酸(具体来说收集的生物材料的DNA)的分析和识别的结果将越好。

借助于实例,提及可由根据本发明的几种类型的吸收性主体组成,其表面积约1mm2到3.14mm2,即:

-在植绒在杆上的合成纤维形式中1到2mm2

-在1.2mm直径的纤维素团粒的形式中约1.13mm2

-在1.2mm直径团粒上的植绒合成纤维的形式中约1.13mm2

-在2mm直径的纤维素团粒的形式中约3.14mm2

-在植绒在2mm直径团粒上的合成纤维的形式中约3.14mm2

在每种情况下,使用快速收集和分析装置,由于其较少接触和擦拭生物痕迹的表面,最多保持存在于擦拭介质上的基因材料,其可在另一个新样本中使用,例如另一个性质的操作如识别数字痕迹的乳头状图案或确定痕迹的生物性质。

由于其在1mm2到3.14mm2的范围内的微型表面积,吸收性主体存在另一个主要经济利益,因为此特征允许在相对于供应商建议的条件在降低50%的反应体积中进行核酸的扩增,并且因此显著降低分析大量样本的成本。实际上,用Identifiler plus和Globalfiler基因扩增试剂盒执行的测试通过实例允许,以表明装置用于如提供商建议的25μl PCR反应体积,并且还在12.5μl的降低一半反应体积中的功效。

已表明吸收性主体的这类小表面使得能够收集足够量的的核酸以获得基因分布。

吸收性主体在其设计中用变性剂和表面活性剂预处理,由此使得细胞原位溶解。因此不必对此吸收性主体施用用于溶解收集上游的细胞的特定加湿垫。

根据本发明,表面活性剂和变性剂意指用于细胞溶解、蛋白质变性和核酸提取的试剂。表面活性剂和变性剂可选自包含以下的列表:尿酸或尿酸盐、tris、SDS-PAGE,优选地异硫氰酸胍、Triton X100、Tween 20、CHAPS、CHAPS-O、辛基-葡糖苷、辛基硫葡萄糖苷和其组合。

优选地,根据本发明,表面活性剂和变性剂为尿酸或尿酸盐、tris和SDS的组合。优选地,吸收性主体进一步包含EDTA。

具体来说,吸收性主体每cm2包含2尿酸微摩尔、8微摩尔Tris和1毫克的SDS的混合物。优选地,吸收性主体进一步包含0.5微摩尔的EDTA。

根据本发明的变型,表面活性剂和变性剂可为胍盐,优选地异硫氰酸胍和Triton XI 00的组合。可发现所述试剂的有效量在0.01M:0.01M与0.4M:0.4M之间,

根据本领域的普通技术人员的一般知识,如果例如装置应用于活的生物体,例如出于医疗分析目的,那么替代变性剂和表面活性剂可用于吸收性主体中,以便确保其相对于人类和动物健康的安全。在这些条件下,吸收性主体可例如直接施用到个体的口腔以便取样细胞用于基因分析。

不管其形状和性质如何,吸收性主体因此包含具有捕获并且随后释放收集的核酸的特性的表面活性剂和变性剂,因此直接制备可用,无延迟用于分子生物学应用而不需要常规实验室提取步骤。

根据本发明的一个优选实施例,装置的具有所述吸收性主体的所述末端为刻痕或可弹出的。

以特别优选的方式,末端为刻痕的。这可用在杆上的横截面点获得,呈在杆上较细区域的形式,使得当收集生物材料时通过大于在支承吸收性主体的末端上的压力切割杆。优选地此横截面点在使得吸收性主体和切割杆完全插入容器的高度处。优选地此横截面点在0.5mm与2mm之间,甚至更优选地1.7mm。

根据本发明的一个优选实施例,所述装置包含密封壳体,整个装置或杆的一部分和具有吸收性主体的杆的末端,不包括夹持和操作区域,或仅吸收性主体插入所述密封壳体中。优选地,密封壳体包括唯一标识符,如条码、RFID或NFC。优选地,根据本发明的唯一标识为条码。

根据在图3中示出的本发明的变型,此装置还可耦接到第二收集装置,所述第二收集装置由优选地约5cm到约10cm长度杆组成,其末端优选地为刻痕或可弹出的,具有用于收集生物材料的吸收性主体。此第二收集装置可例如允许保持和后续提取核酸用于通过分子生物学技术,具体来说通过PCR分析。在此配置中,这两个装置相关联,但是每个插入到分开的密封壳体中,所述密封壳体优选地可通过条码、RFID或NFC识别。

此第二收集装置的吸收性主体可具有与第一装置的吸收性主体相同或不同的大小和/或组成。优选地,第二装置的所述吸收性主体由植绒到杆的合成纤维或缠绕杆的棉花纤维组成,所述杆的表面积在1mm2与2cm2之间。

有利地,根据本发明,收集装置并且具体来说其吸收性主体,在其制造结束时和在其使用之前经受通过任何类型的干燥灭菌系统,尤其是γ照射类型、氧化乙烯和等离子体的处理。此灭菌处理防止在使用之前收集装置被不是将被采集的生物材料的生物材料污染。这允许收集装置响应用于防止被并非来自采集生物痕迹的核酸污染的最苛刻国际建议。

根据本发明特别优选的装置具有由植绒在杆上的合成纤维制成的固体且干燥吸收性主体,所述杆的表面在约1mm2与约3.14mm2之间,刻痕,在5cm到10cm长的长方体杆上,与可识别的密封壳体相关联。吸收性主体每cm2包含2尿酸微摩尔、8Tris微摩尔、0.5微摩尔的EDTA和1毫克的SDS。此特别优选的装置在收集之前在没有先前加湿生物材料或吸收性主体的情况下使用。

本发明的第二目的为用于收集、分析和/或识别生物材料的试剂盒,其包含根据本发明的装置、两个容器、至少一种核酸的PCR扩增反应混合物、热循环仪、测序反应混合物和测序仪。

优选地,根据本发明,所述试剂盒可用于移动实验室中,如移动车辆,例如厢式或公共汽车类型的。

优选地,根据本发明,容器由板或条形物的一个或多个孔组成,例如8孔、96孔或384孔,并且准备好用于PCR。因此,优选地,第一容器预填充有核酸PCR扩增反应混合物。有利地,所述容器还包含扩增反应对照,预填充在容器中并且已经添加到即用型扩增混合物中。第二容器优选地预填充有核酸PCR扩增产物的测序反应混合物。有利地,除了混合测序反应物之外,所述容器还可预填充有一组参考DNA片段,通常被称为等位基因阶梯,允许识别扩增产物。

容器意指用于吸收性主体的容器,其用于使所述吸收性主体与通过核酸的PCR的扩增反应混合物和PCR接触并且使扩增产物与测序反应混合物接触。举例来说,根据本发明这意指具有10微升到350微升的容量的容器,或具有10微升到200微升的容量的容器的组合,如96孔或384孔PCR微板。优选地,容器为100微升或200微升的96孔PCR微板。

本发明的第三目的涉及用于收集、分析和/或识别生物材料的移动实验室,其包含在机动移动车辆中的根据本发明的试剂盒。

所述供电移动车辆通常为厢式车或公共汽车。优选地,所述车辆为电独立的,例如具有在整个PCR扩增过程和测序中确保不间断供电的装置。优选地,车辆具有用于将在地球的任一点的信息,并且具体来说由此测定的基因分布,传输到例如专家或国内或国际数据库的安全车载信息服务连接。

所述移动实验室具有实现加工样本的“向前行走”的原理的配置,即其中待分析的样本插入到实验室中并且进入分析区域的第一区域,其中进行转移在包含核酸的PCR扩增反应混合物的容器中的吸收性主体的步骤的区域,和其中在热循环仪中执行PCR的区域,使扩增产物与测序反应混合物接触,并且测序。

本发明的第四目的为根据本发明的装置的用途,其用于从具有约1mm2的微表面的任何表面或具有约1微升的微体积的任何体积的生物痕迹取样生物材料。

根据本发明的一个特征,如果用所述装置直接对人类执行取样,那么所述人类不是活的。

根据本发明的一个特征,如果用所述装置间接对人类执行取样,那么所述人类可为活的。间接意指在样本上游使用例如用于从血滴检验个体血糖水平的自穿刺笔型工具。自穿刺人工笔用于活的个体的身体的一部分,具体来说手的手指,致使在穿刺区域处产生一滴血。此血滴随后通过擦拭或简单毛细作用转移到本领域的技术人员已知的条带。

本发明的第五目的为收集生物材料的方法,其特征在于所述方法包含使根据本发明的装置与所述生物材料接触的步骤。

通过使所述装置与生物材料接触,意指根据本发明根据待擦拭表面的性质,使用水平扫描的移动或通过简单缓冲或毛细作用擦拭所述生物材料位于其上的支持物。

当待收集的生物材料潮湿时,直接执行收集,并且当生物材料处于干燥形式时,所述方法可包含用无菌和/或不致热水加湿装置的所述吸收性主体或加湿所述生物材料的先前步骤。

优选地,吸收性主体或生物材料不在收集之前直接润湿。待收集的生物材料位于其上的区域可随后经受有助于分离生物材料与其支持物由此有助于其收集的受控局部测湿法。

当待收集的生物材料为干燥不可见接触痕迹,如存在于枪炮的枪托或刀的把手上的上皮细胞时,所述收集方法可包含用无菌和/或不致热水润湿装置的吸收性主体以及生物材料的先前步骤。通过本领域的技术人员已知的真空类型实验室抽吸系统或真空滴管,由系统产生的连续气压允许从其支承支持物抽取物材料以作为抽吸系统的隔膜、滤纸直接附接到本文所使用的所述吸收性主体。

有利地,根据本发明,提供极少量的无菌和/或不致热水,优选地无菌和不致热,对于所述加湿需要约1微升到约50微升,优选地约1微升到约20微升,优选地在约0.5微升与5微升之间。

本发明的第六目的为用于收集和分析和/或识别生物材料的核酸的方法,其特征在于包含:

1.根据本发明的用于收集所述生物材料的方法的(一个或多个)步骤,

2.扩增在装置的吸收性主体上收集的所述生物材料的核酸,优选地DNA的步骤,所述步骤包含

○使包含收集的所述生物材料的所述吸收性主体与至少一种核酸(优选地DNA)的PCR扩增反应混合物接触,

○PCR扩增反应;

3.测序在步骤2中扩增的核酸的步骤包含使所述核酸与测序反应混合物接触,测序和分析测序结果。

实施根据本发明的装置的根据本发明的分析方法具有能够从收集生物材料的步骤1.进行到扩增所述生物材料的核酸的步骤2.,而不需要另一个步骤(具体来说细胞溶解和/或提取核酸的步骤)的优点。

此外,在没有延迟的情况下,在收集之后,通过PCR(聚合酶链反应)直接扩增在装置的吸收主体中捕获的核酸,具体来说DNA,而不添加使扩增反应稳定的添加剂,例如用于测定人类基因分布。

因此,在用市售试剂盒(如赛默飞世尔公司(Thermofisher company)的Identifiler plus,Identifiler direct,GlobalFiler et GlobalFiler express)取样与扩增DNA之间不添加添加剂、试剂或附加步骤。

借助于实例,Identifiler试剂盒的组合物如描述于图5中。

这些试剂盒可因此在不改变其初始组成的情况下,具体来说在无附加组分添加的情况下使用,所述附加组分添加非常显著增加成本和时间。

此外,吸收性主体的小面积不仅允许相对于供应商所建议的降低扩增所需要的反应体积,维持不同试剂之间的相同比例因此产生显著节省,并且还允许限制痕迹的变化由此促进其保持用于后续分析。

如在本发明的方法的步骤2.中所使用的核酸的PCR扩增反应混合物是指执行PCR扩增反应所需要的试剂的特定组合。用于应用于进行扩增的每种情况和条件中的扩增反应混合物是本领域的技术人员熟知的。举例来说,扩增反应混合物可包括用于确保特定靶核酸经受扩增反应的一组或多组引物,以及执行扩增还可需要的酶、核苷酸、探针、盐和缓冲液。

以足以使根据本发明的装置的吸收性主体饱和的量添加所述核酸PCR扩增反应混合物。其通常以7.5微升到25微升,优选地12.5微升到15微升,更优选12.5微升的量添加。

如在本发明的方法的步骤3.中所使用的所述核酸测序反应混合物是指执行扩增的DNA片段的测序所需要的试剂的特定组合。用于应用于通过电泳技术执行测序的每种情况和条件中的测序反应混合物是本领域的技术人员熟知的。举例来说,混合测序反应物可包括甲酰胺和一组已知分子量DNA片段,通常被本领域的普通技术人员称为大小标准物。基于指定大小,每个扩增的DNA片段由本领域的技术人员通过与通常被称为等位基因阶梯的一组参考DNA片段比较来识别。

根据本发明的一个可能的实施例,可直接或间接进行分析步骤。具体来说,对于间接分析,如果根据本发明的装置包含由合成纤维构成,优选地由植绒尼龙制成的吸收性主体,那么从步骤1.采集的生物材料可通过与5微升到20微升,优选地5微升到10微升的体积的无菌水接触来释放,随后取出因此从吸收性主体释放的一定体积的包含核酸的所述水用于执行扩增的步骤2.。优选地,因此采集的体积为5微升。

实施根据本发明的装置的用于收集和分析和/或识别生物材料的核酸的方法,与通常用于这类分析和或识别的方法相比,仅需要非常少的步骤,使得其能够尽可能接近于收集点在单个移动实验室(例如厢式型车辆)中进行,在所述单个移动实验室中可存在至少两个96孔板型容器,核酸PCR扩增反应介质、热循环仪、测序反应混合物和测序仪。

由于其非常低的接触表面和上文所述特性,根据本发明的装置可有利地与用于芯片实验室类型的生物检测和/或微型化基因分析的微型装置一起使用,优选地使用微流体技术。

附图说明本发明:

图1A以横截面表示本发明的收集装置,在其壳体外部。夹持和操作区域在一个末端处,并且吸收性主体在相对末端处。

图1B表示在其壳体中的收集装置,在用呈直线拉伸的杆的吸收性主体收集生物材料之前或在其之后。

图2示出了具有吸收性主体(被称为“收集表面”)的收集装置,其具有相对于直线杆的一定角度以有助于收集,和通过条码可识别的密封的壳体。

图3示出了收集装置的变型,或呈现第二吸收性主体(被称为用于保持的收集表面)的第二收集装置耦接到如图2所示的第一装置。夹持区域位于杆的中间而不在其末端处。

图4A为具有表面为3.14mm2的吸收性主体的装置的照片,所述吸收性主体由植绒在杆上的尼龙纤维构成。

图4B为具有表面为1.13mm2的吸收性主体的装置的照片,所述吸收性主体由在杆上的植绒尼龙纤维构成。

图4C为由Copan公司出售的标准物FloqSwabs 4N6Crime Scene Cat 3509C,在光滑管中的常规尖的照片。

图5为如在2015年出售的IdentiFiler试剂盒的组成。

图6A为从使用纤维素盘(左)和标准拭子(右)收集的1微升的血液获得的平均荧光强度的比较。

图6B为从使用纤维素盘(左)和植绒在杆上的合成纤维(右)收集的5微升的血液获得的平均荧光强度的比较。

图6C为从使用纤维素盘(左)和植绒在杆上的合成纤维(右)收集的1微升的精液获得的平均荧光强度的比较。

图7为用根据本发明的装置(表面1.13mm2)采集的5微升的2滴血液的照片。

图8为从标准拭子和用根据本发明的装置(表面1.13mm2)采集的血液的指纹。

图9拍摄存在于枪炮的枪管中并且用根据本发明的装置(表面1.13mm2)采集的一微升血液痕迹的照片。

本发明的其它特征和优点可出现在以下实例中,并且仅借助于非限制性图示给出。

实例

实例1:确定理想的纤维素基体表面

为了测试大小对DNA的收集效率、分析和识别的影响,已进行以下测试:

测试由干燥纤维素基体构成、包含FTA型表面活性剂和变性剂(GE公司)或NucleiCard(COPAN公司)的呈直径为1.2mm(即1.13mm2的表面)、2mm(即3.14mm2的表面)、3mm(即7.06mm2的表面)盘(被称为“生物团粒”)和边长为3.3cm的正方形(即10mm2的表面)形式的干燥固体吸收性主体。

在不存在工业收集装置(其为本发明的一个目的,即附接到杆的所述吸收性主体)的情况下,生物团粒使用镊子类型夹具操控。应注意用户具有不允许具体来说在犯罪现场由警察部门想像的使用的使用难度。实验收集方法以下方式分解:通过使用水平或圆形移动擦拭支持物或通过根据待擦拭表面的性质简单缓冲来收集生物痕迹。

已经对可能以不同的量和质量但是大部分降解的现存DNA的不同类型的痕迹执行测试。为这个目的,收集已在所谓的“接触”痕迹(擦拭不同介质,如车辆或日常物体的内部)、血液痕迹、口腔细胞和不同生物组织(呈晚期降解状态,如腐臭或碳化的身体部分)上进行,其中每次1微升样本。干燥使用吸收性主体,而不需在收集之前润湿痕迹或吸收性主体。

在收集之后,使吸收性主体与一个STR(短串联重复)类型DNA片段扩增反应介质如识别Identifiler plus和Globalfiler(Lifetechnologies)试剂盒接触并且随后插入到用于PCR的热循环仪中。

因此,在没有延迟情况下,在收集结束时,在生物团粒中捕获的DNA在热循环仪(GeneAmp PCR系统9700)中通过PCR(聚合酶链反应)直接扩增,而不添加使扩增反应稳定的添加剂,以测定人类基因分布。此扩增反应使用用于扩增STR型DNA片段(短串联重复)的市售试剂盒如Identifiler plus和Globalfiler试剂盒(Lifetechnologies)根据提供商的建议进行。因此,在使用Identifiler plus的情况下,热循环仪在28 PCR循环下使用,在Globalfiler的情况下在29 PCR循环下使用。

PCR产物的基因分型随后使用ABI 3500xl(Lifetechnologies)分析器执行。结果分析使用GeneMapper ID-X 1.2版软件执行。

获得的结果示出10mm2和7.06mm2的表面不允许识别样本的DNA分布,符合本领域的技术人员的公认的想法,不可用这类收集装置收集约为1微升的微痕迹DNA样本并且分析。

然而,并且此为本发明的技术解决方案的一部分,申请人已出人意料地并且出乎意料地发现通过进一步降低生物团粒的表面积,通过在1.13mm2到3.14mm2的较小吸收性主体表面情况下执行相同的测试,在3,14mm2的表面情况下,有可能获得部分DNA分布(50%的识别的等位基因),并且在1.13mm2的表面的情况下,甚至完整DNA分布(100%的识别的等位基因),违背本领域的普通技术人员的技术偏见。因此,申请人已示出使用收集装置不仅有可能收集并且还分析并且精确识别约1微升的微痕迹DNA。

为了验证快速分析方法的效力,生物痕迹也已使用常规拭子装置(FloqSwab,COPAN公司)以1微升、3微升和5微升的量收集,并且随后借助Identifiler Plus,Identifiler Direct和GlobalFiler试剂盒根据提供商建议分析,而不预量化从拭子的整个末端提取的DNA。

从快速分析方法(本发明的目的)获得的结果比使用常规分析方法(具有细胞溶解和必须的提取步骤)获得的那些好(图6A)。实际上,快速收集和分析系统主要对极小面积和体积(约1mm2和1μl的微痕迹)的生物痕迹较高效,这是因为收集表面的小型化和不存在基因材料的损失(因为不存在从收集装置提取DNA)。

实例2:确定表面1.13mm2的吸收性主体-纤维素盘/植绒合成纤维的理想组成

在由1.13mm2纤维素盘构成的包含变性剂和表面活性剂的吸收性主体与由1.13mm2总表面的植绒在杆上的合成纤维构成并且包含这些相同变性剂和表面活性剂的吸收性主体之间执行比较性能测试。

收集两种类型的痕迹:

-在玻璃片上5μ1血液的血液痕迹(图7)

-在玻璃片上1μl干燥精液的精液痕迹。

直接在收集之后,将吸收性主体沉积在设置有GlobalFiler(Lifetechnologies)试剂盒的含有25μ1的STR型DNA片段(短串联重复)扩增反应混合物的96孔微板的孔中,随后微板插入用于PCR反应的热循环仪(Gene Amp PCRSystem 9700)中。PCR产物的基因分型随后使用ABI 3500XL测序仪分析器(Lifetechnologies)执行。试剂的分析使用软件GeneMapper ID-X1.2版进行。

结果允许用纤维素和植绒合成纤维识别相同DNA分布,即血液和精液样本的DNA分布的100%的识别。相比之下,植绒合成纤维装置比纤维素盘装置更有效,因为用植绒纤维从基因分布获得的平均荧光强度大于用纤维素盘获得的平均荧光强度(图6B和6C)。

此外,注意到使用植绒合成纤维型式的装置的实际舒适度,相较于使用镊子操控的纤维素盘装置,尤其当待收集的痕迹难以获取时,如可为在枪支的枪管壳体内侧的情况(图9)。

实例3:校验1.13mm2并且用变性剂和表面活性剂处理的植绒合成纤维装置相对于标准拭子(4N6 FloqSwab,COPAN公司出售)的性能

在总面积为1.13mm2植绒到杆上并且包含变性剂和表面活性剂的合成纤维之间执行比较功效测试。

收集两种类型的痕迹:

1.显露在玻璃上的拇指指纹

2.显露在地板(瓷砖)上的出血拇指指纹

在情况1下。用植绒合成纤维的装置收集拇指指纹的上部部分同时用标准拭子收集拇指指纹的下部部分。

在情况2下,用1.13mm2的植绒合成纤维擦拭由于装置的小面积允许仅收集通过两个纹线乳头状图具体化的生物材料。相比之下,用标准拭子收集5个纹线,其尤其改变乳头状图。

直接在收集结束时,将吸收性主体放置于供应有GlobalFiler(Lifetechnologies)试剂盒的含有25μ1的STR(短串联重复)型DNA片段扩增反应混合物的96孔微板的孔中,随后微板插入用于PCR反应的热循环仪(Gene Amp PCR System 9700)中。PCR产物的基因分型随后使用分析器ABI 3500XL测序仪(Lifetechnologies)执行。试剂的分析用GeneMapper ID-X 1.2版软件进行。借助于快速分析方法从显露在玻璃上的乳头状痕迹的1.13mm2的上植绒合成纤维采集的样本产生比使用具有细胞溶解步骤并且需要提取的常规分析方法获得的样本好的结果。实际上,根据快速分析方法获得完全DNA分布而根据标准分析方法获得非常不完整的DNA分布。

从出血拇指指纹采集的样本允许获得完整DNA分布,以平均化在两种聚集和分析装置之间等效的荧光强度。相比之下,使用收集和快速分析装置的仅收集乳头状图的两个峰代替出于等效结果用收集和分析装置的4个到5个峰的能力表明收集和快速分析装置的灵敏度和益处均限制痕迹的改变(图8)。

再多了解一些
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