RNA的冻干的制作方法

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RNA的冻干的制作方法
RNA的冻干本发明涉及RNA制剂领域,具体地涉及RNA的冻干。本发明提供用于冻干RNA的方法。本发明还涉及能够通过本发明方法获得的冻干组合物、药物组合物、疫苗和试剂盒或套装试剂盒。此外,本发明提供了用于冻干RNA的冻干保护剂的新用途,本发明方法在制备药剂中的用途以及通过本发明方法可获得的组合物、根据本发明的药物组合物、疫苗、或试剂盒或套装试剂盒的第一和第二医药用途。在基因治疗以及许多其他治疗相关的生物化学和生物技术应用中,核酸被用于治疗和诊断目的。例如近年来在基因治疗领域出现了快速的进展,取得了有希望的成果。因此,核酸被认为是用于基因治疗和针对例如感染性和恶性疾病的预防和治疗接种的重要工具。核酸即DNA和RNA均以裸的形式或以复合形式被广泛用于基因治疗。在此情况下,核酸特别是RNA用于治疗接种的应用被永久地改变。RNA的应用代表现代分子医学中的有利工具,其相对于DNA的应用也表现出一些优越的性质。通常已知,DNA分子的转染可以导致严重的并发症。例如,DNA分子的应用承担着DNA被整合到宿主基因组中的风险。将外源DNA整合到宿主基因组中可以对宿主基因的表达产生影响,并可以引发致癌基因的表达或肿瘤抑制基因的灭活。此外,通过将外源DNA整合到基因的编码区中,必需基因——以及作为结果的这种必需基因的产物——也可以被灭活。如果DNA被整合到参与细胞生长调节的基因中,则这种事件的结果可能是特别危险的。尽管有着与其应用相关的风险,DNA仍然代表着重要的工具。然而,如果使用RNA特别是mRNA代替DNA,则不会发生这些风险。使用RNA而不是DNA的优点是不必须在体内施用病毒来源的启动子元件,并且不会发生到基因组中的整合。此外,为了发挥RNA的功能,其不需要越过屏障到达细胞核。然而,使用RNA的主要缺点是其不稳定性。即使认为DNA如裸DNA在引入患者循环系统时通常是不稳定的,因此几乎没有机会影响大多数疾病过程(参见例如Poxon等人,PharmaceuticaldevelopmentandTechnology,5(1),115-122(2000)),在RNA的情况下,稳定性的问题仍变得更加突出。通常已知,溶液中RNA分子的物理化学稳定性极低。RNA易于被普遍存在的核糖核酸酶或二价阳离子水解,并且通常被迅速降解,例如已经在溶液中几小时或几天后。即使在不存在核糖核酸酶的情况下也会发生快速降解,例如当RNA在室温下、在溶液中储存几小时或几天时。为了避免这样的快速降解,RNA(在溶液中)通常被存储在-20℃或甚至-80℃和无核糖核酸酶的条件下以防止RNA降解。但是,这样的储存条件并不能充分防止功能随着时间丧失。另外,应用这样的条件是非常成本昂贵的,特别是对于运输和存储,例如无论何时必须保证这样的低温。用于稳定RNA的另外一种方法包括RNA的冻干或冷冻干燥。冻干是全世界已知且认可的方法,其用于增强温度敏感型生物分子的储存稳定性。在冻干期间,溶剂例如水通常经由升华从冻结样品中除去。通常,冻干过程的特征在于初级和次级干燥步骤。在初级干燥步骤中,包围生物分子的游离水即未结合的水和任选的其他组分从冻结溶液蒸发。然后,在次级干燥步骤中通过增加热能将在分子基础上与生物分子结合的水除去。在两种情况下,生物分子周围的水合球均会失去。在冻干期间,将含有生物分子的样品首先冷却到溶液以及相应地在其中含有的水的凝固点以下。结果是,水冻结。在其他参数中,取决于温度、冷却速率(冷冻速率)和冷冻时间,晶体可以形成。这对溶液的生物分子和其他组分产生物理应力,其可以导致生物分子的破坏,例如在核酸的情况下,链的断裂、超螺旋的失去等。此外,由于体积减少和水合球的失去,自催化降解过程是有利的,例如通过微量过渡金属。此外,微量的酸和碱浓度可以导致pH值的显著变化。冻干涉及两种类型的应力,即冷冻和干燥。已知这两种类型的应力会破坏核酸,如非病毒载体或质粒DNA。在文献中,讨论了若干冷冻保护剂和冻干保护剂用于冻干的目的以防止这些破坏。在此情况下,冷冻保护剂被理解为辅料,其能够影响混合物的冰结构和/或共晶温度或玻璃化转变温度。冻干保护剂通常是辅料,其部分或完全替代分子周围的水合球,并因此可以至少部分地防止催化和水解过程。在DNA的具体情况下,冻干导致DNA周围水合球的去除,其中看起来每个核苷酸对存在约20个水分子与DNA结合最紧密。在低温冷却时,这些水分子并不会形成冰状结构。在0%相对湿度下、在吸湿盐的存在下DNA脱水时,仅剩下5或6个水分子(参见例如Tao等人,Biopolymers,28,1019-1030(1989))。冻干可以增加在长期储存下的DNA稳定性,但也可能由于初始的冻干过程引起一些破坏,可能地通过DNA二级结构的改变、核酸链的断裂或反应元素例如污染金属的浓度。冻干也可以在其他核酸例如RNA的初始冻干过程中造成破坏。可以替代不可冷冻水如一些碳水化合物的试剂可以在完整细菌冻干过程期间显示与DNA和其他分子相关的冷冻保护性质(参见例如Israeli等人,Cryobiology,30,519-523(1993),或Rudolph等人,Arch.Biochem.Biophys.,245,134-143(1986))。在冻干期间,特定的碳水化合物例如几种糖似乎在稳定核酸分子中起到核心作用。然而,当使用冷冻保护剂和冻干保护剂时,关于其对不同组的化合物的影响不能应用一般规则。因此,必须通过使用经验法找到最优的制剂。在此情况下,本领域中使用特定碳水化合物作为用于增强冻干期间核酸稳定性的冻干保护物质。其显示出对纯核酸或核酸(序列)复合物冻干后的储存稳定性有影响(参见例如Maitani,Y.,Y.Aso等人(2008),IntJPharm356(1-2):69-75;Quaak,S.G.,J.H.vandenBerg等人(2008),EurJPharmBiopharm70(2):429-38;Jones,K.L.,D.Drane等人(2007),Biotechniques43(5):675-81;Molina,M.C.,S.D.Allison等人(2001),JPharmSci90(10):1445-55;Allison,S.D.和T.J.Anchordoquy(2000),JPharmSci89(5):682-91)。冻干保护性质特别地是对于蔗糖、葡萄糖和海藻糖来描述。它们能够至少部分地恢复转染效率,其原本在冻干后的许多情况下会损失(参见Maitani等人,2008年,同上;Yadava,P.,M.Gibbs等人(2008),AAPSPharmSciTech9(2):335-41;Werth,S.,B.Urban-Klein等人(2006),JControlRelease112(2):257-70;Brus,C.,E.Kleemann等人(2004),JControlRelease95(1):119-31;Poxon,S.W.和J.A.Hughes(2000),PharmDevTechnol5(1):115-22;Anchordoquy,T.J.,J.F.Carpenter等人(1997),ArchBiochemBiophys348(1):199-206)。糖主要通过防止颗粒融合/聚集而能够防止由于冻干过程而引起的活性损失,特别是在脂质体复合核酸的情况下(参见Yadava等人,2008,同上;Katas,H.,S.Chen等人(2008),JMicroencapsul:1-8;Molina等人,同上,2001)。特别地,Poxon等人(2000,同上)研究了冻干对质粒DNA活性的作用。Poxon等人(2000,同上)假设DNA构象从超螺旋到开环和线性形式的变化表明质粒DNA的破坏。然而,超螺旋DNA的百分比在冻干和之后的DMED处理后没有改变,表明其他作用是转染效率损失的原因。Poxon等人(2000,同上)发现在质粒DNA冻干期间可以通过使用碳水化合物来改善质粒DNA活性的降低,质粒DNA活性由体外转染分析测量。葡萄糖(单糖)、蔗糖和乳糖(二糖)用作冻干保护剂。然而,Poxon等人(2000,同上)仅使用质粒DNA进行了研究。虽然海藻糖是广泛用于生物分子的冷冻干燥过程中的常见辅料,但是其对冻干核酸分子稳定性的有益影响是无法预见的。此外,A.delPozo-Rodriguez等人表明:在海藻糖的存在下,与固体脂质纳米颗粒复合的DNA的冻干导致转染活性随时间急剧降低,而单独的固体脂质纳米颗粒在冷冻干燥后不会失去其活性。此外,Molina等人(Molina,M.C.,S.D.Allison等人(2001),JPharmSci90(10):1445-55)也显示在海藻糖中配制的冷冻干燥脂质/DNA复合物在储存后的活性降低。尽管许多现有技术文献表明了在质粒DNA的情况下、在冻干期间的核酸稳定化,但只有少数出版物着重于其他核酸例如RNA的稳定化,例如在冻干和长期储存期间。此外,在受控条件下的冻干根本极少被描述。在这方面,Jones等人(2007,同上)是少有的检验了糖对mRNA的长期稳定性的作用的文献。其描述了防止体外转染活性的存储依赖性损失的可能性。Jones等人(2007,同上)使用海藻糖作为冻干保护剂,并显示出在4℃的温度下储存6个月后对转染活性积极的作用。通过回收后的重量损失并通过琼脂糖凝胶电泳测定mRNA完整性。然而,在升高的温度(室温和更高)下观察到降解和转染效率的急剧损失。此外,Jones等人描述的冷冻干燥过程需要通过浸入在液氮中在-70℃以下使制剂冷冻。这种步骤实际上是不可行的,特别是在监管环境中的放大过程中,其中受控条件是强制性的。还报道了与液体制剂相比,用甘露糖作为冻干保护剂冻干的mRNA的温度稳定性增强(WO2011/069586A1)。然而,含有甘露糖的mRNA制剂需要-47℃以下的冻结温度以避免冻结溶液在干燥时解冻。目前先进的冷冻干燥器中的搁架温度通常可以控制在-40℃至+50℃。低于此水平的温度需要特定设备和特定冷却介质,例如特定冷却油。在另一方面,完全受控的冷冻干燥循环对于例如药品的监管制备是至关重要的。事实上,在现有技术中描述作为冻干保护剂的甘露糖并不适用于在监管环境中、在最先进的冷冻干燥器中进行的大规模过程。此外,即使在-20℃或甚至-80℃的储存在技术上是可能的,这种储存需要超凡的努力并涉及过高的成本。然而,这种费用对于任何商业企业和一些私营企业通常是过高的。这特别适用于热带地区或第三世界国家,在那里由于经济原因成本必须保持在低水平,且能源供应往往有限。此外,可能需要在没有太多空间(和/或能量)用于存储的情况下运送或运输这种核酸,例如在“生产到临床”或甚至“从科研到临床”方案的情况下。对于核酸、特别是RNA的安全和有成本效益的储存的这种要求也可以适用于短期或长期运输,适用于核酸在数据库、登记机构或存放机构的长期储存,例如生物研究人员的数据库、刑事犯罪者的政府或国家数据库等。RNA的长期储存能力还开启了涉及RNA作为活性物质的各种应用和治疗领域,例如使用RNA的接种、使用RNA的基因治疗等。因此,对于RNA的使用,在高于4℃的温度下的储存可以在各种不同情况下具有宝贵的经济和物流优势。已知基于mRNA的疫苗在水溶液中是很不稳定的。mRNA在溶液中的保质期在室温下通常仅几天。使用冷冻干燥通过减少或去除这种制剂中的水来克服这种限制,这导致分子的热力学流动性降低,并且通过例如冷冻保护剂的羟基取代化学结合的水。然而,冷冻干燥条件几乎是不可预测的,并且必须通过经验性检测确定对于每种组合物的冷冻干燥条件。特别地,如果要实施药品的大规模生产过程,那么这个过程必须被经验性研发。由于不仅在较低温度下的储存,而且作为生产过程部分中的冷冻干燥本身也是能源密集型的,因此在考虑用于工业应用的冷冻干燥时,经济方面是非常重要的。因此,需要开发成本效率和时间效率的方法。标准冷冻干燥器通常在规定的搁架温度-40℃至+50℃下操作。这是由于:在干燥器搁架中用作温度传输介质的油表现出其既作为冷却介质又作为加热介质的折衷。使用特定的油可以达到低于-40℃的可控搁架温度,但是对于干燥器本身而言,将需要其他更复杂的技术设备。因此,从技术角度来看,产品的工业冷冻干燥是复杂的,其必须在干燥前在-40℃以下被冻结,因为涉及到巨大的成本,其通常是不可行的。因此,对于许多产品,技术上可行和经济上合理的冷冻干燥过程的折衷仍然是一个挑战。即使描述了在标准实验室条件下冷冻干燥RNA,仍然需要RNA冻干的改进方法。特别地,需要一种方法,其允许RNA冻干的工业应用,例如用于生产药物组合物。因此,本发明的目的是提供用于冻干RNA的方法,其是可规模化的、可再现的,并且可应用于药物的生产,还是时间效率和成本效率的。具体来说,本发明的目的是提供用于RNA冻干的方法,RNA的完整性和生物活性通过该方法被优选地保持。本发明的另一个目的是提供包含RNA的组合物,其适用于在环境温度下和较长时间内储存,且相比于现有技术的组合物,其优选地具有增加的储存稳定性。本发明的潜在目的通过所要求保护的主题来解决。在第一方面,本发明提供了用于冻干RNA的方法。具体来说,本发明涉及用于冻干RNA的方法,其中该方法包括以下步骤:a)提供包含至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的液体;b)将提供的液体装载到冷冻干燥器的冷冻干燥室中;c)将液体冷却至冻结温度,其中该冷却以确定冷却速率进行;d)将液体在冻结温度下冻结以获得冻结液体;e)降低冷冻干燥室内的压力至低于大气压的压力;f)干燥步骤d)获得的冻结液体以获得包含所述至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的冻干组合物;g)使冷冻干燥室中的压力与大气压平衡,并从冷冻干燥室移出包含所述至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的冻干组合物。根据一个优选的实施方案,步骤a)至g)以上述顺序进行。然而,本发明方法也可以通过以可替换的顺序进行步骤a)至g)而实施。此外,单个步骤可以同时或可以重叠进行。发明人发现,在冻干保护剂优选如本文定义的碳水化合物冻干保护剂的存在下、在受控条件下优选如本文定义的受控冷冻和/或干燥条件下,冻干RNA获得包含RNA的组合物,其特征在于在冻干过程完成之后RNA的优异完整性,其特征还在于增加的储存稳定性,特别地针对在长时间和/或非冷却条件下的储存。有利地,本发明的方法适合以工业规模被使用。根据本发明的方法可以以可重现的和成本效率的方式用于生产包含具有上述性质的RNA的组合物。根据本发明的包含RNA的组合物可以有利地例如在没有冷链的医疗领域(例如作为疫苗)中被储存、运输和使用,同时组合物中RNA的完整性和生物活性出乎意料地高。在本发明之前,在冷冻保护剂的存在下冻干RNA会获得根据本发明组合物的这种特殊性质是无法预期的。具体地,在现有技术中没有表明关于在受控条件下,特别是没有表明在本文定义的受控冷冻和/或干燥条件下冻干RNA的方法。在本发明的情况下,术语“冻干”(也称为冷干)、“使冻干”或“冷冻干燥”通常涉及如下方法,其能够在一个或更多个步骤中通过升华减少冻结样品(优选上文定义的溶液,其含有如本文定义的至少一种RNA和冻干保护剂)的溶剂(例如水)含量。在本发明的情况下,冻干通常如下进行:在第一步骤中冷冻样品,然后在一个或更多个步骤中通过升华干燥样品,任选地通过降低周围压力和/或通过将样品加热,使得溶剂从固相直接升华为气相。本发明方法的步骤a)包括提供包含至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的液体。在本发明的情况下,术语“RNA”用作核糖核酸的缩写。RNA是核酸分子,即由核苷酸构成的聚合物。这些核苷酸通常是单磷酸腺苷单体、单磷酸尿苷单体、单磷酸鸟苷单体和单磷酸胞苷单体,其沿着所谓骨架彼此连接。骨架由第一单体糖即核糖和相邻的第二单体磷酸酯部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定次序称为RNA序列。如本文所用的,术语“RNA分子”不限于任何具体类型的RNA。例如,RNA可以是由DNA序列例如在细胞内的转录能获得的。在真核细胞中,转录通常在细胞核或线粒体内进行。在体内,DNA的转录通常导致所谓的未成熟RNA,其必须处理成所谓的信使RNA,通常缩写为mRNA。例如在真核生物体中,未成熟RNA的处理包括各种不同的转录后-修饰,例如剪接、5′-加帽、多聚腺苷酸化、从细胞核或线粒体等排出。这些过程的总和也称为RNA的熟化。成熟的信使RNA通常提供核苷酸序列,其可以翻译成特定肽或蛋白质的氨基酸序列。通常,(成熟)mRNA包括5′-帽、任选的5′UTR、可读框、任选的3′UTR和poly(A)和/或poly(C)序列。此外,术语“RNA分子”包括核糖核酸,其包含超过一个的可读框架,例如双顺反子或多顺反子RNA分子。双顺反子或多顺反子RNA分子通常是RNA分子,优选mRNA分子,其通常具有两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)的可读框(ORF)。除了信使RNA,存在几种非编码类型的RNA,其可以涉及转录和/或翻译的调节,例如核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA)。术语“RNA”或“RNA分子”还包括其他编码RNA分子,例如病毒RNA、逆转录病毒RNA、自我复制RNA(复制子RNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA、小核RNA(snRNA的)、小发夹(sh)RNA、核糖开关、核酶或适配体。优选地,至少一种RNA是长链RNA。本文所用的术语“长链RNA”通常指RNA分子,优选地如本文描述的,其优选包含至少30个核苷酸。或者,长链RNA可以包含至少35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或至少500个核苷酸。长链RNA分子还可以包含至少100个核苷酸,甚至更优选至少200个核苷酸。在本发明的情况下,长链RNA还优选包含30至50000个核苷酸、30至20000个核苷酸、100至20000个核苷酸、200至20000个核苷酸、200至15000个核苷酸、或500至20000个核苷酸。本文所用的术语“长链RNA”不限于某种类型的RNA,仅仅是指包含在所述RNA中的核苷酸数。在优选的实施方案中,本文所用的所述至少一种RNA是长链mRNA。本文所用的至少一种RNA优选包含至少30个核苷酸。或者,根据本发明的至少一种RNA可以包含至少35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或至少500个核苷酸。在优选的实施方案中,至少一种RNA包含至少100个核苷酸,甚至更优选至少200个核苷酸。至少一种RNA还优选包含30至50000个核苷酸、30至20000个核苷酸、100至20000个核苷酸、200至20000个核苷酸、250至15000个核苷酸、或500至20000个核苷酸。在一个优选的实施方案,在本发明方法的步骤a)中提供的液体包含至少一种RNA,且可以任选地还包含第二或其他核酸分子。优选地,包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的第二或其他核酸分子不同于所述至少一种RNA。例如,所述至少一种RNA可以是编码蛋白质或肽的RNA分子,而所述第二或其他核酸分子可以是免疫刺激性核酸分子,优选如本文所定义。在优选的实施方案中,包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的所述至少一种RNA不是选自小干扰RNA(siRNA)、微RNA、小核RNA(snRNA)、小发夹(sh)RNA或核糖开关、核酶和适配体的RNA分子。在特别优选的实施方案中,本文所使用的至少一种RNA不是siRNA。根据本发明的优选实施方案,所述至少一种RNA不是病毒RNA或来源于病毒RNA的RNA。在本文中,短语“病毒RNA”包括衍生自病毒、优选本文所定义的病毒的任何RNA。例如,短语“病毒RNA”包括病毒基因组(或其片段)及其转录物(或这种转录物的片段)。关于病毒RNA的单链或双链RNA以及关于病毒RNA的有义链(+链)以及关于病毒RNA的反义链(-链)可以使用该短语。具体来说,本文所使用的词语“病毒RNA”包括病毒mRNA。短语“来自病毒RNA的RNA”通常包含含有来自病毒RNA,优选来自本文所定义的病毒RNA的核酸序列的任何RNA。优选地,来自病毒RNA的RNA是病毒RNA的片段或变体,优选是本文所定义的片段或变体。在一些实施方案中,本发明的至少一种RNA优选地不是病毒复制子。更优选地,本发明的至少一种RNA不包含在病毒颗粒或病毒复制子颗粒中。具体来说,本发明的至少一种RNA优选不是来自以下病毒的RNA:双链(ds)DNA病毒、单链(ss)DNA病毒、dsRNA病毒、(+)ssRNA病毒(有义链ssRNA病毒)、(-)ssRNA病毒(反义链ssRNA病毒)、ssRNA-RT病毒(反转录病毒)和dsDNA-RT病毒(副反转录病毒)。优选地,本发明的至少一种RNA不是来自dsDNA病毒的RNA。更优选地,本发明的至少一种RNA不是来自以下病毒的RNA:肌尾噬菌体科(Myoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、鱼疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、贝类疱疹病毒科(Malacoherpesviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、瓶状病毒科(Ampullaviridae)、囊泡病毒科(Ascoviridae)、非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、Clavaviridae、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、球状病毒科(Globuloviridae)、滴状病毒科(Guttaviridae)、唾液腺肥大病毒科(Hytrosaviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、马赛病毒科(Marseilleviridae)、拟菌病毒科(Mimiviridae)、线头病毒科(Nimaviridae)、潘多拉病毒科(Pandoraviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、藻类去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、原质噬菌体科(Plasmaviridae)、多去氧核糖核酸病毒科(Polydnaviruses)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、Sphaerolipoviridae、复层噬菌体科(Tectiviridae)和Turriviridae。根据本发明的一个实施方案,本发明的至少一种RNA不是来自ssDNA病毒的RNA。更优选地,本发明的至少一种RNA不是来自以下病毒科的病毒的RNA:指环病毒科(Anelloviridae)、虹彩病毒科(Bacillariodnaviridae)、二分DNA病毒科(Bidnaviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、双生病毒(Geminiviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、矮化病毒科(Nanoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)和Spiraviridae。在一些实施方案中,本发明的至少一种RNA不是来自dsRNA病毒的RNA。更优选地,本发明的至少一种RNA不是来自以下病毒科的病毒的RNA:Alternaviridae、混合病毒科(Amalgaviridae)、双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、金色病毒科(Chrysoviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、内源RNA病毒科(Endornaviridae)、低毒病毒科(Hypoviridae)、分体病毒科(Partitiviridae)、小双节病毒科(Picobirnaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)和整体病毒科(Totiviridae)。根据优选的实施方案,本发明的至少一种RNA不是来自(+)ssRNA病毒的RNA。更优选地,本发明的至少一种RNA不是来自以下病毒科的病毒的RNA:动脉炎病毒科(Arteriviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、海洋病毒科(Mesoniviridae)、杆套病毒科(Roniviridae)、二顺反子病毒科(Dicistroviridae)、传染性软腐病病毒科(Iflaviridae)、海洋RNA病毒科(Marnaviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、甲型线形病毒科(Alphaflexiviridae)、乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)、丙型线形病毒科(Gammaflexiviridae)、芜菁发黄镶嵌病毒科(Tymoviridae)、Alphatetraviridae、Alvernaviridae、星状病毒科(Astroviridae)、杆菌状核糖核酸病毒科(Barnaviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、Carmotetraviridae、修道院病毒科(Closteroviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、黄症病毒科(Luteoviridae)、裸露核糖核酸病毒科(Narnaviridae)、野田病毒科(Nodaviridae)、Permutotetraviridae、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)和帚状病毒科(Virgaviridae)。根据本发明的一个实施方案,本发明的至少一种RNA不是来自(-)ssRNA病毒的RNA。更优选地,本发明的至少一种RNA不是来自以下病毒科的病毒的RNA:波纳病毒科(Bornaviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、Nyamiviridae、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、蛇形病毒科(Ophioviridae)和正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。优选地,本发明的所述至少一种RNA不是来自ssRNA-RT病毒(反转录病毒)的RNA。更优选地,本发明的所述至少一种RNA不是来自以下病毒科的病毒的RNA:转座病毒科(Metaviridae)、假病毒科(Pseudoviridae)和逆转录病毒科(Retroviridae)。在一些实施方案中,本发明的所述至少一种RNA不是来自dsDNA-RT病毒(副反转录病毒)的RNA。更优选地,本发明的所述至少一种RNA不是来自以下病毒科的病毒的RNA:肝去氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)或花椰菜病毒科(Caulimoviridae)。或者,本发明的所述至少一种RNA不是来自以下病毒科的病毒的RNA:披膜病毒科(Togaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)和痘病毒科(Poxviridae)。根据某些实施方案,本发明的所述至少一种RNA不是来自甲病毒属(alphavirus)、慢病毒属(lentivirus)、腺病毒属(adenovirus)或痘病毒属(poxvirus)的RNA。优选地,本发明的所述至少一种RNA不是来自甲病毒属的RNA。更优选地,本发明的所述至少一种RNA不是来自西门利克森林病毒(SFV)、辛德毕斯(SIN)病毒或委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的RNA。如本文所用的,术语“RNA”或“RNA分子”通常指单链或双链RNA分子。在优选的实施方案中,本发明方法的至少一种RNA是单链RNA分子。在其他实施方案中,步骤a)中提供的液体中包含的至少一种RNA是编码RNA分子或免疫刺激性RNA分子,其优选如本文所定义的。在本发明方法的情况下,所述至少一种RNA可以是编码蛋白质或肽的编码RNA分子,所述蛋白质或肽可以选自而不限于例如治疗活性蛋白质或肽,其选自例如佐剂蛋白、抗原例如肿瘤抗原、病原性抗原(例如选自动物抗原、病毒抗原、原生动物抗原、细菌抗原)、过敏性抗原、自身免疫抗原、或其他抗原、其优选如本文所定义的、过敏原、抗体、免疫刺激性蛋白或肽、抗原特异性T细胞受体、或适合于特定(治疗性)应用的任何其他蛋白质或肽,其中所述编码RNA分子可以被转运到细胞、组织或生物体中,随后蛋白质可以在该细胞、组织或生物体中被表达。在特别优选的实施方案中,在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的所述至少一种RNA是mRNA分子。包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA还可以是免疫刺激性RNA分子,例如本领域已知的能够诱导免疫应答任何RNA分子,优选先天性免疫应答的RNA分子。这种免疫刺激性RNA可以是本文所定义的任何(双链或单链)RNA,例如编码RNA。在优选的实施方案中,免疫刺激性RNA是非编码RNA。优选地,免疫刺激性RNA可以是单链、双链或部分双链RNA,更优选单链RNA,和/或环状或线性RNA,更优选线性RNA。更优选地,所述免疫刺激性RNA可以是(线性)单链RNA。甚至更优选地,免疫刺激性RNA可以是(长)(线性)单链)非编码RNA。在本文中,特别优选的是isRNA在其5′端携带三磷酸酯,这是对于体外转录RNA的情况。免疫刺激性RNA也可以以短RNA寡核苷酸的形式出现,优选如本文所定义的。如本文所使用的,所述免疫刺激性RNA还可以选自在自然界中发现的或人工制备的任何类型的RNA分子,并且其可以诱导先天性免疫应答,和可以支持由抗原诱导的适应性免疫应答。在本文中,免疫应答可以以多种方式发生。合适的(适应性)免疫应答的基本因素是不同T细胞亚群的刺激。T淋巴细胞通常分为两个亚种群,T-辅助1(Th1)细胞和T-辅助2(Th2)细胞,免疫系统通过其能够摧毁细胞内(Th1)和细胞外(Th2)的病原体(如抗原)。两种Th细胞群的不同在于由其产生的效应蛋白质(因子)的模式。因此,Th1细胞通过激活巨噬细胞和细胞毒性T细胞来辅助细胞免疫应答。另一方面,Th2细胞通过刺激B细胞转化为浆细胞并通过形成抗体(例如对抗抗原)来促进体液免疫应答。因此,Th1/Th2比值在诱导和维持适应性免疫应答中是非常重要的。结合本发明,(适应性)免疫应答的Th1/Th2比值优选地偏向细胞应答(Th1应答),从而诱导细胞免疫应答。根据一个实例,可以支持适应性免疫应答的先天性免疫系统可以由Toll样受体(TLR)的配体激活。TLR是高度保守模式的识别受体(PRR)多肽的家族,其识别病原体相关分子模式(PAMP),并在哺乳动物的先天性免疫中发挥关键作用。目前,已经确定了指定为TLR1至TLR13的至少十三种家族成员(Toll样受体:TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13)。此外,已经确定了若干特异性TLR配体。例如,发现了未甲基化的细菌DNA及其合成类似物(CpGDNA)是TLR9的配体(HemmiH等人(2000)Nature408:740-5;BauerS等人(2001)ProcNatlAcadSciUSA98,9237-42)。此外,报道了某些包括某些核酸分子的TLR的配体,以及报道了某些类型的RNA是以非序列依赖性或序列依赖性方式进行免疫刺激,其中这些不同免疫刺激性RNA可以例如刺激TLR3、TLR7、或TLR8、或细胞内受体如RIG-1、MDA-5等。例如Lipford等人通过TLR7和TLR8的作用确定某些含有G、U的寡核糖核苷酸为免疫刺激性的(参见WO03/086280)。Lipford等人描述的免疫刺激性含有G、U的寡核糖核苷酸被认为是来自RNA源,其包括核糖体RNA、转运RNA、信使RNA和病毒RNA。因此,本文所用的免疫刺激性RNA(isRNA)可以包含增强宿主免疫应答的任何RNA序列。优选地,用作包含在步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA的isRNA增强免疫应答,其优选是适应性免疫应答,其优选由第二或其他核酸分子、优选mRNA编码的肽或蛋白质引发,其与包含在步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA联合施用于宿主。因此,本文所用的isRNA可以包含已知是免疫刺激性的任何RNA序列,其包括但不限于代表和/或编码TLR配体的RNA序列,用于RNA细胞内受体的配体(例如RIG-1或MDA-5等)(参见例如Meylan,E.,Tschopp,J.(2006),Toll-likereceptorsandRNAhelicases:twoparallelwaystotriggerantiviralresponses.Mol.Cell22,561-569),或任何其他的免疫刺激性RNA序列,TLR配体优选选自人家族成员TLR1至TLR10或小鼠家族成员TLR1至TLR13,更优选选自(人)家族成员TLR1至TLR10,甚至更优选选自TLR7和TLR8。此外,免疫刺激性RNA分子(的种类)可以包括能够引发先天性免疫应答的任何其他RNA。这种免疫刺激性RNA可以包括核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)和病毒RNA(vRNA),但不限于此。这种免疫刺激性RNA可以包括1000至5000、500至5000、5至5000、或5至1000、5至500、5至250、5至100、5至50、或5至30个核苷酸的长度。在本文中特别优选的是如WO2009/095226中所描述的免疫刺激性RNA分子。在优选的实施方案中,包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA包含至少一种修饰,优选如本文所述的修饰。或者或另外,步骤a)中提供的液体可以包含第二或其他RNA分子(不同于所述至少一种RNA分子),其包含优选如本文所述的至少一个修饰。根据优选的实施方案,包括在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA包括RNA修饰,其优选地增加所述至少一种RNA的稳定性和/或由至少一种RNA编码的蛋白质的表达。几种RNA修饰是本领域已知的,其可以应用于本发明情况下的RNA分子。化学修饰:本文所用的术语“RNA修饰”可以指包括骨架修饰以及糖修饰或碱基修饰的化学修饰。在本文中,本文所定义的经修饰的RNA分子可以含有核苷酸类似物/修饰,例如骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明相关的骨架修饰是其中本文所定义的RNA分子中包含的核苷酸骨架的磷酸酯被化学修饰的修饰。与本发明相关的糖修饰是本文所定义的RNA分子的核苷酸的糖的化学修饰。此外,与本发明相关的碱基修饰是RNA分子的核苷酸的碱基基团的化学修饰。在本文中,核苷酸类似物或修饰优选地选自适用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。糖修饰:可以成为本文所描述的经修饰的RNA分子一部分的经修饰的核苷和核苷酸可以在糖部分中被修饰。例如,2′羟基(OH)可以被修饰或用多个不同的“氧基”或“脱氧基”取代基取代。“氧基”-2′羟基修饰的实例包括但不限于烷氧基或芳氧基(-OR,例如R=H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖);聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR;其中例如通过亚甲基桥将2′羟基连接到同一个核糖的4′碳的“锁”核酸(LNA);以及氨基(-O-氨基,其中氨基如NRR可以是烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、或二杂芳基氨基、乙二胺、多氨基)或氨基烷氧基。“脱氧基”修饰包括氢、氨基(例如NH2;烷氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基、或氨基酸);或氨基可以通过连接基连接至糖,其中所述连接基包含原子C、N和O中的一个或更多个。糖基团也可以包含具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型的一个或更多个碳。因此,经修饰的RNA分子可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。骨架修饰:可以在经修饰的核苷和核苷酸中进一步修饰磷酸酯骨架,其可以成为本文所描述的经修饰的RNA分子的一部分。可以通过用不同取代基替代一个或更多个氧原子来修饰骨架的磷酸酯基团。此外,经修饰的核苷和核苷酸可以包括用本文所描述的经修饰的磷酸酯完全替代未经修饰的磷酸酯部分。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒酸磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、氢化膦酸酯、磷酸酰胺化物、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有被硫替代的两个非连接氧。磷酸酯连接基也可以通过用氮(桥连的磷酸酰胺化物)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧进行修饰。碱基修饰:可以成为本文所描述的经修饰的RNA分子一部分的经修饰的核苷和核苷酸可以进一步在核碱基部分进行修饰。在RNA中发现的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如,本文所描述的核苷和核苷酸可以在大沟面上进行化学修饰。在一些实施方案中,大沟化学修饰可以包括氨基、巯基、烷基或卤素基团。在本发明特别优选的实施方案中,核苷酸类似物/修饰选自碱基修饰,其优选地选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5′-三磷酸酯、2-氨基嘌呤-核苷-5′-三磷酸酯、2-氨基腺苷-5′-三磷酸酯、2′-氨基-2′-脱氧胞苷-三磷酸酯、2-硫代胞苷-5′-三磷酸酯、2-硫尿核苷-5′-三磷酸酯、2′-氟胸苷-5′-三磷酸酯、2′-O-甲基肌苷-5′-三磷酸酯、4-硫尿核苷-5′-三磷酸酯、5-氨基烯丙基胞苷-5′-三磷酸酯、5-氨基烯丙基尿苷-5′-三磷酸酯、5-溴胞苷-5′-三磷酸酯、5-溴尿苷-5′-三磷酸酯、5-溴-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸酯、5-溴-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸酯、5-碘胞苷-5′-三磷酸酯、5-碘-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸酯、5-碘尿苷-5′-三磷酸酯、5-碘-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸酯、5-甲基胞苷-5′-三磷酸酯、5-甲基尿苷-5′-三磷酸酯、5-丙炔基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸酯、5-丙炔基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸酯、6-氮杂胞苷-5′-三磷酸酯、6-氮杂尿苷-5′-三磷酸酯、6-氯嘌呤核苷-5′三磷酸酯、7-脱氮腺苷-5′-三磷酸酯、7-脱氮鸟苷-5′-三磷酸酯、8-氮杂腺苷-5′-三磷酸酯、8-叠氮腺苷-5′-三磷酸酯、苯并咪唑-核苷-5′-三磷酸酯、N1-甲基腺苷-5′-三磷酸酯、N1-甲基鸟苷-5′-三磷酸酯、N6-甲基腺苷-5′-三磷酸酯、O6-甲基鸟苷-5′-三磷酸酯、假尿苷-5′-三磷酸酯或嘌呤霉素-5′-三磷酸酯、黄嘌呤核苷-5′-三磷酸酯。用于碱基修饰的核苷酸特别优选地选自以下经碱基修饰的核苷酸:5-甲基胞苷-5′-三磷酸酯、7-脱氮鸟嘌呤-5′-三磷酸酯、5-溴胞苷-5′-三磷酸酯和假尿苷-5′-三磷酸酯。在一些实施方案中,经修饰的核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫尿核苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫尿核苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基-假尿苷、和4-甲氧基-2-硫代假尿苷。在一些实施方案中,经修饰的核苷包括5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。在其他实施方案中,经修饰的核苷包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。在其他实施方案中,经修饰的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代鸟苷、6-硫代-7-脱氮鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。在一些实施方案中,核苷酸可以在大沟面上修饰,并且可以包括用甲基或卤素基团替代尿嘧啶C-5上的氢。在具体的实施方案中,经修饰的核苷是5′-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5′-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5′-O-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷、5′-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷或5′-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷。在另外的具体实施方案中,经修饰的RNA可以包含选自以下的核苷修饰:6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘代-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯代-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假异胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷。脂质修饰:根据其他实施方案,本文所定义的经修饰的RNA分子可以含有脂质修饰。这种经脂质修饰的RNA分子通常包含本文所定义的RNA。本文定义的这种经脂质修饰的RNA分子通常还包含与该RNA分子共价连接的至少一个连接基和与相应连接基共价连接的至少一种脂质。或者,经脂质修饰的RNA分子包含本文所定义的至少一种RNA分子和与所述RNA分子共价连接(不含连接基)的至少一种(双官能团)脂质。根据第三种替代方案,经脂质修饰的RNA分子包含本文所定义的RNA分子,与该RNA分子共价连接的至少一个连接基,与每个连接基共价连接的至少一种脂质,以及与所述RNA分子共价连接(无连接基)的至少一种(双官能团)脂质。在本文中,特别优选的是脂质修饰存在于线性RNA序列的末端。经修饰的RNA分子的5′端修饰:根据本发明的另一个优选实施方案,可以通过添加所谓“5′帽”结构来修饰本文所定义的经修饰的RNA分子。5′-帽是实体,通常是经修饰的核苷酸实体,其通常“加帽于”成熟mRNA的5′端。5′-帽通常可以通过经修饰的核苷酸,特别是通过鸟嘌呤核苷酸的衍生物而形成。优选地,5′-帽经由5′-5′三磷酸酯键连接到5′-末端。5′-帽可以被甲基化,例如m7GpppN,其中N是携带5′-帽的核酸的末端5’核苷,通常是RNA的5′末端。m7GpppN是天然存在于由聚合酶II转录的mRNA中的5′-帽结构,并因此在本文中不认为是包含在经修饰的RNA中的修饰。由此,本发明的经修饰的RNA可以包含m7GpppN作为5′-帽,但此外,经修饰的RNA包含本文所定义的至少一个其他修饰。5′-帽结构的其他实例包括甘油基、反式脱氧脱碱基残基(部分)、4′,5′亚甲基核苷酸、1-(β-D-红呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、经修饰的碱基核苷酸、苏式-戊呋喃糖基核苷酸、无环3′,4′-断裂核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5-二羟基戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷部分、3′-3′-反向脱碱基部分、3′-2′-反向核苷酸部分、3′-2′-反向脱碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3′-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3′-磷酸酯、3′-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。这些经修饰的5′-帽结构视为在本文中的至少一种修饰。特别优选的经修饰的5′-CAP结构是CAP1(m7G相邻核苷酸的核糖甲基化)、CAP2(m7G下游第2个核苷酸的核糖的甲基化)、CAP3(m7G下游第3个核苷酸的核糖的甲基化)、CAP4(m7G下游第4个核苷酸的核糖的甲基化)、ARCA(抗反向CAP类似物,经修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA))、肌苷、N1-甲基鸟苷、2′-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。在优选的实施方案中,本发明方法的步骤a)中提供的液体包含至少一种RNA,其中RNA是具有至少一个可读框的经修饰的RNA分子,该可读框编码至少一种肽或蛋白质。具有至少一个可读框的所述经修饰的RNA分子可以是至少一种RNA分子或第二或其他RNA分子,其可以包含在除了第一RNA分子外的步骤a)中提供的液体中。优选地,在这种RNA分子中的可读框序列如本文所描述地被修饰。G/C含量的修饰:在本发明特别优选的实施方案中,与其各自的野生型编码区即未经修饰的编码区域的G/C含量相比,在步骤a)中提供的液体中包含的经修饰的RNA的编码区的G/C含量被修饰,特别地被增加。相比于各自的野生型编码区的编码氨基酸序列,编码区的编码氨基酸序列优选不经修饰。本文所定义的经修饰的RNA的编码区的G/C含量的修饰是基于这样的事实:任何待翻译的mRNA区域的序列对于该mRNA的有效翻译是重要的。因此,各种核苷酸的组成和序列是重要的。特别地,具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的mRNA序列相比具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的mRNA序列更稳定。根据本发明,尽管保留了翻译的氨基酸序列,然而编码区的密码子因此与其野生型编码区不同,以使其包含提高量的G/C核苷酸。关于几个密码子编码一个和相同氨基酸(所谓遗传密码的退化)的事实,可以确定对于稳定性最有利的密码子(所谓替代密码子的使用)。取决于由本文所定义的经修饰的RNA的编码区待编码的氨基酸,存在修饰RNA序列的多种可能性,例如相比于其野生型编码区的编码区的修饰。在由仅含有G或C核苷酸的密码子编码的氨基酸的情况下,不需要修饰密码子。因此,由于不存在A或U,Pro(CCC或CCG)、Arg(CGC或CGG)、Ala(GCC或GCG)和Gly(GGC或GGG)的密码子不需要修饰。相比之下,含有A和/或U核苷酸的密码子可以通过编码相同氨基酸但不含A和/或U的其他密码子的取代来修饰。这些实例是:Pro的密码子可以由CCU或CCA修饰为CCC或CCG;Arg的密码子可以由CGU或CGA或AGA或AGG修饰为CGC或CGG;Ala的密码子可以由GCU或GCA修饰为GCC或GCG;Gly的密码子可以由GGU或GGA修饰为GGC或GGG。在其他情况下,虽然A或U核苷酸不能从密码子消除,但是可以通过使用包含较低含量的A和/或U核苷酸的密码子来降低A和U的含量。这些的实例是:Phe的密码子可以由UUU修饰为UUC;Leu的密码子可以由UUA、UUG、CUU或CUA修饰为CUC或CUG;Ser的密码子可以由UCU或UCA或AGU修饰为UCC、UCG或AGC;Tyr的密码子可以由UAU修饰为UAC;Cys的密码子可以由UGU修饰为UGC;His的密码子可以由CAU修饰为CAC;Gln的密码子可以由CAA修饰为CAG;Ile的密码子可以由AUU或AUA修饰为AUC;Thr的密码子可以由ACU或ACA修饰为ACC或ACG;Asn的密码子可以由AAU修饰为AAC;Lys的密码子可以由AAA修饰为AAG;Val的密码子可以由GUU或GUA修饰为GUC或GUG;Asp的密码子可以由GAU修饰为GAC;Glu的密码子可以由GAA修饰为GAG;终止密码子UAA可以修饰为UAG或UGA。在另一方面,在Met(AUG)和Trp(UGG)的密码子的情况下,没有序列修饰的可能性。以上列出的取代可以单独使用或以任何可能的组合使用,与其特定的野生型编码区(即原始序列)相比,增加本文所定义的经修饰的RNA编码区的G/C含量。因此,例如,出现在野生型序列中的Thr的所有密码子可以修饰为ACC(或ACG)。优选地,相比野生型编码区的G/C含量,本文所定义的经修饰的RNA的编码区的G/C含量增加至少7%,更优选增加至少15%,特别优选增加至少20%。根据具体的实施方案,编码至少一种蛋白质或肽的编码区中至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、更优选至少70%、还更优选至少80%、最优选至少90%、95%或甚至100%的可取代密码子是经取代的,由此增加所述编码区的G/C含量,至少一种蛋白质或肽包含病原性抗原或其片段、变体或其衍生物。在本文中,相比于野生型编码区,特别优选地是增加本文所定义的经修饰的RNA的编码区的G/C含量至最大(即可取代密码子的100%)。密码子优化:根据本发明,本文所定义的经修饰的RNA的编码至少一种肽或蛋白质的编码区的进一步优选的修饰是基于以下发现:翻译效率也由细胞中的tRNA出现的不同频率确定。因此,如果在野生型RNA序列的编码区中在增加的程度上存在所谓“稀有密码子”,则与存在编码相对“常见”tRNA的密码子的情况相比,mRNA以明显较低的程度被翻译。在这种情况下,相比相应得野生型编码区,经修饰的RNA的编码区优选被修饰,使得编码在细胞中相对稀有的tRNA的野生型序列的至少一种密码子被交换为编码在细胞中相对常见且携带与相对稀有tRNA相同的氨基酸的tRNA的密码子。通过该修饰,本文所定义的经修饰的RNA的编码区被修饰,使得对于频繁出现的tRNA可使用的密码子被插入。换句话说,根据本发明,通过该修饰,编码在细胞中相对稀有的tRNA的野生型编码区的所有密码子可以在各种情况下被交换为编码在细胞中相对常见并且在各种情况下携带与相对稀有的tRNA相同的氨基酸的tRNA的密码子。相比相对较少地出现的tRNA,在细胞中相对频繁地出现得tRNA是本领域技术人员已知的;参见例如Akashi,Curr.Opin.Genet.Dev2001,11(6):660-666。在最常出现的tRNA中用于特定氨基酸的密码子是特别优选的,例如使用(人)细胞中最常出现的tRNA的Gly密码子。根据本发明,特别优选的是将在本文所定义的经修饰的RNA的编码区中被提高特别是最大化的序列的G/C含量和“常见”密码子相联系,而不修饰由RNA编码区所编码的肽或蛋白质的氨基酸序列。该优选的实施方案能够提供如本文定义的特别有效地经翻译和稳定化(经修饰的)的RNA。在本发明的情况下,包含在步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA还可以包括5′和/或3′非翻译区(分别是5′-UTR或3′-UTR)。优选地,至少一种RNA包含选自5′-UTR、3′-UTR、poly(A)序列、poly(C)序列和组蛋白茎环序列中的至少一种。更优选地,至少一个RNA包含5′-CAP结构。在本发明的情况下,3′-UTR通常是mRNA的部分,其位于蛋白质编码区(即可读框)和mRNA的3′末端之间。mRNA的3′-UTR不被翻译成氨基酸序列。3′-UTR序列通常由在基因表达过程中转录成各自的mRNA的基因编码。在本发明的情况下,3′-UTR对应于成熟mRNA序列,其位于蛋白编码区的终止密码子的3′,优选紧挨着蛋白编码区的终止密码子的3′,并且其延伸到mRNA或poly(A)序列的3′末端的5′侧,优选紧挨着poly(A)序列的5′的核苷酸。术语“对应于”指3′-UTR序列可以是RNA序列,例如在用于定义3′-UTR序列的mRNA序列中的RNA序列,或DNA序列,其对应于这种RNA序列。在本发明的情况下,术语“基因的3′-UTR”、如“白蛋白基因的3′-UTR”是对应于来自该基因的成熟mRNA的3′-UTR的序列,即由基因的转录和不成熟mRNA的熟化获得的mRNA。术语“基因的3′-UTR”包括3′-UTR的DNA序列和RNA序列。优选地,根据本发明使用的3′-UTR对于mRNA序列的编码区是异源的。即使优选来自天然存在的基因的3′-UTR,也可以在本发明的情况下使用合成工程化的UTR。如本文所使用的,术语“5′-UTR”通常指信使RNA(mRNA)的特定部分。其位于mRNA的可读框的5’。通常,5′-UTR从转录起始位点开始,并在可读框的起始密码子前一个核苷酸结束。5′-UTR可以包含用于控制基因表达的元件,也称为调节元件。这种调节元件可以是例如核糖体结合位点或5′末端寡嘧啶束。5′-UTR可以经过转录后修饰,例如通过加入5′-CAP。在本发明的情况下,5′-UTR对应于位于5′-CAP和起始密码子之间的成熟mRNA的序列。优选地,5′-UTR对应于以下序列:从位于5′-CAP的3′的核苷酸,优选从位于紧挨着5′-CAP的3′的核苷酸,延伸至位于蛋白质编码区的起始密码子的5′的核苷酸,优选延伸至位于紧挨着蛋白质编码区起始密码子的5‘的核苷酸。位于紧挨着成熟mRNA的5′-CAP的3′的核苷酸通常对应于转录起始位点。术语“对应于”指5′-UTR序列可以是RNA序列,例如在用于定义5′-UTR序列的mRNA序列中,或DNA序列,其对应于这种RNA序列。在本发明的情况下,术语“基因的5′-UTR”、例如“TOP基因的5′-UTR”是对应于来自该基因的成熟mRNA的5′-UTR的序列,即通过基因的转录和早熟mRNA的熟化获得的mRNA。术语“基因的5′-UTR”包括5′-UTR的DNA序列和RNA序列。优选地,根据本发明使用的5′-UTR对于mRNA序列的编码区是异源的。即使优选来自天然存在的基因的5′-UTR,也可以在本发明的情况下使用合成工程化的UTR。在特别优选的实施方案中,包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA包括至少一个5′-非翻译区(5′-UTR)。更优选地,至少一种RNA包括5′-UTR,其包括来自TOP基因的5′-UTR或来自TOP基因的5′-UTR的片段、同系物或变体的核酸序列,或由来自TOP基因的5′-UTR或来自TOP基因的5′-UTR的片段、同系物或变体的核酸序列构成。5′末端寡嘧啶束(TOP)通常是位于核酸分子5′末端区的嘧啶核苷酸的延伸,例如某些mRNA分子的5′末端区或某些基因的功能性实体如转录区域的5′末端区域。序列开始于胞苷,其通常对应于转录起始位点,其后是通常约3至30个嘧啶核苷酸的延伸。例如,TOP可以包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或甚至更多个核苷酸。嘧啶延伸,并因此5′TOP在位于TOP下游的第一个嘌呤核苷酸的的一个核苷酸5′处结束。包含5′末端寡嘧啶束的信使RNA通常称为TOPmRNA。因此,提供这种信使RNA的基因称为TOP基因。TOP序列被发现在例如编码肽延伸因子和核糖体蛋白的基因和mRNA中。在本发明的情况下,TOP基序通常是核酸序列,其对应于上文所定义的5′TOP。因此,在本发明的情况下,TOP基序优选为具有3至30个核苷酸长度的嘧啶核苷酸的延伸。优选地,TOP基序由至少3个嘧啶核苷酸、优选至少4个嘧啶核苷酸、优选至少5个嘧啶核苷酸、更优选至少6个核苷酸、更优选至少7个核苷酸、最优选至少8个嘧啶核苷酸构成,其中嘧啶核苷酸的延伸优选在其5′端处以胞嘧啶核苷酸开始。在TOP基因和TOP的mRNA中,TOP基序优选在其5′端处以转录起始位点开始,并在所述基因或mRNA的第一个嘌呤残基的一个核苷酸5′处结束。在本发明意义上的TOP基序优选地位于代表5′-UTR序列的5’端,或位于编码5′-UTR的序列的5′端。因此,优选地,如果3个或更多个嘧啶核苷酸的延伸位于各个序列如本发明的mRNA、本发明的mRNA的5′-UTR、或来自本文所描述的TOP基因的5′-UTR的核酸序列的5′端,则该3个或更多个嘧啶核苷酸的延伸称为本发明意义上的“TOP基序”。换句话说,不位于5′-UTR的5′端而是位于5′-UTR中的任何地方的3个或更多个嘧啶核苷酸的延伸优选地不称为“TOP基序”。在本文中,TOP基因的特征通常在于5′末端寡嘧啶束的存在。此外,大多数TOP基因的特征在于与生长相关的翻译调节。然而,具有组织特异性翻译调节的TOP基因也是已知的。如上所述,TOP基因的5′-UTR对应于来自TOP基因的成熟mRNA的5′-UTR的序列,其优选从位于5-CAP的3′的核苷酸延伸至位于起始密码子的5′的核苷酸。TOP基因的5′-UTR通常不包含任何起始密码子,优选不包含上游AUG(uAUG)或上游可读框(uORF)。其中,上游AUG和上游可读框通常被理解为存在应该被翻译的可读框的起始密码子(AUG)的5′的AUG和可读框。TOP基因的5′-UTR通常相当短。TOP基因的5′-UTR长度可以是20个至最多500个核苷酸,并且通常小于约200个核苷酸,优选小于约150个核苷酸,更优选小于约100个核苷酸。本发明意义上的TOP基因的5′-UTR的实例为:在根据国际专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1至1363、SEQIDNO.1395、SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的序列或其同系物或变体中,从在5位的核苷酸延伸至紧邻起始密码子(例如ATG)的5′的核苷酸的核苷酸序列,该国际专利申请WO2013/143700的公开内容通过引用并入本文。在本文中,特别优选的TOP基因的5′-UTR的片段是缺乏5′TOP基序的TOP基因的5′-UTR。术语“TOP基因的5′-UTR”优选指天然存在的TOP基因的5′-UTR。在具体的实施方案中,5′-UTR不包括本文所定义的的TOP基序或5′TOP。在一些实施方案中,来自TOP基因的5′-UTR的5′-UTR的核酸序列终止在其3′端,并以位于基因或来自该基因的mRNA的起始密码子(例如A(U/T)G)上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位的核苷酸终止。因此,5′-UTR不包括蛋白编码区的任何部分。因此,优选地,本发明mRNA序列的唯一蛋白质编码部分由编码区提供。来自TOP基因的5′-UTR的核酸序列优选来自真核TOP基因,优选植物或动物TOP基因,更优选脊索动物TOP基因,甚至更优选脊椎动物TOP基因,最优选哺乳动物TOP基因,例如人TOP基因。例如,5′-UTR优选包含选自来自以下核酸序列的核酸序列或由其组成:专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1至1363、SEQIDNO.1395、SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422、专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1至1363、SEQIDNO.1395、SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的同系物、其变体,或优选对应的RNA序列,专利申请WO2013/143700的公开内容通过引用并入本文。术语“专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1至1363、SEQIDNO.1395、SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的同系物”指除了智人的其他物种的序列,其与根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1至1363、SEQIDNO.1395、SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的序列是同源的。在优选的实施方案中,5′-UTR包含以下核酸序列或由其组成,该核酸序列来自从核苷酸5位(即在该序列中位于5位的核苷酸)延伸至紧邻起始密码子的5′(位于序列的3′端)的核苷酸位的核酸序列,例如延伸至紧邻ATG序列5′的核苷酸位,起始密码子为选自以下的核酸序列中的:专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1至1363、SEQIDNO.1395、SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422、专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1至1363、SEQIDNO.1395、SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的同系物、其变体,或相应的RNA序列。特别优选的是,5′UTR来自以下核酸序列,其从紧邻5′TOP的3′的核苷酸位延伸至紧邻起始密码子的5′的核苷酸位(位于该序列3′端),例如紧邻ATG序列的5′的核苷酸位,起始密码子选自以下核酸序列:专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1至1363、SEQIDNO.1395、SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422,专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1至1363、SEQIDNO.1395、SEQIDNO.1421和SEQIDNO.1422的同系物、其变体,或相应的RNA序列。在特别优选的实施方案中,5′-UTR包含以下核酸序列或由其组成,该核酸序列来自核糖体蛋白基因的5′-UTR,优选来自编码核糖体蛋白的TOP基因的5′-UTR或来自编码核糖体蛋白的TOP基因的5′-UTR的变体。例如,5′-UTR包括以下核酸序列或由其组成,该核酸序列来自本文所描述的根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.67、170、193、244、259、554、650、675、700、721、913、1016、1063、1120、1138和1284-1360中的任意核酸序列的5′-UTR、相应的RNA序列、其同系物或其变体,其优选缺少5′TOP基序。如上文所描述,从5位延伸至紧邻ATG的5′的核苷酸(其位于该序列的3′端)的序列对应于所述序列的5′-UTR。优选地,5′-UTR包含以下核酸序列或由其组成,该核酸序列来自编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5′-UTR或来自编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5′-UTR的同系物或变体。例如,5′-UTR包含以下核酸序列或由其组成,该核酸序列来自本文所描述的根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.67、259、1284至1318、1344、1346、1348至1354、1357、1358、1421和1422中任意核酸序列的5′-UTR、相应的RNA序列、其同系物或其变体,其优选缺少5′TOP基序。在特别优选的实施方案中,5′-UTR包含以下核酸序列或由其组成,该核酸序列来自核糖体蛋白大32基因的5′-UTR,优选来自脊椎动物核糖体蛋白大32(L32)基因,更优选来自哺乳动物核糖体蛋白大32(L32)基因,最优选来自人核糖体蛋白32的大(L32)基因,或来自核糖体蛋白大32基因的5′-UTR的变体,优选来自脊椎动物核糖体蛋白32的大(L32)基因的变体,更优选来自哺乳动物核糖体蛋白大32(L32)基因的变体,最优选来自人核糖体蛋白32的大(L32)基因的变体,其中优选地5′-UTR不包含所述基因的5′TOP。5′-UTR元件的优选序列对应于专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1368,其内容如下:5′-UTR元件的核苷酸序列(SEOIDNO.4)GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC因此,在特别优选的实施方案中,5′-UTR包括以下核酸序列或由其组成,相对于根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1368的核酸序列(缺乏5’端寡嘧啶束的人核糖体蛋白大32的5′-UTR,SEQIDNO.4)或优选地相对于对应的RNA序列,具有至少约40%,优选至少约50%,优选至少约60%,优选至少约70%,更优选至少约80%,更优选至少约90%,甚至更优选至少约95%,甚至更优选至少约99%的同一性的核酸序列,或其中至少一个5′-UTR包括核酸序列的片段或由其组成:相对于根据SEQIDNO.4的核酸序列或更优选地相对于对应的RNA序列,具有至少约40%,优选至少约50%,优选至少约60%,优选至少约70%,更优选至少约80%,更优选至少约90%,还更优选至少约95%,还更优选至少约99%的同一性的核酸序列片段,其中,优选地,该片段为如上文所描述的,即是代表全长的5′-UTR中的至少20%等的核苷酸的连续延伸。优选地,片段显示出至少约20个核苷酸或更多,优选至少约30个核苷酸或更多,更优选至少约40个核苷酸或更多的长度。优选地,该片段是如本文所描述的功能性片段。在一些实施方案中,至少一种RNA包含5′-UTR,其包含来自脊椎动物TOP基因的5’-UTR的核酸序列或由其组成,该脊椎动物TOP基因例如哺乳动物TOP基因,例如人TOP基因,其选自RPSA、RPS2、RPS3、RPS3A、RPS4、RPS5、RPS6、RPS7、RPS8、RPS9、RPS10、RPS11、RPS12、RPS13、RPS14、RPS15、RPS15A、RPS16、RPS17、RPS18、RPS19、RPS20、RPS21、RPS23、RPS24、RPS25、RPS26、RPS27、RPS27A、RPS28、RPS29、RPS30、RPL3、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPL9、RPL10、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL27A、RPL28、RPL29、RPL30、RPL31、RPL32、RPL34、RPL35、RPL35A、RPL36、RPL36A、RPL37、RPL37A、RPL38、RPL39、RPL40、RPL41、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPLP3、RPLP0、RPLP1、RPLP2、EEF1A1、EEF1B2、EEF1D、EEF1G、EEF2、EIF3E、EIF3F、EIF3H、EIF2S3、EIF3C、EIF3K、EIF3EIP、EIF4A2、PABPC1、HNRNPA1、TPT1、TUBB1、UBA52、NPM1、ATP5G2、GNB2L1、NME2、UQCRB、或其同系物或变体,其中优选地,5′-UTR不包含所述基因的TOP基序或5’TOP,其中任选地,5′-UTR在其5′端以位于5′末端寡嘧啶束(TOP)下游的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位开始,其中还任选地,来自TOP基因的5′-UTR的5′-UTR在其3′端以来自其的基因的起始密码子(A(U/T)G)上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位的核苷酸终止。在更特别优选的实施方案中,5′-UTR包含以下核酸序列或由其组成,该核酸序列来自核糖体蛋白质大32基因(RPL32)、核糖体蛋白质大35基因(RPL35)、核糖体蛋白大21基因(RPL21)、ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合体、α亚基1、心肌(ATP5A1)基因、羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、雄激素诱导型1基因(AIG1)、细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)、或N-酰基神经鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体的5′-UTR,优选地,来自脊椎动物核糖体蛋白质大32基因(RPL32)、脊椎动物核糖体蛋白大35基因(RPL35)、脊椎动物核糖体蛋白大21基因(RPL21)、脊椎动物ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合体、α亚基1、心肌(ATP5A1)基因、脊椎动物羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、脊椎动物雄激素诱导型1基因(AIG1)、脊椎动物细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)、或脊椎动物N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体的5′-UTR,更优选地,来自哺乳动物核糖体蛋白质大32基因(RPL32)、核糖体蛋白大35基因(RPL35)、核糖体蛋白21大基因(RPL21)、哺乳动物ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合体、α亚基1、心肌(ATP5A1)基因、哺乳动物羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、哺乳动物雄激素诱导型1基因(AIG1)、哺乳动物细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)、或哺乳动物N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体的5′-UTR,最优选地,来自人核糖体蛋白质大32基因(RPL32)、人核糖体蛋白质大35基因(RPL35)、人核糖体蛋白质大21基因(RPL21)、人ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚基1、心肌(ATP5A1)基因、人羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、人雄激素诱导型1基因(AIG1)、人细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)、或人N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体的5′-UTR,其中优选地,5′-UTR不包含所述基因的5′TOP。因此,在特别优选的实施方案中,5′-UTR包括以下核酸序列或由其组成,相对于根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1368、或SEQIDNO.1412至1420或对应的RNA序列,具有至少约40%,优选至少约50%,优选至少约60%,优选至少约70%,更优选至少约80%,更优选至少约90%,还更优选至少约95%,甚至更优选至少约99%的同一性的核酸序列,或其中至少一种5′-UTR包括以下核酸序列的片段或由其组成,相对于根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1368、或SEQIDNO.1412至1420,具有至少约40%,优选至少约50%,优选至少约60%,优选至少约70%,更优选至少约80%,更优选至少约90%,还更优选至少约95%,还更优选至少约99%的同一性的核酸序列的片段,其中,优选地,该片段是上文所描述的,即是代表全长的5′-UTR中的至少20%等的核苷酸的连续延伸。优选地,该片段具有至少约20个核苷酸或更多,优选至少约30个核苷酸或更多,更优选至少约40个核苷酸或更多的长度。优选地,该片段是如本文所描述的功能性片段。因此,在特别优选的实施方案中,5′-UTR包括以下核酸序列或由其组成,相对于根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1414(缺少5′末端寡嘧啶束的ATP5A1的5′-UTR)或优选地对应的RNA序列,具有至少约40%,优选至少约50%,优选至少约60%,优选至少约70%,更优选至少约80%,更优选至少约90%,还更优选至少约95%,还更优选至少约99%的同一性的核酸序列,或其中所述至少一种5′-UTR包括以下核酸序列的片段或由其组成,相对于根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1414或更优选地对应的RNA序列,其具有至少约40%,优选至少约50%,优选至少约60%,优选至少约70%,更优选至少约80%,更优选至少约90%,甚至更优选至少约95%,甚至更优选至少约99%的同一性的核酸序列的片段,其中,优选地,该片段是上文所描述的,即是代表全长的5′-UTR中的至少20%等的核苷酸的连续段。优选地,该片段具有至少约20个核苷酸或更多,优选至少约30个核苷酸或更多,更优选至少约40个核苷酸或更多的的长度。优选地,所述片段是本文所描述的功能性片段。在特别优选的实施方案中,包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA包括至少一个3′-UTR。更优选地,所述至少一种RNA包含含有以下核酸序列或由其组成的3′-UTR,该核酸序列来自脊索动物基因、优选脊椎动物基因、更优选哺乳动物基因、最优选人基因的3′-UTR,或该核酸序列来自脊索动物基因、优选脊椎动物基因、更优选哺乳动物基因、最优选人基因的3′-UTR的变体。优选地,所述至少一种RNA包含以下3′-UTR,其可以是来自与具有增加半衰期的mRNA(这提供稳定mRNA)相关的基因,例如下文所定义和描述的3′-UTR。在特别优选的实施方案中,3′-UTR包括以下核酸序列或由其组成,该核酸序列来自选自以下基因的3′-UTR:白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因、和胶原蛋白α基因例如胶原α1(I)基因,或来自选自以下基因的3′-UTR的变体:白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因、和胶原蛋白α基因,例如根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1369至1390的胶原α1(I)基因,该专利申请的公开内容通过引用并入本文。在特别优选的实施方案中,3′-UTR包含以下核酸序列或由其组成,该核酸序列来自根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1369的白蛋白基因、优选脊椎动物白蛋白基因、更优选哺乳动物白蛋白基因、最优选人白蛋白基因的3′-UTR。mRNA序列可以包含来自根据Genbank登记编号NM_000477.5的人白蛋白基因的3′-UTR或其片段或变体的核酸序列,或由其组成。在本文中,特别优选地,至少一种RNA包含3′-UTR,其包含来自根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1369至1390的核酸序列的对应的RNA序列或其片段、同系物或变体。最优选地,3′-UTR包含来自根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNo.1376的人白蛋白基因片段的核酸序列,在下文中称为SEQIDNO.5。人白蛋白基因的3′-UTR元件的核苷酸序列(SEOIDNO.5)CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCT在另一个特别优选的实施方案中,3′-UTR包含以下核酸序列或由其组成,其来自α-球蛋白基因、优选脊椎动物α-球蛋白基因或β-球蛋白基因、更优选哺乳动物α-球蛋白基因或β-球蛋白基因、最优选人α-球蛋白基因或β-球蛋白基因的3′-UTR,以上基因是根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1370(智人血红蛋白的3′-UTR,α1(HBA1))或根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1371(智人血红蛋白的3′-UTR,α2(HBA2)),或根据专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1372(智人血红蛋白的3′-UTR,β(HBB))。例如,3′-UTR可以包含α-球蛋白基因的3′-UTR的α-复合物结合部分的中心或由其组成,例如人α-球蛋白基因,其优选为根据SEQIDNO.6(相当于专利申请WO2013/143700的SEQIDNO.1393)。α-球蛋白基因的3′-UTR元件的核苷酸序列(SEQIDNO.6)GCCCGATGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCG在本文中,特别优选的是,至少一种RNA的3′-UTR包含根据上文的核酸序列的对应RNA序列或其同系物、片段或变体,或由其组成。术语“来自[……]基因的3′-UTR的核酸序列”优选地指基于[……]基因的3′-UTR序列的核酸序列或基于其部分的3′-UTR序列的核酸序列,例如基于白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因或胶原蛋白α基因,胶原蛋白α基因的3′-UTR,例如胶原蛋白α1(I)基因的3′-UTR,优选白蛋白基因的3′-UTR,或基于其部分的3′-UTR。该术语包括对应于整个3′-UTR序列的序列,即基因的全长3′-UTR序列,以及对应于基因的3′-UTR序列的片段的序列,基因例如白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因、或胶原蛋白α基因,例如胶原α1(I)基因,优选白蛋白基因。术语“衍生自[……]基因的3′-UTR的变体的核酸序列”优选地指基于基因的3′-UTR序列的变体的核酸序列,例如基于白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因、或胶原蛋白α基因如上文所描述的胶原α1(I)基因的3′-UTR的变体,或基于其部分的3′-UTR的变体。该术语包括对应于基因的3′-UTR的变体的整个序列的序列,即基因的全长的变体3′-UTR序列,以及对应于基因的变体3′-UTR序列的片段的序列。本文中的片段优选由对应于全长的变体3′-UTR中核苷酸的连续延伸的核苷酸连续延伸组成,核苷酸连续延伸代表至少20%、优选至少30%、更优选至少40%、更优选至少50%、还更优选至少60%、还更优选至少70%、还更优选至少80%、最优选至少90%的全长的变体3′-UTR。在本发明的意义上,这种变体的片段优选为本文所描述的变体的功能性片段。优选地,至少一种5’-UTR和至少一种3’-UTR起协同作用以增加来自本发明方法的步骤a)中提供的液体中包含的至少一种RNA的蛋白质产生。在一个特别优选的实施方案中,包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA包含组蛋白茎-环序列/结构。这种组蛋白茎-环序列优选地选自如WO2012/019780中公开的组蛋白茎-环序列,其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的组蛋白茎-环序列优选选自下式(I)或(II)中的至少一种:式(I)(没有茎边界元件的茎-环序列):式(II)(有茎边界元件的茎-环序列):其中:茎1或茎2的边界元件N1-6是1至6、优选2至6、更优选2至5、甚至更优选3至5、最优选4至5、或5N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;茎1[N0-2GN3-5]与元件茎2反向互补或部分反向互补,是5至7个核苷酸的连续序列;其中N0-2是0至2、优选0至1、更优选1N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;其中N3-5是3至5、优选4至5、更优选4N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;其中G是鸟苷或其类似物,并且可以任选地被胞苷或其类似物替代,条件是其在茎2中的互补核苷酸胞苷被鸟苷替代;环序列[N0-4(U/T)N0-4]位于元件茎1和茎2之间,是3至5个核苷酸、更优选4个核苷酸的连续序列;其中每个N0-4彼此独立地是0至4、优选1至3、更优选1至2N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自A、U、T、G和C或其核苷酸类似物;其中U/T表示尿苷或任选的胸苷;茎2[N3-5CN0-2]与元件茎1反向互补或部分反向互补,是5至7个核苷酸的连续序列;其中N3-5是3至5、优选4至5、更优选4N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自A、U、T、G和C的核苷酸或其核苷酸类似物;其中N0-2是0至2、优选0至1、更优选1N的连续序列,其中每个N彼此独立地选自A、U、T、G或C的核苷酸或其核苷酸类似物;其中C是胞苷或其类似物,并且可以任选地被鸟苷或其类似物替代,条件是茎1中的其互补核苷鸟苷被胞苷替代;其中,茎1和茎2能够彼此碱基配对形成反向互补序列,其中碱基配对可以在茎1和茎2之间发生,例如通过核苷酸A和U/T或G和C的Watson-Crick碱基配对或非Watson-Crick碱基配对,例如摆动碱基配对、反向Watson-Crick碱基配对、Hoogsteen碱基配对、反向Hoogsteen碱基配对,或茎1和茎2能够彼此碱基配对形成部分反向互补序列,其中在茎1和茎2之间可以发生不完全碱基配对,其基于在一个茎中的一个或更多个碱基在另一个茎的反向互补序列中不具有互补碱基。根据本发明第一方面的另一个优选实施方案,本文所定义的本发明的聚合物载体货物复合物的核酸分子和/或与聚合物载体货物复合物组合施用的第二核酸分子可以包含根据以下具体式(Ia)或(IIa)中至少一个的至少一个组蛋白茎-环序列:式(Ia)(没有茎边界元件的茎-环序列):式(IIa)(有茎边界元件的茎-环序列):其中:N、C、G、T和U为如上文所定义的。根据第一方面的其他更特别优选的实施方案,本文所定义的本发明的聚合物载体货物复合物的核酸分子和/或与聚合物载体货物复合物组合施用的第二核酸分子可以包含根据以下具体式(Ib)或(IIb)中至少一个的至少一个组蛋白茎-环序列:式(Ib)(没有茎边界元件的茎-环序列):式(IIb)(有茎边界元件的茎-环序列):其中:N、C、G、T和U是如上文所定义的。特别优选的组蛋白茎-环序列是根据SEQIDNO.7的核酸序列。组蛋白茎-环核苷酸序列(SEQIDNO.7)CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA更优选的茎-环序列是根据SEQIDNO.8的核酸序列的对应RNA序列。组蛋白茎-环RNA序列(SEQIDNO.8)CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA在优选的实施方案中,包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA还包含poly(A)序列。Poly(A)序列的长度可以变化。例如,poly(A)序列可以具有约20个腺嘌呤核苷酸至最多约300个腺嘌呤核苷酸的长度,优选约40至约200个腺嘌呤核苷酸,更优选约50至约100个腺嘌呤核苷酸,例如约60、70、80、90或100个腺嘌呤核苷酸。最优选地,至少一种RNA包含约60至约70个核苷酸的poly(A)序列,最优选64个腺嘌呤核苷酸。优选地,至少一种RNA中的poly(A)序列通过体外转录来自DNA模板。或者,也可以通过常规化学合成方法在体外获得poly(A)序列,而不必从DNA祖细胞转录。或者,至少一种RNA任选地包含在本文中定义为信号的多腺苷酸化信号,其通过特异性蛋白质因子(例如切割和多腺苷酸化特异性因子(CPSF)、切割刺激因子(CstF)、切割因子I和切割因子II(CFI和CFII)、poly(A)聚合酶(PAP))将多腺苷酸化转达到(经转录的)mRNA。在本文中,共有多腺苷酸化信号优选包含NN(U/T)ANA共有序列。在特别优选的方面,多腺苷酸化信号包含以下序列中的一个:AA(U/T)AAA或A(U/T)(U/T)AAA(其中尿苷通常存在于RNA中,胸苷通常存在于DNA中)。另外或作为上文所描述的poly(A)序列的替代方案,至少一种RNA还可以包含poly(C)序列,优选在RNA编码区的3′区。Poly(C)序列通常是多个胞苷核苷酸的延伸,通常约10个至约200个胞苷核苷酸,优选约10个至约100个胞苷核苷酸,更优选约10个至约70个胞苷核苷酸,或甚至更优选约20个至约50个或甚至约20个至约30个胞苷核苷酸。Poly(C)序列可以优选地位于核酸包含的编码区的3′。在本发明的优选实施方案中,至少一种RNA包含poly(A)序列和poly(C)序列,其中poly(C)序列位于poly(A)序列的3′。在特别优选的实施方案中,本发明方法的步骤a)中提供的液体中包含的至少一种RNA包含:来自5′-TOP-UTR的核酸序列、GC优化的编码序列、来自白蛋白基因的3′-UTR的核酸序列、poly(A)-序列、poly(C)-序列、和组蛋白茎环,优选以5′至3′的顺序。在本发明方法的步骤a)中提供的液体可以包含本文所描述的游离形式的至少一种RNA(“裸RNA”)或与其他化合物如转染剂或复合剂的复合物形式的至少一种RNA。例如,至少一种RNA可以以与阳离子或聚阳离子载体或化合物的复合物的形式存在于本发明方法的步骤a)中提供的液体中,阳离子或聚阳离子载体或化合物可以用作转染剂或复合剂。在优选的实施方案中,本发明方法的步骤a)中所提供的液体包含游离形式的至少一种RNA以及与阳离子或聚阳离子载体或化合物的复合物形式的至少一种RNA两者。这种至少一种RNA与阳离子或聚阳离子载体或化合物的复合物可以作为纳米颗粒存在于本发明方法的步骤a)中提供的液体中。与聚阳离子或阳离子化合物的RNA复合物的制备是本领域已知的,并且优选地如EP1083232、WO2009/030481、WO2010/037539、WO2011/026641、WO2012/013326或WO2012/113513中所描述的进行,其全部内容通过引用并入本文。在本文中,在步骤a)中提供的液体中包含的至少一种RNA优选地由选自聚合物或复合剂的化合物复合,聚合物或复合剂通常包括但不限于适于制备药物组合物的任何聚合物,例如小沟/大沟黏合剂、核酸结合蛋白、脂质体复合物(lipoplex)、纳米复合物、非阳离子或非聚阳离子化合物例如PLGA、聚乙酸酯、聚丙烯酸酯、PVA、葡聚糖、羟甲基纤维素、淀粉、MMP、PVP、肝素、果胶、透明质酸及其衍生物、或阳离子或聚阳离子化合物,特别是阳离子或聚阳离子聚合物或阳离子或聚阳离子脂质,优选阳离子或聚阳离子聚合物。在本发明的情况下,这种阳离子或聚阳离子化合物通常选自适合用于于复合并由此稳定本文所定义的RNA的任何阳离子或聚阳离子化合物,例如通过将至少一种RNA与阳离子或聚阳离子化合物缔合。在本文中特别优选的复合剂是阳离子化合物或聚阳离子化合物,其包括鱼精蛋白、核仁蛋白(nucleoline)、精胺或亚精胺、或其他阳离子肽或蛋白质,例如聚-L-赖氨酸(PLL)、聚精氨酸、如上定义的寡精氨酸,例如Arg7、Arg8、Arg9、Arg7、H3R9、R9H3、H3R9H3、YSSR9SSY、(RKH)4、Y(RKH)2R等、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP),其包括HIV结合肽、HIV-1Tat(HIV)、Tat衍生肽、Penetratin、VP22衍生肽或类似肽、HSVVP22(单纯性疱疹)、MAP、KALA或蛋白转导域(PTD)、PpT620、富含脯氨酸的肽、富含精氨酸的肽、富含赖氨酸的肽、MPG肽、Pep-1、L-寡聚体、降钙素肽、触角足衍生肽(特别衍生自果蝇触角足)、pAntp、pIsl、FGF、乳铁蛋白、Transportan、Buforin-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT衍生肽、SAP或组蛋白。在特别优选的实施方式中,步骤a)提供的液体包含鱼精蛋白,其中至少一种RNA优选通过鱼精蛋白复合。在优选的实施方案中,在本发明方法的步骤a)中提供的液体还包含至少一种阳离子或聚阳离子化合物,优选阳离子或聚阳离子肽或蛋白质,其优选如本文所定义的。在特别优选的实施方案中,在步骤a)中提供的液体包含至少一种RNA和至少一种阳离子或聚阳离子化合物,其优选如本文所定义的,其中至少一种RNA和至少一种阳离子或聚阳离子化合物存在于复合物中。在本发明方法的步骤a)中提供的液体优选地包含在溶液中和/或与至少一种RNA一起的复合物中的阳离子或聚阳离子化合物。更优选地,在步骤a)中提供的液体包含阳离子或聚阳离子化合物,优选鱼精蛋白,且至少一种RNA的重量比(RNA:鱼精蛋白,重量/重量)为1∶10至10∶1,更优选为5∶1至1∶1,甚至更优选为3∶1至1∶1。最优选地,组合物中至少一种RNA与阳离子或聚阳离子化合物优选鱼精蛋白的重量比为2∶1(重量/重量)。此外,这种阳离子或聚阳离子化合物或载体可以是阳离子或聚阳离子肽或蛋白质,其优选包含包含至少一个-SH部分或经另外修饰以包含至少一个-SH部分。优选地,阳离子或聚阳离子载体选自具有以下总式(III)的阳离子肽:{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x};式(III)其中l+m+n+o+x=3至100,l、m、n或o彼此独立地是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、81至90和91至100的任意数,条件是Arg(精氨酸)、Lys(赖氨酸)、His(组氨酸)和Orn(鸟氨酸)的总含量代表寡肽的所有氨基酸的至少10%;Xaa是选自天然(=天然存在)或非天然氨基酸的除了Arg、Lys、His或Orn以外的任何氨基酸;x是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、81至90的任何数,条件是Xaa的总含量不超过寡肽的所有氨基酸的90%。氨基酸Arg、Lys、His、Orn和Xaa中的任一个可以位于该肽的任意位置。在本文中,7至30个氨基酸的阳离子肽或蛋白质是特别优选的。此外,当阳离子或聚阳离子肽或蛋白质如以上所显示的式{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}(式(III))所定义,且其包含至少一个-SH部分或另外被修饰以包含至少一个-SH部分时,该阳离子或聚阳离子肽或蛋白质可以选自子式(IIIa)而不限于此:{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa’)x(Cys)y}子式(IIIa)其中(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;x是本文所定义的,Xaa’是选自天然(=天然存在)或非天然氨基酸除了Arg、Lys、His、Orn或Cys以外的任何氨基酸,y是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80和81至90的任意数,条件是Arg(精氨酸)、Lys(赖氨酸)、His(组氨酸)和Orn(鸟氨酸)的总含量代表寡肽的所有氨基酸的至少10%。此外,阳离子或聚阳离子肽可以选自子式(IIIb):Cys1{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}Cys2子式(IIIb)其中经验式{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}(式(III))是如本文所定义的,且形成氨基酸序列的核,其中Cys1和Cys2是邻近(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x或位于(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x末端的半胱氨酸。可以用作转染剂或复合剂的更优选的阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖,例如壳聚糖、聚凝胶、阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)、阳离子脂质例如DOTMA:[1-(2,3-二油氧基)丙基)]-N,N,N-三甲基氯化铵、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE:二油烯基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS:二-十八基氨基甘氨酰精胺(Dioctadecylamidoglicylspermin)、DIMRI:二肉豆蔻酰-氧丙基二甲基羟乙基溴化铵、DOTAP:二油酰基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷、DC-6-14:O,O-双十四酰基-N-(α-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物、CLIP1:外消旋-[(2,3-双十八基氧基丙基)(2-羟乙基)]-二甲基氯化铵、CLIP6:外消旋-[2(2,3-双十六基氧基丙基-氧基甲氧基)乙基]三甲基铵、CLIP9:外消旋-[2(2,3-双十六基氧基丙基-氧基琥珀酰基氧基)乙基]-三甲基铵,阳离子脂质体(oligofectamine),或阳离子或聚阳离子聚合物、例如经修饰的聚氨基酸、例如β-氨基酸-聚合物或反向聚酰胺等,经修饰的聚乙烯、例如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶溴化物))等,经修饰的丙烯酸酯、例如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基丙烯酸甲酯))等,经修饰的氨基胺、例如pAMAM(聚(氨基胺))等,经修饰的聚β氨基酯(PBAE)、例如二胺末端修饰的1,4丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物等,树枝状聚合物、例如聚丙胺树枝状聚合物或基于pAMAM的树枝状聚合物等,聚亚胺、例如PEI:聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯亚胺)等、聚烯丙胺,基于糖骨架的聚合物、例如基于环糊精的聚合物、基于葡聚糖的聚合物、壳聚糖等,基于甲硅烷骨架的聚合物、例如PMOXA-PDMS共聚物等,由一个或更多个阳离子嵌段(例如选自上文所提及的阳离子聚合物)的组合组成的嵌段聚合物和由一个或更多个亲水或疏水嵌段(例如聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物等。在本文中,特别优选的是本发明方法的步骤a)中提供的液体中包含的至少一种RNA至少部分地与阳离子或聚阳离子化合物、优选阳离子蛋白或肽复合。部分地意味着只有至少一种RNA分子的一部分与阳离子或聚阳离子化合物复合,并且至少一种RNA分子的其余部分是非复合形式(“游离”)。优选地,复合的RNA和游离RNA的比例选自约5∶1(重量/重量)至约1∶10(重量/重量)、更优选约4∶1(重量/重量)至约1∶8(重量/重量)、更优选约3∶1(重量/重量)至约1∶5(重量/重量)或1∶3(重量/重量),最优选的复合的RNA分子和游离RNA分子的比例选自约1∶1(重量/重量)的比例。在本发明的情况下,在本发明方法的步骤a)中提供的液体因此可以包含游离形式的至少一种RNA或与阳离子或聚阳离子化合物复合的至少一种RNA。在优选的实施方案中,液体包含复合物,其中该复合物包含由阳离子或聚阳离子化合物复合的至少一种RNA或由其组成,其中该复合物优选作为本文所定义的纳米颗粒存在。如本文所使用的,术语“纳米颗粒”通常指至少一种RNA分子与本文所定义的复合剂的复合物,复合剂优选与阳离子或聚阳离子化合物。在优选的实施方案中,在步骤a)中提供的液体包含纳米颗粒形式的至少一种RNA,其包含由阳离子或聚阳离子化合物复合的至少一种RNA或由其组成,其中纳米颗粒的尺寸、优选平均尺寸优选为50nm至500nm、更优选50nm至少200nm。在特别优选的实施方案中,包含复合的RNA或由其组成的纳米颗粒的(平均)尺寸为50nm至180nm,优选50nm至150nm。在优选的实施方案中,在本发明方法的步骤a)中提供的液体包含合适的溶剂。优选地,该液体包含能够溶解至少一种RNA和其他组分如本文所定义的冻干保护剂或阳离子或聚阳离子化合物的溶剂。更优选地,溶剂是挥发性的,沸点优选低于150℃。此外,溶剂优选是无毒的。优选地,溶剂是水溶液。在有机溶剂的情况下,溶剂优选与水混溶。在优选的实施方案中,液体包括含有水溶液的溶剂或水,优选不含热原的水或注射用水(WFI)。在本文中,术语“注射用水”(WFI)是由标准USP23定义的术语。USP23专论指出,“注射用水(WFI)”是通过蒸馏或反渗透纯化的水。“WFI通常通过蒸馏或2步反渗透来生产。WFI通常每毫升不含有超过0.25个USP内毒素单位(EU)。内毒素是一类热原,其是革兰氏阴性细菌(水中最常见的细菌类型)的细胞壁组分,优选在10cfu/100ml的作用极限。微生物质量可以通过在30至35摄氏度的培育温度下对100ml样品进行膜过滤和平板计数琼脂48小时来测试。WFI的化学纯度要求通常与PW(纯净水)相同。在本发明方法的步骤a)中提供的液体可以包含缓冲剂,优选地选自本文所定义的缓冲剂,例如包含2-羟基丙酸的缓冲剂,优选地包含至少一种其光学异构体L-(+)-乳酸、(S)-乳酸、D-(-)-乳酸或(R)-乳酸,更优选其生物活性光学异构体L-(+)-乳酸或其盐或阴离子,优选选自乳酸钠、乳酸钾、或Al3+-乳酸盐、NH4+-乳酸盐、Fe-乳酸盐、Li-乳酸盐、Mg-乳酸盐、Ca-乳酸盐、Mn-乳酸盐或Ag-乳酸盐,或选自林格氏乳酸盐(RiLa)、乳酸化林格氏溶液(主要含乳酸钠,在英国也称为“哈特曼溶液”)、乙酸化林格氏溶液、或含原乳酸盐的溶液(例如用于注射目的)、或含乳酸盐的水的缓冲剂。本文所定义的缓冲剂还可以是含甘露糖的缓冲剂,等渗缓冲剂或溶液、优选选自等渗盐水、含乳酸盐或含原乳酸盐的等渗溶液,选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)、TRIS缓冲盐水(TBS)、汉克平衡盐溶液(HBSS),厄尔平衡盐溶液(EBSS)、标准柠檬酸盐水(SSC)、HEPES缓冲盐水(HBS)、格雷平衡盐溶液(GBSS)、或生理盐水(NaCl)、加入葡萄糖或右旋糖的低渗(盐水)溶液、或本文所定义的溶液等的等渗缓冲剂或溶液。这些等渗缓冲剂或溶液优选地如本文所定义地制备,或根据本领域众所周知的用于这些特定等渗缓冲剂或溶液的方法制备。在本文中,缓冲剂可以包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中,更优选地含水(等渗溶液或水)缓冲剂,其含有钠盐,优选至少50mM的钠盐、钙盐,优选至少0.01mM的钙盐、任选地钾盐,优选至少3mM的钾盐。根据优选的实施方案,钠盐、钙盐和任选地钾盐可以以其卤化物形式出现,例如氯化物、碘化物或溴化物,以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等形式出现。钠盐的实例包括但不限于例如NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4,任选的钾盐的实例包含例如KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4,钙盐的实例包括例如CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。通常,盐在这种缓冲剂中以至少50mM氯化钠(NaCl)、至少3mM氯化钾(KCl)和至少0.01mM氯化钙(CaCl2)的浓度存在。此外,前述阳离子的有机阴离子可以包含在缓冲剂中。根据更优选的实施方案,缓冲剂可以包含选自氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)和任选地氯化钾(KCl)的盐,其中可以存在除氯化物以外的其他阴离子。在本文中CaCl2还可以被其他盐例如KCl替代。在优选的实施方案中,在本发明方法的步骤a)中提供的液体不包含脂质化合物。根据本发明,在方法的步骤a)中提供的液体还包含至少一种冻干保护剂。如本文所使用的,术语“冻干保护剂”通常指部分或完全替代分子周围的水合作用范围并从而防止催化和/或水解过程的辅料。在优选的实施方案中,在步骤a)中提供的液体包含至少一种冻干保护剂,其中该冻干保护剂选自(游离)碳水化合物。这类(游离)碳水化合物可以包括但不限于适合制备药物组合物的任何(游离)碳水化合物,优选但不限于(游离)单糖,例如(游离)葡萄糖、(游离)果糖、(游离)半乳糖、(游离)山梨糖、(游离)甘露糖(“游离”优选指未结合或非结合的,例如甘露糖不与至少一种RNA共价键合,或换句话说,甘露糖优选相对于至少一种RNA是非结合的)等及其混合物;二糖,例如乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等及其混合物;多糖,例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、糊精、纤维素、淀粉等及其混合物;糖醇,例如甘油、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等及其混合物。优选地包含在步骤a)中提供的液体中的糖的实例包括乳糖、甘露糖、甘露糖醇、蔗糖或海藻糖。通常,在本文中优选的糖具有高的水替换活性和高的玻璃化转变温度。此外,适合用在步骤a)中提供的液体中的糖优选为亲水的但不是吸湿的。此外,糖优选具有低的结晶倾向,例如海藻糖。在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的冻干保护剂优选选自甘露醇、蔗糖、葡萄糖、甘露糖和海藻糖。在步骤a)中提供的液体中的冻干保护剂特别优选是海藻糖。此外,可以使用下文所定义的其他组分中的任一种作为冻干保护剂。特别地可以使用醇作为冻干保护剂,例如PEG、甘露醇、山梨醇、环糊精、DMSO、氨基酸和蛋白质如脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、白蛋白和明胶。另外,下文所定义的金属离子、表面活性剂和盐可以用作冻干保护剂。此外,聚合物特别是聚乙烯吡咯烷酮可以用作冷冻保护剂。在步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA与冻干保护剂、优选碳水化合物、更优选糖、甚至更优选海藻糖在所述液体中的重量比优选为约1∶2000至约1∶10、更优选约1∶1000至约1∶100。最优选地,在步骤a)中提供的液体中的至少一种RNA与冻干保护剂、优选碳水化合物、更优选糖、甚至更优选海藻糖在所述液体中的重量比为约1∶250至约1∶10,更优选约1∶100至约1∶10,最优选为约1∶100至约1∶50。在优选的实施方案中,在本发明方法的步骤a)中提供的液体包含至少0.01%(重量/重量)、优选至少0.1%(重量/重量)、至少0.5%(重量/重量)、至少1%(重量/重量)、至少2.5%(重量/重量)、至少5%(重量/重量)、至少10%(重量/重量)或至少15%(重量/重量)的冻干保护剂,其中冻干保护剂优选为碳水化合物组分,更优选糖,甚至更优选海藻糖。进一步优选地,在本发明方法的步骤a)中提供的液体包含浓度为0.1至40%(重量/重量),更优选浓度为1至20%(重量/重量),更优选为5至20%(重量/重量),甚至更优选为2.5至10%(重量/重量),最优选浓度为5%(重量/重量)的冻干保护剂,优选碳水化合物,更优选糖,甚至更优选海藻糖的。在一个实施方案中,在本发明方法的步骤a)中提供的液体包含浓度为至少0.01g/l、优选至少0.1g/l、至少0.2g/l、至少0.3g/l、至少0.4g/l、至少0.5g/l、至少0.6g/l、至少0.7g/l、至少0.8g/l、至少0.9g/l、至少1g/l、至少2g/l、至少3g/l、至少4g/l或至少5g/l的至少一种RNA。进一步优选地,液体中至少一种RNA的浓度为0.01g/l至50g/l、更优选为0.1g/l至10g/l、甚至更优选为0.2g/l至5g/l、最优选为0.5g/l和1g/l(例如0.8g/l)。在本发明方法的步骤a)中提供的液体还可以包含与至少一种RNA相容的任何类型的合适组分。如本文所用的,术语“组分”优选包含任何添加剂或辅料,优选药学上可接受的辅料,优选不引起或增强至少一种RNA降解的辅料。这种组分还可以处于任何状态,例如液体、凝胶状、固体或半固体。组分优选地选自冷冻保护剂、填充剂、防腐剂、抗氧化剂、抗微生物剂、着色剂、载体、填料、成膜剂、再分散剂和崩解剂。此外,在步骤a)中提供的液体还可以包含辅料,例如消泡剂、表面活性剂、黏度增强剂、力控制剂等。优选地,在步骤a)中提供的液体包含选自冷冻保护剂或填充剂的至少一种组分。在本文中,冷冻保护剂被理解为能够影响冷冻材料的结构和/或混合物的共晶温度的辅料。填充剂(例如填料)是与至少一种RNA相容的任何辅料,其包含在步骤a)中提供的液体中。如本文所使用的,填充剂可以用于增加所得组合物的体积和/或质量。此外,填充剂还可以保护至少一种RNA免于降解。对于其他组分,在本发明方法的步骤a)中提供的液体还可以含有选自例如蛋白质、氨基酸、醇、甘露醇、金属或金属离子、表面活性剂、聚合物或复合剂、缓冲剂等或其组合的至少一种组分。在本发明的情况下,一种优选的组分可以选自氨基酸组。该组可以包括但不限于任何天然存在的氨基酸,包括丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、吡咯赖氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、硒代半胱氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸,更优选甘氨酸、精氨酸和丙氨酸。选自氨基酸组的冷冻保护剂和/或冻干保护剂还可以包含上文所定义的天然存在的氨基酸的任何修饰。此外,在本发明的情况下,其他组分可以选自醇组。该组可以包括但不限于适用于制备药物组合物的任何醇,优选但不限于甘露醇、聚乙二醇、聚丙二醇、山梨醇等在本发明的情况下,其他合适的组分还可以选自蛋白质组。该组可以包括但不限于以下蛋白质,例如白蛋白、胶质、治疗活性蛋白、抗体、抗原或本文所定义的任意其他蛋白质。可以包含在本发明方法的步骤a)中提供的液体中的优选组分可以选自金属或金属离子,通常包括但不限于选自以下的金属或金属离子或盐:碱金属,其包括元素周期表第1族的成员:锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)、铯(Cs)和钫(Fr)及其(一价)金属碱金属离子和盐;优选锂(Li)、钠(Na)、钾(K)及其(一价)金属碱金属离子和盐;碱土金属,包括周期表第2族成员:铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)和镭(Ra)及其(二价)碱土金属离子和盐;优选镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)及其(二价)碱土金属离子和盐;过渡金属,其包括周期表第3至13族的成员及其金属离子和盐。过渡金属通常包括40种化学元素21至30、39至48、71至80和103至112。名称过渡源自其在元素周期表中的位置。在它们出现的四个周期中的每一个中,这些元素表示电子向原子的d原子轨道的连续增加。以这种方式,过渡金属代表第2副族元素与第12(或13)副族元素之间的过渡。在本发明的情况下的过渡金属特别包括周期表第3副族的成员:包括钪(Sc)、钇(Y)和镥(Lu),元素周期表第4副族的成员:包括钛(Ti)、锆(Zr)和铪(Hf),元素周期表第5副族的成员:其包括钒(V)、铌(Nb)和钽(Ta),元素周期表第6副族的成员:其包括铬(Cr)、钼(Mo)和钨(W),元素周期表第7副族的成员:其包括锰(Mn)、锝(Tc)和铼(Re),元素周期表第8副族的成员:其包括铁(Fe)、钌(Ru)和锇(Os),元素周期表第9副族的成员:其包括钴(Co)、铑(Rh)和铱(Ir),元素周期表第10副族的成员:其包括镍(Ni)、钯(Pd)和铂(Pt),元素周期表第11副族的成员:其包括铜(Cu)、银(Ag)和金(Au),元素周期表第12副族的成员:其包括锌(Zn)、镉(Cd)和汞(Hg);优选元素周期表第1至12副族中任一个的第4周期的成员:其包括钪(Sc)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)和锌(Zn)及其金属离子和盐;土金属或硼族成员,其包括元素周期表第3族的成员:其包括硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)和铊(Tl)及其金属离子和盐;优选硼(B)和铝(Al)及其金属离子和盐;准金属或半金属:包括硼(B)、硅(Si)、锗(Ge)、砷(As)、锑(Sb)、碲(Te)和钋(Po)及其半金属离子和盐;优选硼(B)和硅(Si)及其半金属离子和盐;在本发明的情况下,其他组分可以选自表面活性剂组,其包括但不限于任何表面活性剂,优选任何药学上可接受的表面活性剂,其优选适用于喷雾干燥或喷雾冷冻干燥。更优选地,表面活性剂选自Tween如Tween80(0.2%)、Pluronics如PluronicL121(1.25%)、TritonX、SDS、PEG、LTAB、皂苷、胆酸盐等,但不限于此。作为另一种组分,在本发明方法的步骤a)中提供的液体还可以含有一种或更多种相容的固体或液体填料或稀释剂或包封化合物,其优选适用施用于待治疗的患者。本文所使用的术语“相容的”指这些成分能够以不发生相互作用的方式与根据本发明所定义的至少一种RNA(游离或与以与阳离子或聚阳离子化合物的复合物形式)混合,该相互作用在通常使用条件下会显著降低至少一种RNA的完整性或生物学活性。当然,药学上可接受的载体、填料和稀释剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性,以使其适合施用于待治疗的人。可以用作药学上可接受的载体、填料或其组分的化合物的一些实例是糖,例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,例如玉米淀粉或马铃薯淀粉;纤维素及其衍生物,例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、纤维素乙酸酯;粉状黄蓍胶;麦芽;明胶;动物油脂;固体助流剂,例如硬脂酸、硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和来自可可属的油;多元醇,例如聚丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇;海藻酸。此外,在本发明方法的步骤a)中提供的液体可以任选地含有其他辅料或试剂,例如稳定剂,例如EDTA、Tween、苯甲酸衍生物或核糖核酸酶抑制剂。优选地,液体还可包含与至少一种RNA相容的任何类型的组分或添加剂。这种辅料优选选自防腐剂、抗氧化剂、抗微生物剂、着色剂、载体、填料、成膜剂、再分散剂和崩解剂。此外,液体还可以包含以下组分或添加剂,优选非常少量的以下组分或添加剂,例如消泡剂、表面活性剂、黏度增强剂、力控制剂等。在本发明方法的步骤a)中提供的液体优选是液体或半液体组合物,其包含本文所定义的至少一种RNA和本文所定义的至少一种冻干保护剂。至少一种RNA和至少一种冻干保护剂优选溶解在步骤a)中提供的液体中。在优选的实施方案中,液体是至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的水溶液,其优选包含本文所定义的溶剂。本文所使用的液体还可以是黏稠溶液、乳液、分散液、混悬液、凝胶等。在步骤a)中提供的液体,优选含有至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的溶液,可以通过在合适溶剂的存在下混合至少一种RNA和至少一种冻干保护剂来制备,合适溶剂优选如本文所定义的。例如,液体可以通过将至少一种冻干保护剂、优选碳水化合物、更优选糖、最优选海藻糖添加到包含本文所定义的至少一种RNA的液体中来制备,或通过将本文所定义的至少一种RNA添加到包含至少一种冻干保护剂、优选碳水化合物、更优选糖、最优选海藻糖的液体中来制备。其中,重量比和/或浓度优选如上文所描述的。如上文所定义的这种用于冻干的溶液任选地补充以其他组分,其优选地如上文所定义的。在优选的实施方案中,步骤a)包括提供包含至少一种RNA的液体和包含至少一种冻干保护剂的液体,将其混合以提供包含至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的液体。根据本发明方法的步骤b),将步骤a)中提供的液体引入冷冻干燥器的冷冻干燥室中。在本发明的情况下,术语“冷冻干燥器”通常指能够冻干液体或半液体制剂的设备。优选地,可以用关于表征冻干过程的参数来控制本文所使用的冷冻干燥器,例如包含待冻干液体的冷冻干燥室中的温度和压力。这种设备是本领域已知的并且易于获得的。特别优选的是,加热速率和/或冷却速率以及压力可以调节。该调节优选以半自动或自动的方式进行,例如通过在开始冷冻干燥过程之前对设备进行编程,以使设备执行所需的冻干过程,例如通过在预定温度和压力下进行某些预定步骤(例如冷冻、干燥),优选地从一个这样的步骤过渡到另一步骤。还优选的是,冷冻干燥器包括冷冻干燥室,其中优选地可以控制气氛,即通过用特定气体例如氮气充满该室(例如,通过特定的气体入口和气体出口)。这种设备是本领域已知的并且容易获得的。市售设备的实例包括例如冷冻干燥器Alpha2-4(MartinChristGefriertrocknungsanlagen,Osterrode,德国)、Lyoflex04(BOCEdwards)或Epsilon2-12D(MartinChristGefriertrocknungsanlagen,Osterrode,德国)。在优选的实施方案中,将步骤a)中提供的液体引入冷冻干燥器的干燥室中,其中将液体置于合适的容器中,例如小瓶、管或杯中,其被引入到干燥室中。用于冻干的合适容器是本领域已知的并且是可商购的。根据冻干组合物的液体量和设想的应用,选择适当的容器。在优选的实施方案中,将液体引入到干燥室的玻璃小瓶中,更优选无菌玻璃小瓶。在优选的实施方案中,步骤a)中提供的液体置于1至100R的玻璃小瓶中,优选于1至50R的玻璃小瓶中,更优选于2至20R的玻璃小瓶中,例如于2R或20R的玻璃小瓶中(例如来自Ompi的EZ-Fill玻璃小瓶、来自Schott的玻璃小瓶,特别是Schott来自Gerresheimer的玻璃小瓶、特别是小瓶,来自Aluglas的玻璃小瓶或来自SGDPharma的玻璃小瓶)。更优选地,本文所使用的容器可以具有可以部分封闭的盖子(例如,为了气体能够进入或离开小瓶)或完全封闭的盖子(例如在冻干过程结束时)。在优选的实施方案中,将包含步骤a)中提供的液体的容器引入到具有部分封闭的盖子的室中,其中在冷冻干燥过程期间盖子保持部分封闭,其中在冻干过程的终点,优选在步骤g)中平衡干燥室之前,优选盖子被自动地封闭。在优选的实施方案中,将步骤a)中提供的液体提供于容器中,优选小瓶,其中,在将液体引入到冷冻干燥室之前,用橡胶塞优选地将容器部分封闭,优选用冷冻干燥橡胶塞部分封闭,更优选用冷冻干燥涂覆的橡胶塞,最优选涂覆氟或特氟龙层的冷冻干燥橡胶塞,例如涂覆氟的冷冻干燥橡胶塞(例如,由WestPharmaor生产的橡胶塞或来自DaikyoSeikoLtd.的橡胶塞)。根据优选的实施方案,将在步骤a)中提供的液体在该方法的步骤b)中引入到冷冻干燥室中,其中步骤b)包括在室温下,优选15℃至25℃的温度下,更优选18℃至23℃的温度下,最优选在20℃至22℃(例如20℃)的温度下,将液体引入到冷冻干燥室中。在优选的实施方案中,在步骤a)中提供的液体的温度和/或冷冻干燥室的温度是如上文步骤b)中所定义的。步骤b)优选包括将液体引入到其中压力约等于根据标准大气(Atm)的压力的冷冻干燥室中。更优选地,本发明方法的步骤b)中的干燥室中的压力为约1013.25毫巴。本发明的方法还包括将液体冷却至冻结温度的步骤(步骤c)和在冻结温度下冻结液体以获得冻结液体的步骤(步骤d),其中以限定冷却速率进行冷却。在优选的实施方案中,冻结温度是预先确定的温度。关于冻干产品的品质,重要的是选择用于冷冻的合适的冻结温度。特别地,包含至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的冻结液体必须保持低于冻结液体的塌陷温度(Tc)。在塌陷温度以下,给定制剂保持其固体(冷冻)状态。然而,在塌陷温度,冷冻制剂通常失去其结构,导致制剂塌陷和/或熔融。优选地,塌陷温度是组合物的熔融温度。塌陷温度对于给定组合物是特定的,并且通常由经验确定。用于确定物质塌陷温度的方法是本领域已知的,并且包括例如通过使用冷冻干燥显微镜、差示热分析仪(例如差示扫描量热法)或电阻分析仪(介电电阻分析)。给定组合物的塌陷温度通常随着组合物中存在的水的量减少而增加。冻结温度优选地通过选择低于给定组合物的塌陷温度的温度来预先确定。根据优选的实施方案,本发明方法中的冻结温度分别低于步骤a)中提供的液体的塌陷温度或步骤d)中获得的冻结液体的塌陷温度。在其他优选的实施方案中,冻结温度分别等于或低于步骤a)中提供的液体的玻璃化转变温度(Tg′)或步骤d)中获得的冻结液体的玻璃化转变温度(Tg′)。如果将冷冻无定形组合物加热直到其特定的玻璃化转变温度,组合物的结构从脆性变为柔性,而不完全熔融。玻璃化转变温度通常略低于给定组合物的塌陷温度或熔融温度。如本文所使用的,术语“玻璃化转变温度”还与液体组合物固化成无定形冷冻组合物的温度有关。与上述塌陷温度类似地,玻璃化转变温度对于给定物质或组合物也是特定的,并随其含水量而变化。玻璃化转变温度通常由经验确定。用于确定物质或组合物的玻璃化转变温度的方法是本领域已知的,并且包括例如通过使用冷冻干燥显微镜、差示热分析仪(例如差示扫描量热法)或电阻抗分析仪(介电电阻分析)。冻结温度优选通过选择等于或低于给定组合物的玻璃化转变温度的温度来预先确定。本文中关于本发明方法所定义的温度通常指冷冻干燥室中的各个温度。根据设备的类型,冷冻干燥室中的温度可以通过不同的方式确定。冷冻干燥室中的温度优选分别通过确定搁架温度、步骤a)中提供的液体或步骤d)中得到的液体的温度或其一部分温度来确定。如本文所使用的,术语“搁架温度”通常涉及通过至少一个探针测量的温度,探针优选地位于搁架的表面上。在本发明方法的情况下,“搁架”通常被理解为冷冻干燥室中的任何结构,其适合于支撑待冻干并且被提供于例如放置在这种结构上的一个或更多个容器中的液体。优选地,待冻干的液体或含有这种液体的容器与搁架物理接触。搁架温度优选通过至少一个探针测量,该探头优选地位于搁架的表面上,或者其被集成到搁架中。由此确定的搁架温度优选地反映了待冻干的液体的温度。除了搁架温度,或作为替代方案,步骤a)中提供的液体、步骤d)中获得的冻结液体、或其部分的温度通过探针测量,该探针位于液体或冻结液体中。合适的探针类型的实例包括例如PT100铂电阻温度计、PT1000铂电阻温度计、Cu-CuNi热电偶、NiCr-NiAl热电偶、NiCr-CuNi热电偶和NiCr-Ni热电偶。优选地,在步骤a)中提供的液体的温度和在步骤d)中获得的冻结液体或其部分的温度相当于各自的搁架温度。因此,在步骤a)中提供的液体和在步骤d)中获得的冻结液体或其部分的温度等于各自的搁架温度,或者相当于各自的搁架温度,因为液体在搁架之后以较短延迟达到搁架温度,反之亦然。根据加热系统,特别是加热元件在冷冻干燥室中的位置,液体或搁架可以先加热或先冷却。优选地,这种延迟很小(例如1至30秒)使得其相对于本发明方法中的温度调节的实际考虑可以忽略不计。在优选的实施方案中,通过使用搁架温度作为参数来控制冻干。例如,冻干过程通常通过使用本文所定义的温度作为搁架温度来程序控制。任选地,除了搁架温度,可以直接测量在步骤a)中提供的液体和/或在步骤d)中获得的冻结液体或其一部分的实际温度,例如在确立生产过程中。在本发明的优选实施方案中,冻结温度分别等于在步骤a)中提供的液体或在步骤d)中获得的冻结液体的玻璃化转变温度(Tg′),或低于该温度至少0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃。在特别优选的实施方式中,冻结温度分别低于步骤a)中提供的液体或步骤d)中获得的冻结液体的玻璃化转变温度(Tg′)0.5℃至25℃,优选为1℃至20℃,更优选为5℃至15℃。在优选的实施方案中,在本发明方法的步骤a)中提供的液体或在步骤d)中获得的冻结液体的玻璃化转变温度为-15℃至-50℃,优选-25℃至-40℃,更优选-28℃至-37℃,最优选-30℃至-35℃。优选地,在本发明方法的步骤c)和d)中的冻结温度低于-30℃,更优选低于-35℃,最优选低于-38℃。更优选地,在本发明方法的步骤c)和d)中的冻结温度为-55℃至-30℃,优选-50℃至-35℃,更优选-45℃至-35℃,最优选-42℃至-38℃。在特别优选的实施方案中,冻结温度为约-40℃。根据优选的实施方案,本发明方法的步骤c)包括将步骤a)中提供的液体冷却至冻结温度,其中冷却速率以限定的冷却速率进行。优选地,步骤c)中的冷却速率小于2℃/分钟,更优选小于1.5℃/分钟,甚至更优选小于1℃/分钟,最优选小于0.5℃/分钟。或者,步骤c)中的冷却速率可以为0.1℃/分钟至2℃/分钟,优选0.5℃/分钟至1.5℃/分钟。在特别优选的实施方案中,在步骤c)中使用约0.5℃/分钟的冷却速率。冷却速率优选地在步骤c)期间是恒定的。在本发明方法的具体实施方案中,将冻结温度保持至少1小时,更优选至少2小时,最优选至少3小时。本发明的方法还包括步骤e),其包括将冷冻干燥室中的压力降低到低于大气压的压力。优选地,将冷冻干燥室中的压力在步骤a)中提供的液体冻结之后降低到低于大气压的压力。在优选的实施方案中,在干燥步骤开始之前或干燥步骤开始时,将冷冻干燥室中的压力降低至低于大气压的压力。最优选地,在温度升高前降低压力。根据优选的实施方案,步骤e)包括将冷冻干燥室中的压力降低至约0.001毫巴至约0.3毫巴的压力。在本发明的情况下,冷冻干燥室中的压力由任何合适的方法确定。不同类型的压力计是本领域已知的。优选地,使用直接(非气体依赖性)压力/真空电容压力计、Pirani压力计或MKS压力计,例如本发明的方法还包括步骤f),其包括干燥步骤d)中获得的冻结液体,以获得包含至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的冻干组合物。根据一个实施方案,步骤f)包括加热在步骤d)中获得的冻结液体至干燥温度。干燥温度通常是搁架温度,其提供足够的能量来补偿由于升华(升华能)而从冻结液体环境中去除的能量。在初级干燥期间,升华前沿从冻结液体的顶部向下移动或从周围向中心移动,且组合物的干燥部分的厚度增加。干燥部分通常干扰从环境向待干燥的冻结液体的热传递。随着组合物的干燥部分的厚度增加,热传递下降,必须增加搁架温度以确保提供足够的能量来补偿升华能。如果施加到冻结液体的能量的量大于被升华补偿的能量的量,冻结液体的温度升高。如果冻结液体的温度升至高于其玻璃化转变温度或其塌陷温度,冻结液体开始解冻,从而失去其结构。因此,在冻结液体升华期间干燥温度优选保持在塌陷温度以下,更优选低于玻璃化转变温度。干燥温度优选为预定的温度。更优选地,干燥温度是向冻结液体提供至少被升华补偿的能量的量的温度,优选搁架温度,其中干燥温度优选低于将冻结液体加热至各自的玻璃化转变温度或各自的塌陷温度所需要的最低温度。根据优选的实施方案,干燥温度足够高以向冻结液体提供通过升华补偿的能量的量。在优选的实施方案中,干燥温度是由经验确定的,优选地如本文关于塌陷温度或玻璃化转变温度所描述的。在其他优选的实施方案中,可以通过本领域已知的方法计算升华能来确定干燥温度(参见例如Pikal,M.J.:Freeze-DryingofProteins:Process,Formulation,andStability,in:FormulationandDeliveryofProteinsandPeptides,J.L.Cleland,由R.Langer编辑,ACSSymposiumSeries567,1994,第120-133页)。干燥温度优选低于步骤d)中获得的冻结液体的塌陷温度。更优选地,步骤f)中的干燥温度低于步骤d)中所获得的冻结液体的玻璃化转变温度。在具体的实施方案中,干燥温度为-40℃至40℃,优选为-30℃至30℃,更优选为-25℃至25℃。从冻结温度至最终干燥温度的整体加热速率优选为0.1℃/小时至20℃/小时,更优选为2℃/小时至15℃/小时,最优选为优选5℃/小时至15℃/小时。认为步骤f)中的加热速率对冻干组合物的品质有影响。特别地,认为通过选择适当的加热速率可以以积极的方式影响至少一种RNA的完整性和/或生物活性。根据优选的实施方案,因此,本发明方法的步骤f)中的加热速率优选为0.1℃/小时至20℃/小时,更优选为2℃至15℃/小时,还更优选为3℃/小时至12℃/小时,甚至更优选为4℃/小时至11℃/小时,最优选为约5℃/小时至约10℃/小时或5℃/小时至10℃/小时。或者,步骤f)中的加热速率为30℃/小时或更低、20℃/小时或更低、15℃/小时或更低、12℃/小时或更低、11℃/小时或更低、或10℃/小时或更低。在优选的实施方式中,上文所定义的加热速率为在本发明方法的步骤f)中使用的整体加热速率,更优选地是从冻结温度到最终干燥温度的整体加热速率。在优选的实施方案中,步骤f)包括至少两个干燥步骤。优选地,本发明方法的步骤f)包括两个干燥步骤,初级干燥步骤f1)和次级干燥步骤f2)。在初级干燥步骤f1)中,至少一种RNA和任选地其他组分周围的游离水即未结合水通常从溶液逸出。其后,在次级干燥步骤f2)中通过增加热能可以除去在分子基础上与至少一种RNA结合的水。在这两种情况下,至少一种RNA周围的水合球失去。优选地,初级干燥步骤f1)包括将冻结液体加热到初级干燥温度,其优选低于次级干燥温度,在次级干燥步骤f2)中将冻结液体加热至次级干燥温度。更优选地,初级干燥步骤f1)中的压力(“初级干燥压力”)高于次级干燥步骤f2)中的压力(“次级干燥压力”)。根据另一个实施方案,步骤e)包括将冷冻干燥室中的压力降低至初级干燥压力,这在从冻结温度加热到初级干燥温度之前或同时施加,并且在初级干燥步骤f1)期间保持;随后,将冷冻干燥室中的压力降低到次级干燥压力,其在从初级干燥温度加热到次级干燥温度之前或同时施加,并且在次级干燥步骤f2)期间保持。初级干燥步骤f1)可以在常压下进行,例如在约980至约1045毫巴(mbar),例如约1013毫巴,也可以通过将压力降低到初级干燥压力来进行。优选地,初级干燥压力为几毫巴,例如约0.001毫巴(1微巴)至约0.3毫巴(300微巴),优选为约0.01毫巴(10微巴)至约0.2毫巴(200微巴),甚至更优选约0.05毫巴(50微巴)至约1.5毫巴(150微巴),例如约0.1毫巴(100微巴)。在该初级干燥步骤中,通常通过应用部分真空来控制压力。真空能够加速升华,使其在周全的干燥过程中是有用的。此外,冷凝器室和/或冷凝板可以用于提供(a)使水蒸气在其上再凝固的表面。冷凝器温度可以为<-70℃、<-60℃、<-50℃。特别优选<-50℃。或者,不降低压力,而可以向样品供应热量使水能够升华。可以使用升华分子的升华潜热来计算所需的热量。在该初始干燥阶段,材料中约95%(重量/重量)的水升华。该阶段可以缓慢进行,以避免施加过多的热和待冻干的核酸结构的可能改变或破坏。在优选的实施方案中,初级干燥步骤包括将温度调节至初级干燥温度,其优选为约-40℃至约+20℃,例如约-30℃至约+20℃、约-20℃至约+20℃、约-10℃至约+10℃、约-40℃至约+10℃、约-30℃至约+10℃、约-20℃至约+10℃、约-20℃至约+/-0℃或约-20℃至约-10℃。-10℃的初级干燥温度是特别优选的。作为其他替代方案,初级干燥步骤f1)在上文所定义的初级干燥温度和初级干燥压力下进行。优选地,以限定的加热速率将温度从冻结温度升高至初级干燥温度。更优选地,在初级干燥的第一步骤中(f1a)),温度优选地以0.1℃/小时至10℃/小时、更优选1℃/小时至10℃/小时、或2℃/小时至8℃/小时、最优选4℃/小时至6℃/小时(例如5℃/小时)的加热速率从冻结温度升高至初级干燥温度。在初级干燥的第二步骤中(f1b)),应用初级干燥温度至少5小时,更优选至少7小时,最优选至少10小时(例如11小时)。由于通常在上述初级干燥步骤f1)中除去冰(冷冻的水分子),第二干燥步骤f2)通常旨在除去与RNA结构(序列)结合的未冻结的水分子。在该次级干燥步骤f2)中,通常将温度升高到高于初级干燥步骤的温度,甚至可以高于0℃,以破坏在水分子和冻结材料之间形成的任何物理化学相互作用。或者或此外,可以在这个阶段降低压力以促进解吸。在优选的实施方案中,次级干燥步骤f2)包括将温度调节至次级干燥温度和/或将压力调节至次级干燥压力。在具体的实施方案中,次级干燥温度等于初级干燥温度和/或次级干燥压力等于初级干燥压力。更优选地,次级干燥温度为约+10℃至约+40℃,优选为约+10℃至约+30℃,更优选为约+15℃至约+25℃,例如约20℃。优选地将压力调整到次级干燥压力。所述次级干燥压力优选为几毫巴,例如如上述初级干燥压力,或更优选地为约0.001毫巴(1微巴)至约0.1毫巴(100微巴),优选为约0.01毫巴(10微巴)至约0.1毫巴(100微巴),甚至更优选为约0.02毫巴(20微巴)至约0.08毫巴(80微巴),例如约0.045毫巴(45微巴)。根据优选的实施方案,在次级干燥的第一步骤(f2a))中,将压力从初级干燥压力调节至次级干燥压力,优选通过降低上述压力而不增加温度。在次级干燥的第二步骤中(f2b)),优选将温度升高至次级干燥温度,其优选如上文所描述的。在具体的实施方案中,以限定的加热速率将温度从初级干燥温度调节至次级干燥温度。在一个实施方案中,优选地,在次级干燥的第二步骤(f2b)中以0.1℃/小时至20℃/小时,更优选为5℃/小时至15℃/小时,最优选为8℃/小时至12℃/小时(例如10℃/小时)提高温度。在次级干燥的第三步骤中(f2c),将次级干燥温度保持至少3小时,更优选至少5小时,最优选至少7小时。在完成本发明方法的步骤f)之后,通常获得包含至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的冻干组合物。在步骤f)之后,优选在本发明方法的步骤g)之前,任选地用惰性气体充满冷冻干燥室。优选地,惰性气体选自氮、二氧化碳、氦、氖、氩、氙和氪。冷冻干燥室优选地以优选本文所定义的惰性气体在标准大气压(Atm)(1013.25毫巴)至100毫巴,优选标准大气压(Atm)(1013.25毫巴)至400毫巴,更优选900毫巴至700毫巴的压力下充满。最优选地,冷冻干燥室以800毫巴的压力充满惰性气体。在优选的实施方案中,在打开冷冻干燥室之前将包含根据本发明方法获得的冻干组合物的容器封闭。为此目的,优选已将至少一种RNA和至少一种冻干保护剂在可以封闭的合适容器中冻干。封闭和/或密封包含冻干组合物的容器的任选步骤可以独立于冷冻干燥室是否充满本文所描述的惰性气体之前而进行。根据一个替代方案,在冷冻干燥室平衡至大气压之前,将包含根据本发明方法获得的冻干组合物的容器封闭。优选地,将含有冻干组合物的容器自动封闭,例如通过将部分封闭的盖子如橡胶塞完全封闭。更优选地,优选在冷冻干燥室平衡至大气压之前和/或在冷冻干燥室打开之前,将含有冻干组合物的容器密封地封闭。或者,将含有根据本发明方法获得的冻干组合物的容器封闭,优选自动地封闭,并另外密封,例如通过将压在盖子上(例如橡胶塞)和容器开口的边缘上(例如小瓶的颈部)的覆盖物(例如铝盖)卷边。本发明的方法还包括步骤g),其包括将冷冻干燥室中的压力平衡至大气压(优选地约1013毫巴),并从冷冻干燥室中除去冻干的RNA。优选地,步骤g)还包括调节冷冻干燥室中的温度至环境温度,例如室温。作为如本文所述的冻干方法的产物,优选在进行步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)之后,优选获得包含至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的冻干组合物。在另一方面,由此本发明还涉及包含至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的冻干组合物,其可以通过本发明的方法获得。通过本发明方法获得的冻干组合物还可以包含其他组分或组分的组合,其优选如本文相关的本发明方法所描述的。优选地,包含至少一种RNA和至少一种冻干保护剂的冻干组合物的特征在于玻璃化转变温度(Tg),其优选等于或高于60℃,更优选等于或高于70℃,最优选等于或高于80℃。根据优选的实施方案,冻干组合物的玻璃化转变温度为50℃至200℃,优选为60℃至120℃,更优选为70℃至100℃,最优选为约78℃至约88℃。在优选的实施方案中,通过本发明方法获得的冻干组合物的特征在于残余水分含量,其优选为约0.1%(重量/重量)至约10%(重量/重量),更优选为约1%(重量/重量)至约8%(重量/重量),甚至更优选为约2%(重量/重量)至约5%(重量/重量),最优选为约3%(重量/重量)至4%,例如3%(重量/重量)±2%(重量/重量),或3%(重量/重量)±1%(重量/重量)。还优选地,通过本发明方法获得的冻干组合物的残余水含量等于或小于10%(重量/重量),更优选等于或小于7%(重量/重量),甚至更优选等于或小于5%(重量/重量),最优选等于或小于4%(重量/重量)。如本文所使用的,术语“残余水分含量”(或“残余水分”)通常指存在于冻干组合物中溶剂的总量。使用本领域已知的任何合适方法测定冻干组合物中残余溶剂的所述总量。例如,用于确定残余水分含量的方法包括卡尔费休滴定技术(Karl-Fischer-titrimetrictechnique)或热重分析(TGA)方法。在优选的实施方案中,冻干组合物中包含的残余溶剂是水或基本上是水溶液,且残余水分含量由卡尔费休滴定法测定。不受任何理论约束,通过本发明方法获得的冻干组合物的低的残余水分含量被预期为有助于其优异的储存稳定性。通过本发明方法获得的冻干组合物特别地适合作为RNA的储存稳定形式。发明人出人意料地发现,冻干组合物中至少一种RNA的储存稳定性是优异的,RNA分子在延长的储存期后仍保持功能性。RNA的储存稳定性通常通过确定给定储存期后的相对(结构)完整性和生物活性来确定,其例如通过体外表达研究的时间过程来确定。相对完整性优选确定为相对于RNA总量(即全长RNA和降解RNA片段(其在凝胶电泳中显示为斑点))的全长RNA(即非降解RNA)的百分比,例如使用来自BioRad的QuantityOne软件,优选地在减除LOD(3×背景噪声)后。通过本发明方法获得的冻干组合物能够在-80℃至60℃的温度下相比在WFI或其他可注射溶液中的相应RNA具有显著更长的储存。特别地,通过本发明方法获得的冻干组合物可以在室温下储存,这简化了运输和储存。优选地,在有或没有保护气体下储存冻干组合物。在一个实施方案中,单剂量的冻干组合物被包装和密封。或者,多剂量可以包装在一个包装单元中。优选地,使用包装在小瓶、注射器、泡罩或胶囊中的单剂量以防止交叉污染。优选地,在室温下保存优选至少一周、更优选至少一个月、甚至更优选至少6个月、最优选至少一年之后,通过本发明方法获得的冻干组合物中的至少一种RNA的相对完整性为至少70%、更优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。还优选地,在室温下储存之后的冻干组合物的至少一种RNA的生物学活性,优选如上文关于至少一种RNA的相对完整性所定义的,其优选至少为新鲜制备的RNA的生物学活性的70%、更优选至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。优选地,例如在转染到哺乳动物细胞系中或到对象之后,通过分别分析由重构RNA和新鲜制备RNA表达的蛋白质的量来确定生物活性。或者,可以通过测量对象中(适应性或先天性)免疫应答的诱导来确定生物活性。在另一方面,本发明涉及用于冻干RNA的冻干保护剂的用途,其中该用途包括对RNA和冻干保护剂的受控冷却和/或受控加热。特别地,本发明提供了冻干保护剂用于冻干RNA的用途,其中该用途包括冷冻干燥过程,其中,该冻干过程包括受控冷却,优选如本文所定义的,更优选如本文关于本发明冻干RNA方法所定义的的温度和/或冷却速率所定义的,和/或其中冷冻干燥过程包括受控加热,优选如本文所定义的,更优选由本文关于本发明冻干RNA方法所定义的的温度和/或加热速率所定义的。在优选的实施方案中,本发明提供了碳水化合物、更优选糖、甚至更优选海藻糖用于在受控冷冻和/或受控加热条件下冻干RNA的用途,受控冷冻和/或受控加热条件优选如本文所定义的。在特别优选的实施方案中,本发明提供了用于冻干RNA的冻干保护剂的用途,其中所述用途包括本文所描述的、关于本发明冻干RNA方法的特征的任何一个或特征的任何组合。在另一方面,本发明还提供了本发明方法在制备药物或疫苗中的用途。根据本发明的另一方面,提供了药物组合物,其包含通过本发明冻干RNA的方法获得的冻干组合物或由其组成。在优选的实施方案中,本发明的药物组合物包含至少一种另外的药学上可接受的成分,例如药学上可接受的载体和/或载剂。本发明的药物组合物可以任选地补充上文中有关本发明冻干RNA的方法的步骤a)中提供的液体的所定义的其他组分。本发明的药物组合物可以是通过本发明方法作为整体制备的。作为第一成分,本发明的药物组合物包含本文所定义的至少一种RNA。特别地,本发明药物组合物的第一成分是通过本发明用于冻干RNA的方法而获得的冻干组合物。优选地,本文所定义的至少一种RNA代表药物组合物的药物活性成分。作为第二成分,本发明的药物组合物可以包含其他类化合物,其可以在此情况下加入到本发明的药物组合物中,其他类化合物可以选自至少一种药物活性成分。在此情况下的药物活性成分是针对特定的医学适应症具有治疗作用的化合物,特定的医学适应症优选癌症疾病、自身免疫性疾病、过敏症、感染性疾病或本文所定义的其他疾病。这些化合物不暗示任何限制地包括,优选以下化合物,其包括但不限于:肽或蛋白质(例如本文所定义的)、核酸分子(治疗活性)、低分子量有机或无机化合物(分子量小于5000、优选小于1000)、糖、抗原或抗体(如本文所定义的)、现有技术已知的治疗剂、抗原性细胞、抗原性细胞碎片、细胞片段;经修饰、减毒或灭活(例如化学地或通过辐射)的病原体(病毒、细菌等)等。此外,本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体和/或载剂。在本发明的情况下,药学上可接受的载体通常包括本发明药物组合物的液体或非液体基。假如本发明的药物组合物是以液体形式提供,载体通常是无热原的水;等渗盐水或缓冲(水)溶液,例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。特别地,为了注射本发明的药物组合物,可以使用水或优选缓冲剂,更优选含水缓冲剂,其含有钠盐,优选至少50mM的钠盐、钙盐,优选至少0.01mM的钙盐,任选地钾盐,优选至少3mM的钾盐。根据优选的方面,钠盐、钙盐、任选地钾盐可以以其卤化物的形式存在,例如氯化物、碘化物或溴化物,以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等的形式存在。钠盐的实例包括但不限于例如NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4,任选的钾盐的实例包括例如KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4,钙盐的实例包括例如CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。此外,上述阳离子的有机阴离子可以包含在缓冲剂中。根据更优选的方面,适用于如上所述的注射目的的缓冲剂可以含有选自氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)和任选的氯化钾(KCl)的盐,其中除了氯化物还可以存在其他阴离子。CaCl2还可以被其他盐如KCl替代。通常,注射缓冲剂中的盐以至少50mM氯化钠(NaCl)、至少3mM氯化钾(KCl)和至少0.01mM氯化钙(CaCl2)的浓度存在。参考特定的参考培养基,注射缓冲剂可以是高渗、等渗或低渗的,即缓冲剂可以具有相对于特定参考培养基更高、相同或更低的盐含量,其中优选可以使用前述盐的这种浓度,其不导致由于渗透或其他浓度影响导致的细胞破坏。参考介质是例如在“体内”方法出现的液体,例如血液、淋巴、胞质液体或其他体液,或例如可以在“体外”方法中用作参考介质的液体,例如常见的缓冲剂或液体。这些常见的缓冲剂或液体是本领域技术人员已知的,并且可以为如上文所定义的。然而,也可以使用一种或更多种相容的固体或液体填料或稀释剂或包封化合物用于本发明的药物组合物,其适用于施用于待治疗的患者。本文所使用的术语“相容的”指本发明药物组合物的这些成分能够与通过本发明的用于冻干RNA的方法获得的冻干组合物以不发生相互作用的这种方式混合,该相互作用将在通常使用条件下显著降低本发明药物组合物的药物有效性。当然,药学上可接受的载体、填料和稀释剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性,以使其适合于向待治疗的人施用。可以用作药学上可接受的载体、填料或其组分的化合物的一些实例是糖,例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,例如玉米淀粉或马铃薯淀粉;纤维素及其衍生物,例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、纤维素乙酯;粉状黄蓍胶;麦芽;明胶;动物油脂;固体助流剂,例如硬脂酸、硬脂酸镁、硫酸钙;植物油,例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和来自可可属的油;多元醇,例如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;海藻酸。本发明的药物组合物可以经口服、肠胃外、通过吸入、外用、直肠、鼻腔、口腔、阴道或经由植入型药盒来施用。本文所使用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、透皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内和舌下注射或输注技术。优选地,本发明的药物组合物可以通过肠胃外注射,更优选通过皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、透皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内和舌下注射或通过输注技术。本发明药物组合物的无菌可注射形式可以是水混悬液或油混悬液。这些混悬液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和混悬剂配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液,例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受载剂和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外,无菌、不挥发性油通常用作溶剂或混悬介质。为此,可以使用任何温和的不挥发性油,包括合成的单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物,如天然药学上可接受的油如橄榄油或蓖麻油,特别是其聚氧乙烯化形式,在制备注射剂上是有用的。这些油溶液或混悬液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂,例如羧甲基纤维素或类似的分散剂,其通常用于制备药学上可接受的剂型,包括乳剂和混悬剂。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型的其他通常使用的表面活性剂,例如Tween、Span和其他乳化剂或生物利用度增强剂也可以用于制备本发明的药物组合物的目的。上文所定义的本发明的药物组合物也可以以任何口服可接受的剂型口服施用,包括但不限于胶囊、片剂、水混悬剂或溶液。在口服使用的片剂的情况下,通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也加入润滑剂如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服施用,有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要水混悬剂用于口服使用时,活性成分即通过本发明用于冻干RNA的方法获得的冻干组合物与乳化剂和混悬剂组合。如果需要,还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。本发明的药物组合物也可以局部施用,特别是当治疗目标包括通过局部应用容易接近的区域或器官时,例如包括皮肤或任何其他可触及的上皮组织的疾病。对于这些区域或器官中的每一个,容易制备适合的局部制剂。对于局部应用,本发明的药物组合物可以配制成合适的软膏,其含有混悬或溶解在一种或更多种载体中的上文所定义的组分。用于局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者,本发明的药物组合物可以配制在合适的洗剂或霜剂中。在本发明的情况下,合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。本发明的药物组合物通常包含如上所定义的本发明药物组合物的“安全有效量”组分,特别是包含在通过本发明用于冻干RNA的方法获得的冻干组合物中的至少一种RNA的“安全有效量”。如本文所使用的,“安全有效量”指足以显著诱导本文所定义的疾病或病症的正修饰的至少一种RNA的量。然而,同时,“安全有效量”足够小以避免严重副作用,也就是说允许优势和风险之间的合理关系。这些界限的确定通常在合理医学判断范围内。本发明药物组合物的组分特别是至少一种RNA的“安全有效量”,在陪同医师的知识和经验内,还将随待治疗的具体病症而变化,还随着待治疗患者的年龄和身体状况、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄速率、合并用药、所使用的特定(冻干)核酸(序列)的活性、病情的严重程度、治疗的持续时间、伴随治疗的性质、所使用的特定药学上可接受的载体的性质和类似因素而变化。本发明的药物组合物可以用于人也用作兽医用途,优选用于人医学目的,作为一般的药物组合物或作为疫苗。根据具体方面,通过本发明用于冻干RNA的方法获得的冻干组合物或本发明的药物组合物作为疫苗提供。本发明的这种疫苗通常类似于本发明的药物组合物而组成,即其含有通过如上定义的用于冻干RNA的本发明方法获得的冻干组合物和任选的药学上可接受的载体和/或载剂。其他组分可以如上所定义的用于本发明的药物组合物。本发明的疫苗优选支持待治疗的患者的免疫系统的至少先天性免疫应答。此外,本发明的疫苗还可以引发适应性免疫应答,优选地,如果本发明疫苗的至少一种RNA编码引起适应性免疫应答的抗原(或抗体),或者抗原被添加到可以有效地诱导适应性免疫应答的本发明的疫苗。本发明的疫苗还可以包含如上定义的用于本发明的药物组合物的药学上可接受的载体、佐剂和/或载剂。在本发明疫苗的具体情况下,药学上可接受的载体的选择原则上通过施用本发明的疫苗的方式确定。本发明的疫苗可以例如全身或局部施用。本发明疫苗的优选施用途径通常与本文关于本发明的药物组合物所描述的途径相同。全身施用的途径通常包括例如经皮、口服、肠胃外途径,其包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、皮内和腹膜内注射和/或鼻内/肺内施用途径。局部施用途径通常包括例如外部施用途径,还有皮内、经皮、皮下或肌内注射或病灶内、颅内、肺内、心内和舌下注射。更优选地,本文中的疫苗可以通过皮内、皮下或肌内途径施用。因此,本发明的疫苗优选配制成液体(或有时为固体,例如气雾剂)形式。可以通过动物模型的常规实验来确定待施用的本发明疫苗的合适量。这些模型包括但不限于兔、羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物模型。用于注射的优选单位剂量形式包括无菌水溶液、生理盐水或其混合物。这些溶液的pH应该调节至约7.4。适用于注射的载体包括水凝胶、用于控释或缓释的装置、聚乳酸和胶原基质。用于外部应用的合适的药学上可接受的载体包括适用于洗剂、霜剂、凝胶等的那些。如果本发明的疫苗是口服施用的,则片剂、胶囊剂等是优选的单位剂量形式。用于制备可以用于口服施用的单位剂量形式的药学上可接受的载体在现有技术中是众所周知的。其选择将取决于对于本发明的目的不重要的次要考虑因素,例如味道、成本和储存性,并且本领域技术人员可以毫无困难地做出选择。可以包括在本发明疫苗中的其他添加剂是乳化剂,例如湿润剂,例如月桂基硫酸钠;着色剂;增味剂;药用载体;成片剂;稳定剂;抗氧化剂;防腐剂。根据具体的实施方案,本发明的疫苗可以包含佐剂。在本文中,佐剂可以理解为适合于引发或增加先天性免疫系统的免疫应答,即非特异性免疫应答的任何化合物。在其他术语中,当施用时,本发明的疫苗优选地引起由于任选地包含在其中的佐剂的先天性免疫应答。优选地,这种佐剂可以选自本领域技术人员已知的佐剂,并适用于该情况,即支持在哺乳动物中诱导先天性免疫应答。在本文中,佐剂优选地选自已知是免疫刺激性的化合物,这是由于其与人Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的结合亲和力(作为配体),或由于其与小鼠Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的结合亲和力(作为配体)。根据另一方面,本发明还提供了试剂盒,特别是套装试剂盒。这种套装试剂盒可以含有例如如上文所定义的通过本发明方法能获得的冻干组合物、本发明的药物组合物或本发明的疫苗,优选分到试剂盒的不同部分中。举例来说,本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以制成套装试剂盒,例如通过将本文所描述的(全部或至少一些组分的)本发明的药物组合物、或本发明的疫苗、或作为干燥制剂即没有任何液体组分的冻干组合物本身引入本发明的试剂盒的一个或更多个部分(由此至少包含至少一种RNA),并且在试剂盒的至少一个另外的单独部分中,包含如本文描述的本发明方法的步骤a)中提供的液体、本发明的药物组合物或本发明的疫苗所述的溶液和/或缓冲剂,或本文所述的用于冻干、转染和/或注射的任何其他溶剂和/或缓冲剂。或者,本发明的药物组合物或本发明的疫苗可以制备为套装试剂盒,例如通过在试剂盒的一个或更多个部分仅包含通过本文所述的本发明方法获得的冻干组合物,并且在试剂盒的至少一个另外的单独部分中,包含如本文用于本发明方法的步骤a)中提供的液体、用于本发明的药物组合物、或本发明的疫苗的所述的溶液和/或缓冲剂,或本文所述用于冻干、转染和/或注射的任何其他溶剂和/或缓冲剂。试剂盒的其他成分可以包括如上所定义的组分,例如(溶液包含)蛋白质、氨基酸、醇、碳水化合物、金属或金属离子、表面活性剂、聚合物或复合剂和/或缓冲剂,优选如上所述的全部,但不限于此。这些其他成分可以包含在试剂盒(或套装试剂盒)的不同部分。如上所述的试剂盒或套装试剂盒可以任选地含有关于本发明组合物的施用和剂量的信息的技术说明书。这种试剂盒,优选的套装试剂盒可以应用于例如任何上述应用或用途。本发明还提供通过本发明方法获得的冻干组合物、本发明的药物组合物、本发明的疫苗或本发明的试剂盒或套装试剂盒的几种应用和用途。根据一个方面,本发明涉及通过本发明方法获得的冻干组合物用于制备预防、治疗和/或改善疾病或疾病的药剂的用途,优选本文所定义的疾病或疾病。在优选的实施方案中,药剂是疫苗。根据另一个方面,本发明涉及如本文所定义的通过本发明方法获得的冻干组合物、本发明的药物组合物、本发明的疫苗或本发明的试剂盒或套装试剂盒在治疗或预防疾病中的用途,优选地本文所定义的疾病。特别地,本发明涉及通过本发明方法获得的冻干组合物作为药剂的第一医疗用途。药剂可以是药物组合物的形式、作为药物组合物特定形式的疫苗、或试剂盒或套装试剂盒的形式。因此,本发明提供了通过本发明的方法获得的冻干组合物、本发明的药物组合物、本发明的疫苗或本发明的试剂盒或套装试剂盒在治疗或预防病症或疾病的用途。在本发明的情况下的药物组合物通常包含通过本发明方法获得的冻干组合物,任选的其他成分、优选如上文所定义的,以及任选的药学上可接受的载体和/或载剂、优选如上文所定义的,或由其组成。根据另一方面,本发明涉及通过本发明方法获得的冻干组合物、药物组合物、作为药物组合物特定形式的疫苗、或本发明的试剂盒或套装试剂盒的第二医疗用途。本发明提供通过本发明用于冻干RNA的方法获得的冻干组合物、本发明的药物组合物、本发明的疫苗或本发明试剂盒或套装试剂盒在治疗本文所定义的疾病中的用途,优选用于预防、治疗和/或改善本文所定义的各种疾病,优选地选自赘生物(例如癌症或肿瘤疾病),感染性疾病和寄生虫病优选病毒、细菌或原生动物感染性疾病,自身免疫性疾病,过敏症或过敏性疾病,单基因疾病即(遗传性)疾病或一般遗传疾病,有基因遗传背景并通常由单一基因缺陷引起且根据孟德尔定律遗传的疾病,染色体异常,心血管疾病,血液和血液形成器官的疾病,内分泌、营养和代谢疾病,精神和行为障碍,神经系统疾病,眼睛和附器疾病,耳朵和乳突疾病,循环系统疾病,呼吸系统疾病,消化系统疾病,皮肤和皮下组织疾病,肌骨骼系统和结缔组织疾病,以及泌尿生殖系统疾病。根据另一方面,本发明涉及治疗或预防病症或疾病的方法,其中所述方法包括向需要其的对象施用药学上有效量的、优选如本文所定义的通过本发明方法能获得的冻干组合物、本发明的药物组合物或本发明的疫苗。优选地,所述方法用于治疗或预防选自以下的疾病:赘生物(例如癌症或肿瘤疾病),感染性和寄生虫病优选病毒、细菌或原生动物感染性疾病,自身免疫性疾病,过敏症或过敏性疾病,单基因疾病(即(遗传性)疾病)或一般遗传疾病,具有基因遗传背景并通常由单一基因缺陷引起且根据孟德尔定律遗传的疾病,染色体异常,心血管疾病,血液和血液形成器官疾病,内分泌、营养和代谢疾病,精神和行为障碍,神经系统疾病,眼睛和附器疾病,耳朵和乳突疾病,循环系统疾病,呼吸系统疾病,消化系统疾病,皮肤和皮下组织疾病,肌骨骼系统和结缔组织疾病,以及泌尿生殖系统疾病,或本文提到的任何其他疾病。本发明还能够治疗未被遗传的疾病,或者可以不归纳为上述类别的疾病。这种疾病可以包括例如需要特定蛋白质因子的患者的治疗,特定蛋白质因子例如如上文所述的特定治疗性的活性蛋白质。这可以包括例如透析患者,例如经历(常规)肾或肾脏透析并且会需要如上文所定义的特定治疗性的活性蛋白质例如红细胞生成素(EPO)等的患者。同样地,在本发明的情况下的疾病可以包括选自冠心病、动脉硬化、中风和高血压等的心血管疾病,但不限于此。最后,本发明情况下的疾病可以选自神经元疾病,其包括例如阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、肌张力障碍、癫痫、多发性硬化和帕金森病等。附图说明以下所示的附图仅仅是说明性的,并且将进一步描述本发明。这些附图不应被解释为将本发明限制于此。图1:SEQIDNO:1,其是对应于PpLuc(GC)-muag-A64-C30的mRNA序列。图2:SEQIDNO:2,其是对应于HA(GC)-muag-A64-C30-组蛋白茎-环的mRNA序列。图3:SEQIDNO:3,其是对应于HsFOLH1(GC)-muag-A64-C30-组蛋白茎-环的mRNA序列。图4:SEQIDNO:9,其是对应于RAV-G(GC)-muag-A64-C30-组蛋白茎-环的mRNA序列。图5:A.标准冻干循环的温度曲线和压力曲线。B.在标准条件下冻干的mRNA分别在25℃/60%相对湿度或在40℃/75%相对湿度下储存40周的相对完整性(实施例3)。图6:在受控冷冻条件下的冻干循环的优化(实施例4)A.在不同量的海藻糖的存在下,在受控冷冻条件下冻干的组合物的残余水分含量,其中在50℃(不控制相对湿度)下将冻干组合物储存3个月后测定残余水分含量。B.在不同量的海藻糖的存在下,在受控冷冻条件下冻干的mRNA的相对完整性,其中冻干样品在-50℃下储存了3个月(不控制相对湿度)。图7:在受控冷冻和受控干燥条件下的冻干循环的优化(实施例5)A.冻干循环的温度曲线和压力曲线。B.在受控冷冻和受控干燥条件下冻干的组合物的残余水分含量,其中在40℃/75%相对湿度下将冻干组合物储存24周后测定残余水分含量。C.在受控冷冻和受控干燥条件下冻干的mRNA的相对完整性,其中在40℃/75%相对湿度下将冻干样品储存24周。图8:在受控冷冻和受控干燥条件下的冻干循环的优化;冻干mRNA的生物活性(实施例6)A.将组合物在80℃、在+5℃、在+25℃/60%相对湿度、或在+40℃/75%相对湿度下储存后,在受控冷冻和受控干燥条件下冻干的组合物的残余水分含量,其中残余水分含量在储存1、2、3、6、9或12个月后测定。B.在受控冷冻和受控干燥条件下冻干的mRNA的相对完整性,其中冻干样品在-80℃、在5℃、在+25℃/60%相对湿度、或在+40℃/75%相对湿度下在储存1、2、3、6、9或12个月。C.在注射mRNA后测量HI滴度,该mRNA在受控冷冻和受控干燥条件下冻干,并在重构和注射前在-80℃或+25℃/60%相对湿度下储存6个月。D.在注射mRNA后测定病毒中和滴度,该mRNA在受控冷冻和受控干燥条件下冻干,并在重构和注射前在-80℃或+25℃/60%相对湿度下储存6个月。实施例以下所示的实施例仅是说明性的,并且将进一步描述本发明。这些实施例不应被解释为将本发明限制于此。实施例1:DNA和RNA构建体的制备构建用于体外转录的载体,其含有T7启动子,之后是GC富集的编码序列。构建载体(PpLuc(GC)-muag-A64-C30),其含有T7启动子,之后是编码荧光素酶报告基因的GC富集序列、来自白蛋白-3′-UTR(muag)的序列、64个腺苷(poly(A)序列)的延伸和30个胞嘧啶(poly(C)序列)的延伸。对应mRNA的序列如SEQIDNO:1所示。制备另一个载体(HA(GC)-muag-A64-C30-组蛋白茎-环),其含有T7启动子,之后是编码甲型流感病毒的血凝素(HA)蛋白的GC富集序列(A/Netherlands/602/09)、来自白蛋白3′-UTR(muag)的序列、64个腺苷(poly(A)序列)的延伸、30个胞嘧啶(poly(C)序列)的延伸和组蛋白茎-环。对应的mRNA的序列如SEQIDNO:2所示。构建其他载体(HsFOLH1(GC)-muag-A64-C30-组蛋白茎-环),其含有T7启动子,之后是编码来自智人的FOLH1蛋白的GC富集序列,来自白蛋白-3′-UTR(muag),64个腺苷(poly(A)序列)的延伸、30个胞嘧啶(poly(C)序列)的延伸和组蛋白茎-环。对应mRNA的序列如SEQIDNO:3所示。构建其他载体(RAV-G(GC)-muag-A64-C30-组蛋白茎-环),其含有T7启动子,之后是编码来自狂犬病病毒的RAV-G蛋白的GC富集序列、来自白蛋白3′-UTR(muag)的序列、64个腺苷(poly(A)序列)的延伸、30个胞嘧啶(poly(C)序列)的延伸和组蛋白茎-环。对应于Rav-GmRNA的序列的序列如SEQIDNO:9所示。将得到的载体线性化,之后通过T7RNA聚合酶体外转录。然后通过脱氧核糖核酸酶I消化将DNA模板降解。通过LiCl沉淀回收mRNA,并通过HPLC提取进一步清洁(CureVacGmbH,蒂宾根,德国)。实施例2:RNA的复合如实施例1所述,通过体外转录获得的mRNA与鱼精蛋白和海藻糖复合。将mRNA稀释(0.87g/L的mRNA终浓度),并制备鱼精蛋白/海藻糖混合物(0.43g/L鱼精蛋白;在注射用水中10.87%的海藻糖)。将两种溶液以2∶1(重量/重量)的mRNA:鱼精蛋白比例混合。之后用游离mRNA补充RNA/鱼精蛋白复合物的溶液,得到与0.2g/L鱼精蛋白、0.4g/L游离mRNA和5%海藻糖(重量/重量)复合的终浓度为0.4g/L的mRNA。或者,调整鱼精蛋白/海藻糖混合物中海藻糖的浓度,以获得2.5%或10%(重量/重量)的最终海藻糖浓度(在最终溶液中)。将这样配制的RNA用于冻干实验。实施例3:标准冻干过程根据实施例2配制的、编码根据SEQIDNO:1的荧光素酶的mRNA,其最终mRNA浓度为0.8g/l,最终海藻糖浓度为5%(重量/重量)。将75μl的等分试样分配到无菌2R玻璃小瓶(1型)中。将小瓶用冷冻干燥的橡胶塞半封闭。使用液氮冷冻小瓶并装载到冷冻干燥器Alpha2-4(MartinChristGefriertrocknungsanlagen)中并在以下条件下干燥。表1:通过在塞和小瓶的颈部压盖铝帽来密封小瓶。然后将样品储存在25℃/60%相对湿度(r.H.)下和40℃/75%相对湿度下,并在5、8、13、24和40周后分析(每次3个样品)的相对完整性。通过琼脂糖凝胶电泳测定冻干组合物中包含的mRNA的相对完整性。具体地,相对完整性通过分别在琼脂糖凝胶泳道中(即在给定的样品中)测量对应于全长mRNA和所有其他信号的信号强度,并计算全长mRNA的信号强度相对于在该泳道中所有其他信号的信号强度的比值来确定。结果表2+25℃/60%r.H.+40℃/75%r.H.储存时间(周)相对完整性(%)相对完整性(%)0757558471879521379402476140801在标准冻干条件下,干燥的mRNA/海藻糖制剂的储存导致在40℃/75%相对湿度下随时间的完整性降低(相对完整性<80%)(参见图5B),这表明组合物不是储存稳定的。实施例4:在受控冷冻条件下优化冻干循环根据实施例2配制编码A/Netherlands/602/09的血凝素(HA)的mRNA(SEQIDNO:2)和鱼精蛋白,以获得0.8g/l的最终mRNA浓度和分别为2.5%、5%和10%(重量/重量)的不同海藻糖浓度。通过DSC(差示扫描量热法)确定玻璃化转变温度Tg′,根据其Tg′将制剂分成两组。组I包含Tg′为-30℃至-32.5℃的制剂(即含有5%和10%海藻糖的mRNA制剂);组II包含Tg′为-32.5℃至-35℃的制剂(即含有2.5%海藻糖的mRNA制剂)。将500μl的每种制剂转移到无菌玻璃小瓶(1型)中。将小瓶用冷冻干燥的橡胶塞半封闭,并在15℃下装载到冷冻干燥器(Alpha2-4;ChristGefriertrocknungsanlagen)的搁架上。在受控条件下,以0.31℃/分钟的线性冷却速率进行达到-40℃的受控冷冻02:55小时。冻干循环表3:组I表4:组II由于冷冻干燥器的功能,仅可以控制约-40℃至0℃的搁架温度。可以达到较高的温度,但与恒定加热速率无关。因此,仅能够指定初级干燥的加热速率。在次级干燥(步骤9)之后,将冷冻干燥室充满氮气(步骤10),并通过降低上面的搁架手动封闭小瓶(步骤11)。最后将该室通风至大气压(atm,步骤12),并将小瓶从冷冻干燥器中取出。通过在塞和小瓶的颈部压盖铝帽来密封小瓶。通过卡尔费休滴定测定残余水分含量。之后,将样品储存在+50℃(不控制相对湿度)下,并在2周(仅相对完整性)、1、2和3个月后分析制剂的残余水含量和RNA的相对完整性(参见实施例3)。结果表5:所有样品都有<4%的残余水分含量。然而,较高浓度的冻干保护剂导致残余水分含量降低(见图6A)。所有样品在+50℃下储存3个月后显示完整性>80%(见图6B)。因此,在受控冷冻条件下冻干RNA会导致冻干的RNA产物的完整性随时间提高,以及优异的储存稳定性。实施例5:在受控冷冻和受控干燥条件下优化冻干循环分析了在受控的相对湿度条件(40℃/75%相对湿度)下储存后,冻干组合物的完整性,特别是包含在那些组合物中的mRNA的完整性。为此,在5%(重量/重量)海藻糖的存在下,根据实施例2配制编码HsFOHL1的mRNA(SEQIDNO:3)与鱼精蛋白,最终mRNA浓度为0.8g/l,并充入无菌玻璃小瓶(1型)中(每瓶600μl)。在20℃下,用冷冻干燥的橡胶塞半封闭小瓶,并装载到冷冻干燥器的搁架上。使用冷冻干燥器Epsilon2-12D(MartinChrist,Osterrode,德国)进行冻干。在冷冻干燥过程中,通过MKS电容压力表控制真空。该循环的过程参数详见下表。表6:通过卡尔费休滴定测定所得样品的残余水分含量。样品在40℃/75%相对湿度下储存,并在2、4、6、12和24周后分析。在该实验中,使用冻干mRNA(参见实施例3)的相对完整性作为冻干组合物在特定储存条件下即在40℃/75%相对湿度下的储存稳定性的量度。结果如果在+40℃/75%相对湿度下储存,冻干mRNA/海藻糖制剂的残余水分含量随时间增加,但仍然远低于2.5%(参见图7B)。然而,对于储存最长12周的样品,可以获得相对完整性高于80%的冻干RNA(参见图7C)。在储存24周后,RNA的相对完整性仍为79.1%。这些结果表明,分别与在非受控条件下冻干的RNA的相对完整性和其储存稳定性相比,在受控冷冻和受控干燥条件下的冻干带来了冻干的RNA产物的相对完整性增加,还带来了冻干RNA的储存稳定性改善(实施例3)。实施例6:在受控冷冻和受控干燥条件下优化冻干循环;冻干mRNA的生物活性在5%(重量/重量)的海藻糖的存在下,根据实施例2,配制质量比率为4∶1的编码A/Netherlands/602/09的血凝素(HA)的mRNA(SEQIDNO:2)与鱼精蛋白,最终mRNA浓度为0.8g/l。将制剂冷却至-80℃。在每个无菌2R玻璃(1型)小瓶中填充600μl制剂之前,将制剂在室温(20℃至25℃)下解冻。在20℃下将小瓶用冷冻干燥橡胶塞半封闭,并装载到冷冻干燥器的搁架上。在BOCEdwardsLyoflex04冷冻干燥器上进行冻干,冻干包括具有以下条件的冷冻干燥循环:表7:由Pirani压力计控制真空。在次级干燥(步骤9)之后,用氮气将冷冻干燥室充至0.8巴的压力(步骤10),并通过降低上方搁架自动封闭小瓶(步骤11)。最后将该室通风至大气压(步骤12),并从冷冻干燥器中取出小瓶。通过将铝盖压在橡胶塞和瓶的颈部上来密封小瓶。在测定每个样品的残余水分含量后,将样品分别储存在-80℃、+5℃、+25℃/60%相对湿度或+40℃/75%相对湿度下1、2、3、6、9和12个月。在该储存期后,对样品分析其残余水分含量和冻干mRNA的相对完整性。结果表8(r.M.:残余水分含量;r.I.:残余完整性)如果在+40℃/75%相对湿度下储存,则冻干mRNA/海藻糖制剂的残余水分含量随时间增加(参见图8A)。mRNA/海藻糖制剂6个月后残余水分增加超过4%,与冻干RNA的相对完整性降低至90%以下相关联(参见图8B)。然而,对于所有样品,即使在+40℃/75%相对湿度下储存超过12个月的样品中也获得了高于80%的冻干RNA的相对完整性。与非受控条件下的冻干(实施例3)相比,在受控冷冻和受控干燥条件下的冻干使得冻干RNA的稳定性改善。生物活性在-80℃和+25℃/60%相对湿度下将冻干样品储存6个月后测量mRNA的生物活性。为此,将冻干mRNA在保存期后重构并用于小鼠的疫苗接种。之后通过使用血凝素抑制试验和病毒中和试验来确定功能性抗体的存在。疫苗接种将冻干mRNA在林格氏-乳酸溶液中重构。如上文所描述的冻干并在+25℃或-80℃下储存,使用根据实施例2制备的、与鱼精蛋白复合的、编码A/Netherlands/602/09(SEQIDNO:2)的血凝素(HA)的80μg的mRNA,在初免/增强方案下,使雌性BALB/c小鼠免疫。最后的接种后34天采集血液,并通过血凝素抑制试验和病毒中和试验分析功能性抗体的存在。血凝抑制(HI)试验对于血凝抑制(HI)试验,将小鼠血清热灭活(56℃,30分钟),与高岭土一起温育并预吸附至鸡血红细胞(CRBC)(均是Dr.Merck&Kollegen,奥森豪森,德国)。对于HI试验,将50μl预处理血清的两倍稀释液各自用4HAU(HA的单位)的灭活A/California/07/2009病毒温育45分钟,并加入50μl的0.5%CRBC。抗血凝的血清最高稀释度被称为血清的HI滴度。病毒中和滴度通过热灭活(56℃,30分钟)在预处理的血清中确定病毒中和滴度。将连续稀释的血清与病毒的100×TCID50(组织培养50%感染剂量)温育2小时,之后转移到单层MDCK细胞中。3天后,通过使用灭活A/California/04/09病毒进行上清液的血凝试验来确定病毒存在或不存在。结果在-80℃和+25℃/60%相对湿度下储存制剂后,冻干mRNA的生物活性没有差异。可以得出结论,在较高温度下的储存不会影响通过优化冻干循环冻干的mRNA的生物活性(参见图8C)。实施例7:在受控冷冻和受控干燥条件下优化冻干循环;冻干mRNA的长期稳定性和安全性根据实施例2,在5%(重量/重量)海藻糖的存在下,以4∶1的质量比配制编码RAV-G(SEQIDNO:9)的mRNA与鱼精蛋白,最终mRNA浓度为0.8g/l。将制剂冷却至-80℃。在每个无菌2R玻璃(1型)小瓶填充600μl制剂之前,将制剂在室温(20℃至25℃)下解冻。在20℃下用冷冻干燥橡胶塞半封闭小瓶,并装载到冷冻干燥器的搁架上。在BOCEdwardsLyoflex04冷冻干燥器上进行冻干,该冻干包括冷冻干燥循环,其条件在表9中提供。表9:冻干mRNA的长期稳定性和安全性为了评估不同温度条件下冻干RAV-GmRNA的长期稳定性和安全性,分析了储存的RAV-GRNA的某些品质属性,包括外观、RNA完整性、RNA含量、pH值和渗透压。这些品质属性将在下文进一步详细讨论。外观:冻干饼的视觉外观是RNA稳定性的指示。RNA冻干物的颜色应该是白色到淡黄色以满足稳定性规范。RNA完整性:RNA随时间的降解导致RNA完整性的丧失。在通过RNA凝胶电泳在水中重构RNA后,分析RNA的完整性。根据本领域公知的方法进行RNA凝胶电泳。分析条带清晰度以确定RNA的完整性。此外,分析凝胶是否存在额外的不需要的条带或伪影。RNA含量:RNA含量随时间的增加是溶剂蒸发的指示。因此,分析储存的RNA冻干物的RNA含量。将干燥的RNA样品再混悬于10ml的WFI中。用光度法确定样品的RNA浓度。pH值:pH随时间的变化可以是产物组分的不希望的化学反应的指示。根据欧洲药典(PhEur)2.2.3,使用市售电压表进行pH值的电位测定。渗透压:渗透压随时间的变化可以是产物组分的不希望的化学反应的指示。根据欧洲药典(PhEur)2.2.35,使用市售渗透压计进行渗透压的测定。进行了一项稳定性研究,该研究分析了在5℃下的受控条件下的长期稳定性(最长36个月)(结果示于表10中)。此外,在较高温度(25℃)下进行了一项长达36个月的稳定性研究(见表11)。结果:表10:稳定性分析结果;最长36个月;5℃表11:稳定性分析结果;最长36个月;25℃结果表明,根据本发明的本发明冻干方法特别地适用于制备用于长期储存的稳定RNA冻干物。表10和表11中显示的结果表明,在实验期间(最多36个月)分析的所有质量属性符合稳定和安全的RNA药物的稳定性规范。值得注意的是,即使在较高的温度(25℃,参见表11)下也满足这些稳定性规范,这表明本发明的冻干方法特别适合于制备长期稳定和温度耐受性的RNA冻干物。...
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