本发明涉及用于开发工程化非同种异体反应性t细胞进行免疫治疗的方法，且更具体地涉及用于增加同种异体免疫细胞的持久性和/或植入的方法。该方法至少包括通过使用优选特异性稀有切割核酸内切酶使涉及自体/非自体识别的基因失活的步骤，然后是将所述工程化免疫细胞与至少一种非内源免疫抑制剂多肽(如pd-l1配体和/或ctla-4ig)接触的步骤。本发明还涉及工程化免疫细胞及其功能衍生物、嵌合抗原受体(car)、多链car及其用于增强免疫治疗效率的用途。本发明通过降低移植物抗宿主病gvhd的风险开辟了更安全的策略并允许负担得起的过继性免疫治疗。
背景技术：
：：过继性免疫治疗涉及离体产生的自体抗原特异性t细胞的转移，是治疗病毒感染和癌症的有前景的策略。用于过继性免疫治疗的t细胞可通过扩增抗原特异性t细胞或通过基因工程重定向t细胞而产生(park,rosenbergetal.2011)。病毒抗原特异性t细胞的转移是用于治疗移植相关病毒感染和罕见病毒相关恶性肿瘤的完善程序。类似地，已证实肿瘤特异性t细胞的分离和转移在治疗黑素瘤方面是成功的。已通过转基因t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的遗传转移成功地产生了t细胞中的新特异性(jena,dottietal.2010)。car是由与单个融合分子中的一个或多个信号结构域关联的靶向部分组成的合成受体。通常，car的结合部分由单链抗体(scfv)的抗原结合结构域组成，其包含通过柔性接头(linker)连接的单克隆抗体的轻且可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功应用。第一代car的信号结构域衍生自cd3ζ或fc受体γ链的细胞质区域。已证实第一代car成功地重定向t细胞的细胞毒性，然而它们未能在体内提供延长的扩增和抗肿瘤活性。已单独(第二代)或组合(第三代)添加来自共刺激分子(包括cd28、ox-40(cd134)和4-1bb(cd137))的信号结构域来增强car修饰的t细胞的存活并增加其增殖。car已成功允许t细胞针对来自各种恶性肿瘤包括淋巴瘤和实体瘤在肿瘤细胞表面的表达的抗原进行重定向(jena,dottietal.2010)。目前使用过继性免疫治疗的患者治疗方案是基于自体细胞转移。在该方法中，从基因修饰或离体选择的患者中回收t淋巴细胞，在体外培养以根据需要增加细胞数，最后输注到患者内。除了淋巴细胞输注之外，宿主可以支持t细胞植入或它们参与免疫应答的其它方式进行操作，例如淋巴细胞生长因子(如il-2)的预处理(用辐射或化疗)和施用。各个患者使用患者自体的淋巴细胞(即，自体治疗)接受个体制造的治疗。自体疗法在实际应用中面临重大的技术和后勤障碍，其产生需要昂贵的专用设备和专家人员，它们必须在患者诊断后的短时间内产生，并且在许多情况下，患者的预处理导致免疫功能降低，使得患者的淋巴细胞的功能可能不好并且数量非常少。由于这些障碍，每个患者的自体细胞制备实际上是一种新产品，其导致功效和安全性的显著变化。理想地，人们希望使用一种标准化疗法，其中同种异体治疗细胞可被预先制备，详细表征，并且可用于立即给予患者。同种异体是指细胞从属于同一物种的个体获得，但在遗传上不相似。然而，同种异体细胞的使用目前存在许多缺点。在免疫活性宿主中，同种异体细胞被快速排斥，一种称为宿主与移植排斥反应(hvg)的过程，并且这基本上限制了转移的细胞的功效。在免疫不足宿主中，同种异体细胞能够移植，但其内源性tcr特异性将宿主组织识别为异体的，导致移植物抗宿主病(gvhd)，这可导致严重的组织损伤和死亡。为了有效地使用同种异体细胞，必须克服这两个问题。在免疫活性宿主中，同种异体细胞被宿主免疫系统迅速排斥。已证明，存在于未经辐照血液制品中的同种异体白细胞将持续不超过5至6天。(boni,muranskietal.2008)。因此，为了防止同种异体细胞的排斥，宿主的免疫系统必须被有效地抑制。糖皮质激素广泛用于免疫抑制治疗(coutinhoandchapman2011)。这类类固醇激素与存在于t细胞的胞质液中的糖皮质激素受体(gr)结合，导致转运进入细胞核中，并结合调节参与免疫过程的许多基因表达的特定dna基序。用糖皮质激素类固醇治疗t细胞导致细胞因子产生的水平降低，其导致t细胞无反应性并干扰t细胞激活。阿仑单抗也称为campath1-h，是靶向cd52(12个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(gpi)连接的糖蛋白)的人源化单克隆抗体(waldmannandhale2005)。cd52在t和b淋巴细胞上以高水平表达，在单核细胞上以较低水平表达，而在粒细胞和骨髓前体上不存在。用针对cd52的人源化单克隆抗体的阿仑单抗进行治疗已被证实诱导循环淋巴细胞和单核细胞的快速消耗。它常用于治疗t细胞淋巴瘤，并且在某些情况下，作为用于移植的预处理方案的一部分。然而，在过继性免疫治疗的情况下，使用免疫抑制药物也将对引入的治疗性t细胞产生有害作用。因此，为了在这些条件下有效地使用过继性免疫治疗方法，引入的细胞将需要对免疫抑制治疗具有抗性。另一方面，t细胞受体(tcr)是响应于抗原呈递而参与t细胞激活的细胞表面受体。tcr通常由两条链α和β组成，其组合以形成异二聚体并与cd3转导亚单位关联以形成细胞表面上存在的t细胞受体复合物。tcr的每个α和β链由免疫球蛋白样n-末端可变(v)和恒定(c)区、疏水跨膜结构域和短胞质区组成。对于免疫球蛋白分子，通过v(d)j重组产生α和β链的可变区，从而在t细胞群内产生大量多样性的抗原特异性。然而，与识别完整抗原的免疫球蛋白相反，t细胞通过与mhc分子关联的加工肽片段而激活，向被称为mhc限制的t细胞的抗原识别引入额外维度。通过t细胞受体识别供体和受体之间的mhc差异导致t细胞增殖和gvhd的潜在发展。已证实tcr的正常表面表达取决于复合物的所有七个组分的协调合成和组装(ashwellandklusner1990)。tcrα或tcrβ的失活可导致从t细胞表面消除tcr，从而阻止同种异体抗原和gvhd的识别。然而，tcr破坏导致cd3信号转导成分的消除，并改变进一步的t细胞扩增的手段。适应性免疫应答是一种复杂的生物系统，其中许多细胞成分相互作用。专职性抗原提呈细胞(apc)能够在mhcii类分子的背景下处理异物并将它们暴露于辅助性t细胞。激活的辅助性t细胞进而刺激b细胞反应和细胞毒性t(ctl)细胞反应。ctl识别由mhci类分子呈递的外源肽，但在同种异体反应性的情况下，识别并杀死携带外源mhci类的细胞。mhci类分子由2个实体组成：高度多态性、跨膜重链和小的不变多肽，由b2m基因编码的β2-微球蛋白(β2-m)。mhci类重链在细胞表面的表达需要它与β2-m缔合。因此，cart细胞中β2-m表达的废止会损害mhci类表达，并使它们为宿主ctl不可见的。然而，mhci类缺陷性cart细胞易受宿主nk细胞裂解影响，其靶向缺乏mhci类分子的细胞[ljunggrenhgetal.(1990),immunltoday.11:237-244]。nk细胞基于通过不同单态或多态受体接受的激活和抑制信号之间的平衡，向与其相互作用的细胞发挥细胞毒性作用。人nk细胞上的一个中枢激活受体是nkg2d，其配体包括蛋白质如mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3[rauletdh,(2003),naturereviewsimmunology3(10):781–79]。另一方面，通过nk受体如lir-1/ilt2和mhci类分子之间的相互作用介导抑制信号[ljunggrenhgetal.(1990),immunltoday.11:237-244]。一些病毒如巨细胞病毒具有获得性机制以避免nk细胞介导免疫监视。hcmv基因组编码能够预防mhci类表面表达(即，us2、us3、us6和us11)的蛋白，同时表达作为诱饵以阻断nk介导的细胞裂解的mhci类同源蛋白(ul18)[kim,yetal.(2008),plospathogens.4:e1000123，和wilkinsong.etal.(2010).jclinvirol.41(3):206-212]。此外，hcmv通过分泌能够结合nkg2d配体并防止它们的表面表达的蛋白质干扰nkg2d途径[weltesaetal.(2003),eurjimmunol33(1):194-203]。在肿瘤细胞中，一些机制已演变为通过分泌nkg2d配体如ulbp2、micb或mica来逃避nkg2d反应(waldhaueri,steinlea(2003)。从肿瘤细胞中蛋白水解释放可溶性ul16结合蛋白2(proteolyticreleaseofsolubleul16-bindingprotein2fromtumorcells.)cancerres2006；66(5):2520-2526；salihhretal.(2006),humimmunol.2006mar；67(3):188-95；salihhretal.(2003)blood.2003aug15；102(4):1389-96；salihhretal.(2002)jimmunol.；169(8):4098-102]。病毒使用许多策略来逃避宿主免疫系统，表达逆转录病毒包膜的肿瘤细胞在体内逃避免疫排斥反应[mangeneymetal.(1998).proc.natl.acad.sci.95:14920；quintanaf.etal.(2005).j.clin.invest.115:2149；blochi.etal.(2007),fasebj.21:393]。已证实逆转录病毒如莫洛尼鼠白血病病毒以及慢病毒(hiv1和hiv2)通过它们的包膜蛋白gp41发挥免疫抑制活性[morozovv.etal.(2012),retrovorology.9:67；dennerj.etal.(2013),plosone.8:e55199；schlecht-loufgetal.(2014).j.virology.88:992)。虽然该病毒蛋白的主要功能是促进病毒和细胞膜之间的融合，但gp41的不同结构域可抑制t细胞的激活和增殖。称为isu(用于免疫抑制单元)的第一个位于gp41的n-螺旋重复的c-末端部分(mangeneymetal.(1998).proc.natl.acad.sci.95:14920；morozovv.etal.(2012),retrovorology.9:67；dennerj.etal.(2013),plosone.8:e55199；schlecht-loufgetal.(2014).j.virology.88:992)。它的作用方式尚未确定，但似乎干扰钙内流和pkc(蛋白激酶c)功能。称为fp(融合肽)的第二个位于蛋白质的n末端部分，并与tcrα链直接相互作用，阻止tcr复合体组装[cohentetal.(2010),plospathogens.6:e1001085；faingoldoetal.(2012),j.biol.chem.287:33503]。已证实，isu和fp二者作为全蛋白跨膜蛋白、截短型跨膜蛋白或合成肽是免疫抑制的。t细胞介导的免疫包括通过微调免疫反应的共刺激和抑制信号之间的平衡调节的多个序列步骤。称为免疫检查点的抑制信号对于维持自体耐受性以及限制免疫介导的旁系组织损伤至关重要。免疫检查点蛋白的表达可被肿瘤解除调节。肿瘤指派这些抑制途径的能力代表免疫抗性的重要机制，并且限制免疫治疗的成功。激活治疗性t细胞免疫应答的有前景的方法之一是阻断这些免疫检查点(pardoll2012)。免疫检查点代表癌症中功能性细胞免疫的激活的重要障碍，并且对t细胞(包括ctla4和程序性死亡-1(pd-1))上的抑制性配体特异的拮抗性抗体是临床评价的靶向药物的实例。细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4；也称为cd152)下调t细胞激活的幅度，并且用拮抗剂ctla4抗体(伊匹单抗)治疗已显示黑素瘤患者的存活益处(robertandmateus2011)。程序性细胞死亡蛋白1(pd1或pdcd1也称为cd279)代表免疫治疗的另一个非常有前景的靶标(pardollanddrake2012；pardoll2012)。与ctla-4相比，pd1在感染的炎性反应时限制外周组织中的t细胞效应器功能，并限制自体免疫。pd1抗体的第一次临床试验显示一些肿瘤消退的病例(brahmer,drakeetal.2010)。基于最近的研究，多个额外的免疫检查点蛋白代表用于治疗性阻滞的有前景的靶标。wo2013/173223a申请描述了用于免疫治疗的方法，其中通过施用针对pd-1和/或pd-l1的抗体破坏pd-1-pd-l1途径。该抑制性免疫调节剂用作生物标志物以实现患者选择和指导治疗期管理。pegram等人，(2012)已证实，经修饰以分泌干扰素il-12的肿瘤靶向t细胞可消除鼠模型中的全身性肿瘤，而不需要诸如辐照、淋巴细胞删除性化疗和/或额外的细胞因子支持的预先调节。rong等人，(2014)已证实，在人类胚胎干细胞(hesc)中需要ctla-4ig和pd-l1二者的表达以赋予免疫保护，因为两者自身都不足够。该方法已被用于支持将人胚胎干细胞同种异体移植到小鼠中。在所有上述3种现有技术(wo2013/173223a，pegram等人和rongz等人)中，自我识别系统(如tcr)保持功能，这限制了移植细胞持续存在于宿主中。然而，为了能够使用同种异体cart细胞作为癌症免疫治疗或其它适应症的治疗，必须减轻移植物抗宿主病(gvhd)的风险以及患者排斥治疗性细胞的风险。同种异体细胞可在接受淋巴细胞删除方案的患者中存活，但它们的治疗活性受淋巴细胞删除的持续时间限制。为了延长它们的存活和增强它们的治疗活性，本发明人在此描述了一种防止治疗性同种异体t细胞排斥的方法，同时患者的免疫系统可仍有活性。该方法包括通过工程化治疗细胞在细胞膜上或通过细胞膜异位表达和/或分泌免疫抑制多肽来产生局部免疫保护。他们发现，各组这样的多肽，特别是免疫检查点的拮抗剂，或衍生自病毒包膜或nkg2d配体的多肽可增强持久性和/或将同种异体免疫细胞植入宿主。为了更好的疗效，这种局部免疫抑制作用通过使自体/非自体识别中涉及的基因失活来完成，从而使这些用于植入的工程化免疫细胞可作为“现成(offtheshelf)”产品获得。技术实现要素：本发明公开了通过增加它们的持久性和/或使它们容易植入宿主生物体中，从而降低移植物抗宿主病(gvhd)的风险来设计诸如t细胞的免疫细胞以使它们适于免疫治疗目的的方法。更具体地，本发明涉及一种方法，其中编码参与自体和非自体抗原识别的多肽的至少一种内源基因在一个免疫细胞中失活，随后将所述工程化免疫细胞与至少一种非内源性免疫抑制多肽接触。在一个方面中，失活在tcr和/或β2m基因上进行，优选地通过使用特异性稀有切割核酸内切酶，如tale-核酸酶进行。在另一方面中，为了防止通过宿主抗移植物(hvg)-，即攻击那些同种异体转移的免疫细胞的宿主免疫细胞而继承性转移的同种异体免疫细胞的消耗，通过由免疫细胞自身表达无活性pd1和/或ctla-4配体实现接触步骤。根据本发明的其它替代方案提供病毒mhc同源物、nkg2d配体和/或病毒包膜免疫抑制结构域(viralenvimmunesuppressivedomain)(isu)或病毒fp蛋白的表达。此外，仍在本发明的范围内，可使用工程化免疫细胞与至少一种非内源性免疫抑制性多肽的孵育(incubation)代替免疫抑制多肽的表达。作为在所述孵育中使用的免疫抑制多肽，cd80/cd86抗体是优选的。与免疫治疗相关的经修饰的免疫细胞还可包含编码嵌合抗原受体(car)的外源重组多核苷酸用于特异性细胞识别。所得的包含本说明书中描述的任何蛋白质、多肽或载体的经分离的细胞或细胞系专门用作治疗产品，理想地作为具有降低的移植物抗宿主病(gvhd)风险和延长的寿命的“现成”产品。还描述了通过施用这种工程化免疫细胞来治疗或预防患者的癌症或感染的方法。附图和表的简要描述除了上述之外，本发明还包括将出现在以下描述以及附图中的特征。通过参考结合以下详细描述的以下附图，同样更容易获得对本发明的更完整的理解以及其许多伴随优点的更好理解。附图说明图1：同种异体cart细胞与不同宿主免疫细胞(cd8+和cd4+t细胞，apc如树突状细胞和nk细胞)之间的潜在相互作用的示意图，cart细胞没有另外的基因修饰。符号(+)表示激活且符号(-)表示抑制。cart细胞通过遇到显示由car的scfv识别的抗原细胞表面的靶向肿瘤细胞而被激活。同种异体cart细胞与宿主nk细胞之间的相互作用被由nk细胞的抑制剂识别的mhci所抑制。宿主细胞毒性t细胞(cd8+t细胞)的激活通过cart细胞的mhci成分的tcr结合而发生。此外，宿主nk细胞对同种异体tcar细胞的作用通过mhci识别被抑制。图2：同种异体cart细胞与不同宿主免疫细胞(cd8+和cd4+t细胞，apc如树突状细胞和nk细胞)之间的潜在相互作用的示意图；cart细胞表达分泌的ctla-4ig。符号(+)表示激活且符号(-)表示抑制。cart细胞通过遇到显示由car的scfv识别的抗原细胞表面的靶向肿瘤细胞而被激活。nk细胞和cart细胞之间的相互作用保持不变。分泌的clta-4ig结合apc细胞和肿瘤细胞表面上的cd80/cd86抗原，因此使apc细胞(此处这样的树突状细胞)与cart细胞之间的相互作用失活。因此，clta-4ig的分泌产生局部免疫保护。图3：同种异体cart细胞与不同宿主免疫细胞(cd8+和cd4+t细胞，apc如树突状细胞和nk细胞)之间的潜在相互作用的示意图；cart细胞表达膜结合的pd-l1，并且其pd-1基因被ko失活。符号(+)表示激活且符号(-)表示抑制。cart细胞与肿瘤细胞和nk细胞之间的潜在相互作用保持不变。由于结合pd-l1与后者的pd-1受体，因此同种异体cart细胞的pd-l1的表达使它对宿主cd8+t细胞不敏感。因此，pd-l1触发患者的t细胞中的t细胞抑制途径，当同种异体的pd-1基因失活时，这种作用更加明显。图4：同种异体cart细胞与不同宿主免疫细胞(cd8+和cd4+t细胞，apc如树突状细胞和nk细胞)之间的潜在相互作用的示意图；cart细胞表达分泌的pd-l1，并且其pd-1基因被ko失活。符号(+)表示激活且符号(-)表示抑制。cart细胞与肿瘤细胞以及与nk细胞之间的潜在相互作用保持不变。由同种异体cart细胞分泌的pd-l1可通过它们的pd-1受体与宿主cd8+和cd4+t细胞结合，从而抑制pd-l1/pd-1途径。因此，pd-l1触发患者的t细胞中的t细胞抑制途径，当同种异体的pd-1基因失活时，这种作用更加明显。图5：同种异体cart细胞与不同宿主免疫细胞(cd8+和cd4+t细胞，apc如树突状细胞和nk细胞)之间的潜在相互作用的示意图；cart细胞表达病毒包膜免疫抑制结构域(isu)。符号(+)表示激活且符号(-)表示抑制。cart细胞与肿瘤细胞以及与nk细胞之间的潜在相互作用保持不变。病毒isu的表达似乎通过宿主t细胞抑制同种异体cart细胞的识别，且apc细胞可能通过减少il-10白细胞介素的产生，从而产生免疫抑制作用。图6：同种异体cart细胞与不同宿主免疫细胞(cd8+和cd4+t细胞，apc如树突状细胞和nk细胞)之间的潜在相互作用的示意图，cart细胞具有被ko失活的b2m基因。符号(+)表示激活且符号(-)表示抑制。cart细胞与肿瘤细胞之间的潜在相互作用保持不变。作为mchi的一个成分的b2m基因的失活使得后者在与宿主细胞毒性t细胞(cd8+)和nk细胞的相互作用方面不起作用。然后，nk细胞可通过激活物途径如nkg2d/nkg2d配体在同种异体cart细胞上发挥它的激活。图7：同种异体cart细胞与不同宿主免疫细胞(cd8+和cd4+t细胞，apc如树突状细胞和nk细胞)之间的潜在相互作用的示意图，cart细胞具有被ko失活的b2m基因并且表达病毒mhci同源物。符号(+)表示激活且符号(-)表示抑制。cart细胞与肿瘤细胞之间的潜在相互作用保持不变。对于前图(仅b2mko)，cart细胞与宿主cd8+t细胞之间的相互作用得到减轻。在这种情况下，病毒mhci同源物的表达使得与nk细胞的相互作用通过mhci/抑制剂受体而无效。通过b2m的ko双基因修饰同种异体cart细胞结合病毒mhci同源物的表达加强了它们的免疫抑制保护。图8：同种异体cart细胞与不同宿主免疫细胞(cd8+和cd4+t细胞，apc如树突状细胞和nk细胞)之间的潜在相互作用的示意图，cart细胞具有被ko失活的b2m基因并且表达可溶性nkg2d配体。符号(+)表示激活且符号(-)表示抑制。cart细胞与肿瘤细胞之间的潜在相互作用保持不变。对于前图(仅b2mko)，cart细胞与宿主cd8+t细胞之间的相互作用得到减轻。可溶性nkg2d配体的表达是失活与nk细胞相互作用的另一种方法。在这种情况下，可溶性nkg2d配体可结合nk细胞上的nkg2d受体，但与其一起发挥抑制竞争的cart细胞的nkg2d配体相反，不起作用。通过b2m的ko双基因修饰同种异体cart细胞结合可溶性nkg2d配体的表达加强了它们的免疫抑制保护。图9：同种异体cart细胞过继性免疫治疗的一般方案，例示了潜在的宿主抗移植物反应(hvg)。此处，以抗-cd19嵌合抗原受体(car)为例来代表，其目的是治疗患有急性淋巴细胞性白血病(all)的患者。在从健康供体纯化同种异体t细胞的步骤后，它们的激活和扩增，car转导和最终它们输注到all患者中，对这些同种异体cart细胞存在高度的宿主免疫攻击(hvg)风险。图10：描述pd-l1再表达的方案，以防止在同种异体cart细胞过继性转移后在宿主患者中发生hvg反应。a.通过在原发性t细胞的细胞表面上再表达pd-l1来预防hvg反应的方案。b.不存在pd-l1表达的hvg反应的方案。图11：描述包含宿主抗原呈递细胞(apc)和宿主t细胞的hvg反应连同在同种异体t细胞存在下参与其激活的受体的名称的方案。a.hvg反应的方案。b.通过同种异体t细胞防止ctla4-ig的hvg的方案。图12：a、b和c通过流式细胞术表征t细胞或car工具t细胞表面的pd-l1的表达。图13：将表达pd-l1的工程化cart细胞的特异性细胞裂解活性转移到相关和非相关肿瘤细胞(分别为daudi和k562细胞)。a和b表示不同的献血者。图14：在培养基中由cart细胞分泌的ctla4aig和ctla4big的elisa检测。a.用于定量培养基中的ctla4ig的量的标准曲线。b.在用编码ctla4aig或ctla4big的10或20μg的mrna转染的工程化cart细胞的培养基上清液中检测ctla4a和big。图15：将表达ctla4aig的工程化cart细胞的特异性细胞裂解活性转移到相关和非相关肿瘤细胞(分别为daudi和k562细胞)。图16：t细胞中的β2-m表达的facs分析。通过facs分析未转染的(上图)和转染的t细胞(中间图和下图)的活力(左图)和β2-m表达(右图)。图17：以moi为5用对照lv(pd-l1)、单独的ctla4iglv转导的或用pd-l1和ctla4iglv共转导的工程化cart细胞的培养基上清液中的ctla4ig的检测。通过elisa以1/1000e稀释(阴影条)或1/5000e稀释(黑色条)通过elisa测试来自14天龄培养物的上清液。灰色条表示来自两种稀释的平均滴度。图18：用于定量来自供体1(灰色条)的cfse阴性t细胞的混合淋巴细胞反应，响应于指示的刺激定量cd3+t细胞(黑色条)和t细胞活力(阴影条)。d1和d2分别对应于供体1和供体2。从左到右：(a)单独培养没有任何治疗的来自供体1的pbmc；(b)单独培养已经以浓度增加的pha(植物血球凝集素-10μg/ml，t细胞有丝分裂原)进行治疗的来自供体1的pbmc；(c)共培养来自供体1的pbmc与来自供体2的未转导的t细胞；(d)共培养来自供体1的pbmc与来自供体2的pd-l1转导的t细胞；(e)共培养来自供体1的pbmc与来自供体2的ctla4ig转导的t细胞；(f)共培养来自供体1的pbmc与来自供体2的pd-l1和ctla4ig共转导的t细胞。图19：细胞毒性测定，其中使用特异性靶细胞(molm-13；表达cd123抗原)和对照阴性细胞(daudi)以10:1的e:t比孵育指示的不同工程化cart细胞(如图下方所示)4小时。通过流式细胞术测量靶细胞死亡，并将非特异性杀伤归一化(daudi)。图20：细胞毒性测定，其中使用特异性靶细胞(molm-13)和对照阴性细胞(daudi)以10:1(阴影条)、5:1(黑色条)和1:1(灰色条)的e:t比孵育指示的不同工程化cart细胞(如图下方所示)4小时。通过流式细胞术测量靶细胞死亡，并将非特异性杀伤归一化(daudi)。图21：体内实验的总体方案。在工程化cart细胞注射之前，首先使用molm-13(luc/gfp)肿瘤细胞系注射nog小鼠7天。通过生物发光(biolum.)分析和总体生存来监测肿瘤进展。图22：通过流式细胞术监测工程化t细胞的carcd123和pd-l1细胞表面表达。图23：显示nog小鼠中的肿瘤的从d-1到d14的生物发光图像。照片中的黑点代表肿瘤。注射到小鼠中的不同组的t细胞呈现如下。在图23a中：未转染的t细胞(无cart细胞)或由抗-cd123car(cartcd123)转染的t细胞。在图23b中：用抗-cd123car转染并用ctla4ig(cartcd123/ctla4ig)转导的t细胞；用抗-cd123car转染并用pd-l1(cartcd123/pdl1)转导的t细胞；用抗-cd123car转染并用ctla4ig和pd-l1(cartcd123/pdl1/ctla4ig)转导的t细胞。图24：具有以下成分的不同单链嵌合抗原受体car体系结构(v1至v6)示意图：对抗原、铰链、跨膜结构域(tm)、共刺激结构域(4-1bb)和信号转导结构域(cd3ζ)特异性的vh和vl链，任选地具有一个或多个接头。表1：β2mtale-核酸酶序列的描述表2：提出了2对talen的多核苷酸序列并用于2种不同的pdc1基因靶标表3：表达clta-4a、ctla-4b和pd-l1的质粒构建体的多核苷酸序列。表4：来自不同病毒的isu结构域变体的多肽序列。表5：病毒mhc同源物(ul18)和一组nkg2d配体的多肽序列。表6：来自天然和人工起源的fp多肽的氨基酸序列。表7：trac和trbctale-核酸酶和人类相应基因中的tale-核酸酶靶位点的序列的描述。具体实施方式除非本文具体地定义，使用的所有技术和科学术语具有与基因治疗、生物化学、遗传学和分子生物学领域的技术人员通常理解的相同含义。与本文所述的相似或等同的所有方法和材料可用于使用本文所述的合适方法和材料实施或测试本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用它们的全部内容并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，除非另有说明，材料、方法和实施例仅是说明性的而不旨在是限制性的。除非另有说明，本发明的实施采用在本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术。这些技术在文献中得到充分解释。参见例如，currentprotocolsinmolecularbiology(frederickm.ausubel,2000,wileyandsoninc,libraryofcongress,usa)；molecularcloning:alaboratorymanual,thirdedition,(sambrook等人,2001,coldspringharbor,newyork:coldspringharborlaboratorypress)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait编辑,1984)；mullis等人，美国专利号4,683,195；nucleicacidhybridization(b.d.harries&s.j.higgins编辑.1984)；transcriptionandtranslation(b.d.hames&s.j.higgins编辑.1984)；cultureofanimalcells(r.i.freshney,alanr.liss,inc.,1987)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress,1986)；b.perbal,apracticalguidetomolecularcloning(1984)；theseries,methodsinenzymology(j.abelsonandm.simon编辑.-in-chief,academicpress,inc.,newyork),具体地，第154和155卷(wu等人编辑)和第185卷,“geneexpressiontechnology”(d.goeddel编辑)；genetransfervectorsformammaliancells(j.h.miller和m.p.calos编辑,1987,coldspringharborlaboratory)；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayer和walker编辑,academicpress,london,1987)；handbookofexperimentalimmunology,第i-iv卷(d.m.weir和c.c.blackwell编辑,1986)和manipulatingthemouseembryo,(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1986)。在一般方面中，本发明涉及用于治疗癌症和感染中的新的过继性免疫治疗策略的方法。本发明涉及以下主要实施方式：1)增加同种异体免疫细胞持久性和/或移植成活率(engraftment)的方法，包括：a)提供同种异体细胞；b)通过失活至少一种编码涉及自体和非自体抗原识别的多肽的内源基因来修饰所述细胞；和c)使所述免疫细胞与至少一种非内源性免疫抑制多肽接触。2)根据实施方式1的方法，其中所述免疫细胞是造血细胞。3)根据实施方式1或实施方式2的方法，其中所述免疫细胞是原代细胞。4)根据实施方式1至3中任一项的方法，其中步骤c)中的所述表达或接触不特异性抑制t调节细胞。5)根据实施方式1至4中任一项的方法，其中步骤c)中的所述表达或接触特异性抑制cd8+t细胞。6)根据实施方式1至实施方式5中任一项的方法，其中步骤c)通过在所述免疫细胞中表达至少一种指导至少一种非内源性免疫抑制性多肽的分泌的非内源性多核苷酸进行。7)根据实施方式1至实施方式6中任一项的方法，其中步骤c)另外包含编码pd-1的基因的表达的失活。8)根据实施方式7的方法，其中通过使用编码seqidn°11-12和13-14的tale-核酸酶的多核苷酸来进行pd-1基因的失活。9)根据实施方式1至8中任一项的方法，其中步骤b)中的所述多肽选自tcr、mhc类i类组分、b-2微球蛋白(b2m)、tap1和大多功能蛋白酶2。10)根据实施方式1至9中任一项的方法，其中步骤c)中的所述多肽选自pdl-1、ctla-4、病毒mhc同源物、nkg2d配体、病毒包膜免疫抑制结构域(isu)或病毒fp蛋白。11)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过在所述同种异体免疫细胞中表达无活性pdl-1配体进行。12)根据实施方式1至11中任一项的方法，其中步骤c)中的另外的修饰通过在所述同种异体免疫细胞中表达ctla-4免疫球蛋白进行。13)根据实施方式12的方法，其中编码待表达的ctla-4免疫球蛋白的核酸分子与seqidno:16-17共有至少80％、优选90％、并且更优选为95％的同一性。14)根据实施方式1至13中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达无活性pdl-1配体进行。15)根据实施方式1至10中任一项所述的方法，其中步骤c)通过表达选自felv、mlv、herv或病毒fp蛋白的病毒包膜免疫抑制结构域(isu)进行。16)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒包膜免疫抑制结构域(isu)进行。17)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞的病毒包膜免疫抑制结构域(isu)的表达进行。18)根据实施方式16或17的方法，其中编码待表达的病毒包膜免疫抑制结构域(isu)的核酸分子与seqidno:19-38共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。19)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒fp蛋白进行。20)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒fp蛋白进行。21)根据实施方式19或20的方法，其中编码待表达的病毒fp蛋白的核酸分子与seqidno:48-50共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。22)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达nkg2g配体进行。23)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达nkg2g配体进行。24)根据实施方式22或23的方法，其中编码待表达的nkg2g配体的核酸分子与seqidno:40-47共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。25)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)ii)中的病毒mhc同源物是ul18。26)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒mhc同源物ul18进行。27)根据实施方式1至10中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒mhc同源物ul18进行。28)根据实施方式26或27的方法，其中编码待表达的病毒mhc同源物ul18的核酸分子与seqidno:39共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。29)根据实施方式1至5或实施方式8-9中任一项的方法，其中步骤c)通过在至少一种非内源性免疫抑制多肽中孵育所述免疫来进行。30)根据实施方式29的方法，其中所述非内源性免疫抑制多肽是抗-cd80或抗-cd86mab。31)根据实施方式1或30中任一项的方法，其中步骤b)中的基因失活通过使用tal-核酸酶、大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(zing-fingernuclease)(zfn)或rna引导的核酸内切酶进行。32)根据实施方式1或31中任一项的方法，其中步骤b)中的基因失活使用tal-核酸酶进行。33)根据实施方式1至31中任一项的方法，其中步骤b)中的基因失活通过使用rna引导的核酸内切酶进行。34)根据实施方式33的方法，其中rna引导的核酸内切酶是cas9。35)根据实施方式1-10、11-15、17-18、20-21、23-25或27-34中任一项的方法，其中步骤b)中的基因失活通过使用抑制编码tcr的基因的表达的核酸分子进行。36)根据实施方式32的方法，其中通过使用seqidn°52-53、55-56、62-63和65-66的tale-核酸酶进行tcr基因的失活。37)根据实施方式1-12、13-16、18-19、21-22、24-26或28-34中任一项的方法，其中步骤b)中的失活基因通过使用抑制编码b2m的基因的表达的核酸分子进行。38)根据实施方式32的方法，其中通过使用seqidn°2-3、5-6和8-9的tale-核酸酶进行b2m基因的失活。39)根据实施方式1至38中任一项的方法，进一步包括以下步骤：d)向所述t细胞中引入包含编码针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原的嵌合抗原受体(car)的核苷酸序列的外源核酸分子。40)根据实施方式39的方法，其中所述嵌合抗原受体包含与seqidno67(cd19抗原)、seqidno68(cd38抗原)、seqidno69(cd123抗原)、seqidno70(cs1抗原)、seqidno71(bcma抗原)、seqidno72(flt-3抗原)、seqidno73(cd33抗原)、seqidno74(cd70抗原)、seqidno75(egfr-3v抗原)和seqidno76(wt1抗原)具有超过80％同一性、优选超过90％、且更优选超过95％的作为抗原靶序列的scfv(vh和vl链)。41)根据实施方式1至40中任一项的方法，进一步包括以下步骤：d)扩增得到的工程化t细胞。42)一种工程化的、优选分离的t细胞，通过使用根据实施方式1至41中任一项的方法可获得。43)根据实施方式42的工程化的t细胞，用作药物。44)根据实施方式42或实施方式43的工程化的t细胞，用于治疗癌症或病毒感染。45)根据实施方式42至44中任一项的工程化的t细胞，用于治疗淋巴瘤。46)根据实施方式42至45中任一项的工程化的t细胞，其中所述t细胞源自待治疗的患者。47)根据实施方式42至45中任一项的工程化的t细胞，其中所述t细胞源自供体。48)一种包含至少一种根据实施方式42至47中任一项的工程化的t细胞的组合物。本发明更具体地涉及以下实施方式：1)在宿主免疫细胞的存在下增加同种异体免疫细胞的持久性和/或移植成活率的方法，包括：a)提供同种异体细胞；b)通过失活至少一种编码参与针对自体和非自体抗原识别的响应的多肽的内源基因来修饰所述细胞；和c)使所述宿主免疫细胞与至少一种非内源性免疫抑制多肽接触，所述非内源性免疫抑制多肽具有预防它们与同种异体免疫细胞相互作用的作用。2)根据实施方式1的方法，其中步骤b)中的所述多肽选自tcr、mhc类i类组分、b-2微球蛋白(b2m)、tap1和大多功能蛋白酶2。3)根据实施方式1或2的方法，其中步骤c)中的所述免疫抑制多肽以膜结合形式和/或以分泌形式存在。4)根据实施方式1至3中任一项的方法，其中步骤c)通过在所述免疫细胞中表达至少一种编码与所述免疫细胞的膜表面结合的非内源性免疫抑制多肽的非内源性多核苷酸进行。5)根据实施方式1至4中任一项的方法，其中与所述免疫细胞的膜表面结合的所述一种非内源性免疫抑制多肽是pd-l1配体。6)根据实施方式5的方法，其中编码待表达的膜结合形式的pd-l1配体的核酸分子与seqidno:18共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。7)根据实施方式1至3中任一项的方法，其中所述免疫抑制多肽以分泌形式存在。8)根据实施方式1-3或实施方式7中任一项的方法，其中步骤c)通过在所述免疫细胞中表达至少一种编码一种在所述免疫细胞中以分泌形式存在的非内源性免疫抑制多肽的非内源性多核苷酸进行。9)根据实施方式8的方法，其中编码待表达的ctla-4免疫球蛋白的核酸分子与seqidno:16-17共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。10)根据实施方式1-8中任一项的方法，其中步骤c)通过使所述宿主免疫细胞与非内源性免疫抑制多肽pd-l1配体和ctla-4免疫球蛋白接触来进行。11)根据实施方式10的方法，其中步骤c)由非内源性免疫抑制多肽pd-l1配体和ctla-4免疫球蛋白二者的免疫细胞中的表达进行。12)根据实施方式11的方法，其中所述分泌至少一种非内源性免疫抑制多肽是分泌形式的pd-l1配体。13)根据实施方式9至12中任一项的方法，其中编码在所述同种异体免疫细胞中待表达的膜结合形式的pd-l1配体和ctla-4免疫球蛋白的核酸分子分别与seqidno:18和seqidno:16-17共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。14)根据实施方式1至13中任一项的方法，其中所述免疫细胞是原代细胞。15)根据实施方式1至3中任一项的方法，其中步骤c)中的所述表达或接触不特异性抑制t调节细胞。16)根据实施方式1至15中任一项的方法，其中步骤c)中的所述表达或接触特异性抑制宿主cd8+t细胞。17)根据实施方式1至16中任一项的方法，其中步骤c)另外包含pd-1基因的表达的失活。18)根据实施方式1至3中任一项的方法，其中步骤c)通过在所述免疫细胞中表达至少一种编码膜结合形式的pd-l1配体的非内源性多核苷酸进行，并且所述同种异体细胞的进一步修饰通过pd-1基因的表达的失活进行。19)根据实施方式1至18中任一项的方法，其中步骤c)通过在所述免疫细胞中表达至少一种引导ctla4ig的分泌的非内源性多核苷酸进行，并且所述同种异体细胞的进一步修饰通过pd-1基因的表达的失活进行。20)根据实施方式1至19中任一项的方法，其中步骤c)通过步骤c)通过非内源性免疫抑制多肽pd-l1配体和ctla-4免疫球蛋白二者在所述免疫细胞中的表达进行，并且所述同种异体免疫细胞的进一步修饰通过pd-1基因的表达的失活进行。21)根据实施方式20的方法，其中通过使用编码seqidn°11-12和13-14的tale-核酸酶的多核苷酸来进行pd-1基因的失活。22)根据实施方式1至16中任一项的方法，其中步骤c)中的所述多肽选自pd-l1、ctla-4、病毒mhc同源物、nkg2d配体、病毒包膜免疫抑制结构域(isu)或病毒fp蛋白。23)根据实施方式1至4中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过在所述同种异体免疫细胞中表达pd-l1配体进行。24)根据实施方式1至4中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达pd-l1配体进行。25)根据实施方式1至4中任一项的方法，其中步骤c)通过表达选自felv、mlv、herv或病毒fp蛋白的病毒包膜免疫抑制结构域(isu)进行。26)根据实施方式1至4或实施方式25中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒包膜免疫抑制结构域(isu)进行。27)根据实施方式1至4中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞的病毒包膜免疫抑制结构域(isu)的表达进行。28)根据实施方式26或27的方法，其中编码待表达的病毒包膜免疫抑制结构域(isu)的核酸分子与seqidno:19-38共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。29)根据实施方式1至4中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒fp蛋白进行。30)根据实施方式1至4或实施方式29中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒fp蛋白进行。31)根据实施方式29或30的方法，其中编码待表达的病毒fp蛋白的核酸分子与seqidno:48-50共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。32)根据实施方式1至4中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达nkg2g配体进行。33)根据实施方式1至4或实施方式32中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达nkg2g配体进行。34)根据实施方式32或33的方法，其中编码待表达的nkg2g配体的核酸分子与seqidno:40-47共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。35)根据实施方式1至4中任一项的方法，其中步骤b)ii)中的病毒mhc同源物是ul18。36)根据实施方式1至4或实施方式35中任一项的方法，其中步骤b)通过b2m的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒mhc同源物ul18进行。37)根据实施方式1至4或实施方式36中任一项的方法，其中步骤b)通过tcr的失活进行，且步骤c)通过由所述同种异体免疫细胞表达病毒mhc同源物ul18蛋白进行。38)根据实施方式36或37的方法，其中编码待表达的病毒mhc同源物ul18的核酸分子与seqidno:39共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。39)根据实施方式1至38中任一项的方法，其中步骤c)通过在至少一种非内源性免疫抑制多肽中孵育所述免疫来进行。40)根据实施方式39的方法，其中所述非内源性免疫抑制多肽是抗-cd80或抗-cd86mab。41)根据实施方式1至40中任一项的方法，其中步骤b)中的基因失活通过使用tal-核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或rna引导的核酸内切酶进行。42)根据实施方式41的方法，其中步骤b)中的基因失活使用tal-核酸酶进行。43)根据实施方式41的方法，其中步骤b)中的基因失活通过使用rna引导的核酸内切酶进行。44)根据实施方式43的方法，其中rna引导的核酸内切酶是cas9。45)根据实施方式1-18、20-22、24-25、27-28、30-32或34-41中任一项的方法，其中步骤b)中的基因失活通过使用抑制编码tcr的基因的表达的核酸分子进行。46)根据实施方式45的方法，其中通过使用seqidn°52-53、55-56、62-63和65-66的tale-核酸酶进行tcr基因的失活。47)根据实施方式1-17、20-2、25-26、28-29、31-33或35-41中任一项的方法，其中步骤b)中的失活基因通过使用抑制编码b2m的基因的表达的核酸分子进行。48)根据实施方式47的方法，其中通过使用seqidn°2-3、5-6和8-9的tale-核酸酶进行b2m基因的失活。49)根据实施方式1至48中任一项的方法，进一步包括以下步骤：d)向所述t细胞中引入包含编码针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原的嵌合抗原受体(car)的核苷酸序列的外源核酸分子。50)根据实施方式49的方法，其中所述嵌合抗原受体包含与seqidno67(cd19抗原)、seqidno68(cd38抗原)、seqidno69(cd123抗原)、seqidno70(cs1抗原)、seqidno71(bcma抗原)、seqidno72(flt-3抗原)、seqidno73(cd33抗原)、seqidno74(cd70抗原)、seqidno75(egfr-3v抗原)和seqidno76(wt1抗原)具有超过80％同一性、优选超过90％、且更优选超过95％的作为抗原靶序列的scfv(vh和vl链)。51)根据实施方式1-50中任一项的方法，其中步骤c)由非内源性免疫抑制多肽pd-l1配体和/或ctla-4免疫球蛋白在所述同种异体免疫细胞中的表达进行，所述同种异体免疫细胞通过表达抗-cd123嵌合抗原受体被进一步修饰。52)根据实施方式51的方法，其中通过使pd-1基因的表达的失活进行所述同种异体免疫细胞的进一步修饰。53)根据实施方式1至52中任一项的方法，进一步包括以下步骤：d)扩增得到的工程化的t细胞。54)一种工程化的、优选分离的t细胞，通过使用根据实施方式1至53中任一项所述的方法可获得。55)根据实施方式54的工程化的t细胞，用作药物。56)根据实施方式54或实施方式55的工程化的t细胞，用于治疗癌症或病毒感染。57)根据实施方式54至56中任一项的工程化的t细胞，用于治疗淋巴瘤或白血病。58)根据实施方式54至57中任一项的工程化的t细胞，其中所述t细胞源自待治疗的患者。59)根据实施方式54至57中任一项的工程化的t细胞，其中所述t细胞源自供体。60)一种包含至少一种根据实施方式54至59中任一项的工程化的t细胞的组合物。关于本发明的上述方面的更多细节在下面的描述中提供。用于免疫治疗的非同种异体反应性和高度持久性的t细胞根据本发明的第一方面，本发明人已证实，当一些基因在同种异体免疫细胞中表达时，它们可允许其在宿主生物体中的持久性增加以获得更好的功效。本发明涉及一种优选地在宿主免疫细胞的存在下增加同种异体免疫细胞的持久性和/或移植成活率的方法，包括：i)提供同种异体细胞；ii)通过失活至少一种编码参与针对自体和非自体抗原识别的响应的多肽的内源基因来修饰所述细胞；和iii)使所述宿主免疫细胞与至少一种非内源性免疫抑制多肽接触。预期所述非内源性免疫抑制多肽具有预防宿主免疫细胞与同种异体免疫细胞相互作用的作用。“持久性”是指细胞抵抗排斥的能力，并且在体内随时间保持和/或增加数量(例如，天、周、月、年)的数量。通常，在输注到所述患者体内之后，本发明的工程化免疫细胞可在患者的血液中发现至少10天，优选为至少20天，更优选为至少25天，甚至更优选为至少30天。“植入”是指在体内细胞接触和结合在现有的感兴趣的位点的过程。“增加持久性和/或植入”是指在治疗过程期间，与其中给予患者非工程化免疫细胞(即，非持久性)的情况相比，工程化以使它们持续的同种异体免疫细胞的数量保持较高。这种提高的持久性和/或待注射到患者中的同种异体免疫细胞的植入(例如，t细胞)是免疫耐受性的一部分(或“免疫耐受作用(tolerisation)”)，其描述了宿主免疫系统相对于所述免疫细胞的无应答性状态，而所述免疫细胞保留引发免疫应答的能力。涉及自体和非自体抗原识别的基因失活“自体和非自体抗原识别”旨在由细胞免疫系统进行筛选，借此由主要组织相容性复合物(mhc)分子上的宿主细胞呈递肽，以评估细胞是否被外源生物体感染。该筛选涉及其它跨膜结构，例如像tcr或tap1/tap2或蛋白酶2。通过使基因失活，意图是感兴趣的基因不表达功能蛋白形式。在特定实施方式中，该方法的基因修饰依赖于工程师提供的细胞中表达一种稀有切割核酸内切酶，使得所述稀有切割核酸内切酶特异性催化一种靶基因中的切割，从而使所述靶基因失活。由稀有切割核酸内切酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(nhej)的不同机制进行修复。然而，nhej是一个不完美的修复过程，其通常会导致切割部位处的dna序列的变化。机制包括通过直接再连接(critchlowandjackson1998)或通过所谓的微同源介导的末端连接(ma,kimetal.2003)重新连接两个dna末端的剩余部分。通过非同源末端连接(nhej)修复通常导致小的插入或缺失，并且可用于产生特异性基因敲除。所述修饰可以是至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。可通过本领域公知的方法鉴定和/或选择其中发生切割诱导的诱变事件的细胞，即与nhej事件相连的诱变事件。已知内切核苷酸断裂刺激同源重组的速率。因此，在另一个实施方式中，该方法的基因修饰步骤还包括向细胞中引入包含至少与靶核酸序列的一部分同源的序列的外源核酸的步骤，使得在靶核酸序列和外源核酸之间发生同源重组。在特定实施方式中，所述外源核酸分别包含与靶核酸序列的区域5’和3’同源的第一和第二部分。在这些实施方式中，所述外源核酸还包含位于第一部分和第二部分之间的第三部分，其不包含与靶核酸序列的区域5’和3’的同源性。在切割靶核酸序列之后，在靶核酸序列和外源核酸之间刺激同源重组事件。优选地，在所述供体基质内使用至少50bp，优选大于100bp且更优选大于200bp的同源序列。因此，外源核酸优选为200bp至6000bp，更优选为1000bp至2000bp。实际上，共有的核酸同源性位于断裂位点的上游和下游侧翼区域，并且待引入的核酸序列应位于两个臂之间。根据优选的实施方式，优选通过使用tal-核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或rna/dna引导的核酸内切酶，如cas9、cpf1或argonaute进行基因失活。根据更优选的实施方式，所述参与自体和非自体抗原识别的基因的失活通过使用tale-核酸酶进行。这可在由特异性tale-核酸酶靶向的精确基因组定位完成，其中所述特异性tale核酸酶催化切割，并且其中所述外源核酸连续包含至少一个同源性区域和使一个选自前述组的靶向基因失活的序列。可通过分别使用几种tale-核酸酶来连续或同时地失活几种基因，并且特异性靶向一个定义的基因和几种特异性的基因。tale核酸酶旨在是由衍生自类转录激活因子效应物(tale)的dna结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成的融合蛋白，以切割核酸靶序列。(boch,scholzeetal.2009；moscouandbogdanove2009；christian,cermaketal.2010；cermak,doyleetal.2011；geissler,scholzeetal.2011；huang,xiaoetal.2011；li,huangetal.2011；mahfouz,lietal.2011；miller,tanetal.2011；morbitzer,romeretal.2011；mussolino,morbitzeretal.2011；sander,cadeetal.2011；tesson,usaletal.2011；weber,gruetzneretal.2011；zhang,congetal.2011；deng,yanetal.2012；li,piateketal.2012；mahfouz,lietal.2012；mak,bradleyetal.2012)。根据另一个优选的实施方式，涉及自体和非自体抗原识别的所述基因的失活通过rna引导的核酸内切酶如cas9或dna引导的核酸内切酶进行，例如wo2014189628中所述的基于argonaute的技术。本发明涉及增加同种异体细胞的持久性和/或植入的方法，其包括使参与自体/非自体识别的至少一种基因失活的步骤。“参与自体/非自体识别的基因”是指编码结构上是外部受体或配体的一部分的多肽的基因，其被认为是由免疫系统检测和破坏同种异体细胞所必需的。这些基因优选编码tcr、mhc，特别是i类mhc、β-2微球蛋白(b2m)、tap1或大多功能蛋白酶2的至少一种成分。在优选的实施方式中，待失活的基因是tcr或b2m，更优选是tcr。在本发明中，已设计出新的tale-核酸酶用于精确靶向过继性免疫治疗策略的相关基因。根据本发明的优选的tale-核酸酶是识别和切割选自用于失活β2m的seqidno:2-3、5-6和8-9和seqidn°52-53、55-56、62-63和65-66(tcr)的那些。tale-核酶裂解人β2m编码人β2m基因的靶向外显子的tale-核酸酶的mrna从cellectisbioresearch(8,ruedelacroixjarry,75013paris)中订购。下表1表示由两个独立实体(称为半tale-核酸酶)中的每一个切割的靶序列，其各自含有重复序列，所述重复序列被工程化以在由15-bp间隔物隔开的两个17-bp长序列(称为半靶标)组成的靶序列之间结合和切割。表1：β2mtale-核酸酶序列的描述tale-核酸酶切割人类pd-1基因除了涉及自体和非自体抗原识别的所述基因的失活之外，还可寻求其它基因工程，例如如wo2014/184744所述的编码免疫检查点的一个或几个基因的失活。在优选的实施方式中，对于参与自体/非自体识别的至少一种基因的失活，对编码pd-1的基因进行另外的失活。pd-1对应于人类程序死亡1(也称为pdcd1或cd279，参考序列登录号：人类基因为nm_005018)。这种pd-1抑制，优选通过talen介导的破坏具有使同种异体免疫细胞对通过pd-l1(也称为cd274或b7同源物1(b7-h1)，并且具有用于人类基因的参考序列号nm_001267706)的自体或交互抑制具有抗性的目的。根据优选的实施方式，所述pd-1基因的失活通过使用如下表2所示的编码tale-核酸酶的多核苷酸进行。表2：提供2对talen的多核苷酸序列用于2种不同的pdc1(或pd-1)基因靶标。根据本发明的一个实施方式，所述方法的步骤c)通过在所述免疫细胞中表达至少一种编码与膜结合的pd-l1配体的非内源性多核苷酸进行，以及所述同种异体细胞的进一步修饰通过pd-1基因的表达的失活进行。根据本发明的另一个实施方式，所述步骤c)通过在所述免疫细胞中表达至少一种对应于分泌的ctla4免疫球蛋白的非内源性多核苷酸进行，以及所述同种异体细胞的进一步修饰通过编码pd-1的基因的表达的失活进行。根据本发明的优选实施方式，所述步骤c)通过步骤c)通过非内源性免疫抑制多肽pd-l1配体和ctla-4免疫球蛋白二者在所述免疫细胞中的表达进行，并且所述同种异体免疫细胞的进一步修饰通过编码pd-1的基因的表达的失活进行。非内源性免疫抑制多肽的表达根据优选的实施方式，本发明方法的所述步骤c)通过在所述免疫细胞中表达至少一种编码与所述免疫细胞的膜结合的非内源性免疫抑制多肽的非内源性多核苷酸进行。根据一个实施方式，所述非内源性免疫抑制多肽以膜结合形式和/或以分泌形式存在。“非内源性多肽”是指通常并非由供体免疫细胞表达的多肽，优选为由已经导入免疫细胞基因组的外源多核苷酸表达的多肽。例如，特此il12不被认为是非内源性多肽，因为它是由来自供体免疫细胞的预先存在的基因表达的。“非自然表达”是指编码所述多肽的多核苷酸序列最初不存在于免疫细胞(例如，ctla4ig)的基因组中，或所述多核苷酸序列存在于基因组中，但多肽在天然免疫细胞(即，非工程化的)中以较低水平表达，通常为至少50％，优选为至少75％，更优选为至少100％且甚至更优选为200％，其低于在相同的实验或处理条件下，在工程化免疫细胞中观察到的表达水平。“免疫抑制”是指所述非内源多肽的表达具有减轻患者宿主对供体免疫细胞的免疫应答的作用。根据本发明的优选方面，所述非内源性免疫抑制多肽选自pd-l1、ctla-4-ig、病毒mhc同源物、nkg2d配体、病毒包膜免疫抑制结构域(isu)或病毒fp蛋白。根据一个实施方式，该方法包括在免疫细胞中表达至少一种对应于非内源性分泌的免疫抑制多肽的非内源性多核苷酸的步骤c)。根据更优选的实施方式，与所述免疫细胞的膜结合的所述一种非内源性免疫抑制多肽是膜结合形式的pd-l1配体。ctla-4-ig的表达根据一个实施方式，在所述同种异体免疫细胞中表达的非内源性免疫抑制多肽是ctla-4蛋白的配体，优选为ctla4免疫球蛋白。细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)也称为cd152，基因库登录号af414120.1)。根据优选的实施方式，对应于在所述同种异体免疫细胞中表达的ctla-4免疫球蛋白的多肽包含seqidno:16(ctla-4a)或seqidno:17(ctla4b)，或者与seqidno:16或seqidno:17共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。关于图1(无表达)的情况，图2(ctla4-ig的表达)示意性地表示了同种异体t细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用。根据一个优选的实施方式，编码ctla-4aig和ctla-4big的核酸分子分别与seqidno:16和seqidno:17共有至少80％、优选90％、且更优选95％的同一性，如下表3所示。表3：表达clta-4a、ctla-4b和pd-l1的质粒构建体的多核苷酸序列。根据一个实施方式，将工程化的免疫细胞与抗-cd80或抗-cd86mab的非内源性免疫抑制多肽一起孵育。pd-l1的表达pd-l1(其它名称：cd274，程序化细胞死亡1配体；参考用于人多肽序列q9nzq7的uniprot)编码290个氨基酸的i型跨膜蛋白，其由igv样结构域、igc样结构域、疏水跨膜结构域和30个氨基酸的胞质尾区组成。根据本发明的优选实施方式，在所述同种异体免疫细胞中表达的非内源性免疫抑制多肽是pd-l1的配体，更特别地为膜结合形式。pd-l1配体的这种膜结合形式在本发明中是指以天然形式(野生型)或截短形式，例如通过除去细胞内结构域或用一种或多种突变(wangs等人,2003,jexpmed.2003；197(9):1083–1091)。根据本发明，pd1不被认为是pd-l1配体的膜结合形式。根据更优选的实施方式，编码待表达的膜结合形式的pd-l1配体的核酸分子是seqidno:18，或与seqidno:18共享至少80％、优选90％、且更优选95％的同一性(对应于pdl1-配体的野生型)。根据另一个实施方式，所述至少一种非内源性免疫抑制多肽是分泌形式的pd-l1配体。可通过将pd-l1的细胞外结构域融合到免疫球蛋白的fc部分而产生这种重组分泌的pd-l1(或可溶性pd-l1)(hailest等人,2014,cancerimmunolres.2(7):610–615；songmy等人,2015,gut.64(2):260-71)。这种重组pd-l1中和pd-1并废除pd-1介导的t细胞抑制。关于图1(无表达)的情况，图3(膜结合的pd-l1的表达)示意性地表示了同种异体t细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用。图3还表示当pd-1基因被ko破坏时的情况。根据先前实施方式的替代方案，在所述同种异体免疫细胞中表达的非内源性免疫抑制多肽是分泌形式的pd-l1配体。关于图1(无表达)的情况，图4(分泌的pd-l1配体的表达)示意性地表示了同种异体t细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用。图4还表示当pd-1基因被ko破坏时的情况。根据一个优选的实施方式，核酸分子编码待表达的作为seqidno:18的膜结合的pd-l1，或与seqidno:18共享至少80％、优选90％、且更优选95％的同一性。pd-l1配体与ctla4ig的共表达本发明还涉及一种在宿主免疫细胞的存在下增加同种异体免疫细胞的持久性和/或植入的方法，其中步骤c)通过使所述宿主免疫细胞与非内源性免疫抑制多肽pd-l1配体和ctla-4免疫球蛋白接触进行。根据优选的实施方式，方法的步骤c)通过步骤c)通过非内源性免疫抑制多肽pd-l1配体和ctla-4免疫球蛋白二者的免疫细胞中的表达进行。根据优选的实施方式，核酸分子编码膜结合形式的pd-l1配体，并且在所述同种异体免疫细胞中，在方法的步骤c)期间，编码待表达的ctla-4免疫球蛋白，所述pd-l1配体和ctla-4ig分别具有seqidno:18和seqidno:16-17，或与seqidno:18和seqidno:16-17共享至少80％、优选90％、且更优选95％的同一性。isu结构域的表达根据另一个实施方式，在所述同种异体免疫细胞中表达的非内源性免疫抑制多肽是病毒包膜免疫抑制结构域(isu)，其衍生自例如hiv-1、hiv-2、siv、momulv、htlv-1、-ii、mpmv、srv-1、syncitin1或2、herv-k或felv。关于图1(无表达)的情况，图5(病毒isu结构域的表达)示意性地表示了同种异体t细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用。下表4示出可在本发明中表达的来自不同病毒的isu结构域的变体。表4：来自不同病毒的isu结构域变体因此，在某些实施方式中，在所述同种异体免疫细胞中表达的非内源性免疫抑制多肽是seqidno.19-38的isu结构域。病毒mhc同源物的表达根据另一个实施方式，在所述同种异体免疫细胞中表达的非内源性免疫抑制多肽是病毒mhc同源物，例如ul18。在一个实施方式中，所述非内源性免疫抑制多肽是包含seqidno.39的嵌合β2m-ul18或与seqidno:39共享至少80％、优选90％、且更优选95％的同一性的mhc同源物。关于图6(无表达)的情况，图7(病毒mhc同源物的表达)示意性地表示了同种异体t细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用。在两个图中，mhci类通过破坏(ko)β2m基因而失活。nkg2d配体的表达一些病毒如巨细胞病毒具有获得性机制以避免nk细胞介导免疫监督并通过分泌能结合nkg2d配体并防止它们的表面表达的蛋白质干扰nkg2d途径(welte,s.a.；sinzger,c.；lutz,s.z.；singh-jasuja,h.；sampaio,k.l.；eknigk,u.；rammensee,h.g.；steinle,a.2003“通过人巨细胞病毒ul16糖蛋白选择性细胞内保留病毒诱导的nkg2d配体(selectiveintracellularretentionofvirallyinducednkg2dligandsbythehumancytomegalovirusul16glycoprotein)”。eur.j.immunol.,33,194–203)。在肿瘤细胞中，通过分泌nkg2d配体如ulbp2、micb或mica，一些机制已演变为逃避nkg2d反应(salihhr,antropiush,giesekef,lutzsz,kanzl,等人，(2003)用于激活白血病中的免疫受体nkg2d的配体的功能表达和释放(functionalexpressionandreleaseofligandsfortheactivatingimmunoreceptornkg2dinleukemia)。blood102:1389–1396)。根据另一个实施方式，在所述同种异体免疫细胞中表达的非内源性免疫抑制多肽是nkg2d配体。关于图6(无表达)的情况，图8(可溶性nkg2d配体的表达)示意性地表示了同种异体t细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用。在两个图中，mhci类通过破坏(ko)β2m基因而失活。下表5表示根据本发明表达的病毒mhc同源物(ul18)和一组nkg2d配体及其多肽序列。表5：病毒mhc同源物(ul18)和一组nkg2d配体的多肽序列。因此，在某些实施方式中，在工程化免疫细胞中表达的所述非内源性免疫抑制多肽包含或组成于seqidno.40-47的nkg2d配体或分别与seqidno.40-47共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。fp多肽的表达根据另一个实施方式，在所述同种异体免疫细胞中表达的非内源性免疫抑制多肽是fp多肽如gp41。下表6表示来自天然和人工起源的几种fp多肽。表6：来自天然和人工起源的fp多肽的氨基酸序列。因此，在某些实施方式中，在工程化免疫细胞中表达的所述非内源性免疫抑制多肽包含或组成于seqidno.48-50的fp多肽或分别与seqidno.48-50共有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。非同种异体反应性和免疫抑制性抗性t细胞基因失活与基因表达的组合本发明人在此提出了一种增加持久性和/或植入以应用于同种异体免疫细胞的方法，其中可进行一系列基因修饰。在这些之中，包括参与自体/非自体识别的至少一种失活基因和非内源性免疫抑制多肽的至少一种表达的不同组合。根据优选的实施方式，基因修饰通过与pd-l1配体和/或ctla-4免疫球蛋白和/或病毒包膜免疫抑制结构域(isu)和/或病毒fp蛋白和/或nkg2g配体病毒mhc同源物如ul18的所述同种异体免疫细胞中的表达结合的b2m和/或tcr基因的失活来进行。在本发明的范围内还包括多核苷酸、编码根据本发明的上述稀有切割核酸内切酶的载体。在本发明的范围内还包括易于通过所述用于工程化细胞的方法获得的分离的细胞或细胞系，特别是同种异体免疫细胞如t细胞，其中至少一个编码参与自体和非自体抗原识别失活的多肽的内源基因失活，并且使至少一种非内源性免疫抑制多肽与所述所有同种异体免疫细胞接触。在一个特定的方面中，本发明涉及一种工程化免疫细胞如t细胞，特别是免疫治疗的方法。在特定的实施方式中，该方法包括：i)提供同种异体细胞；ii)通过失活至少一种编码涉及自体和非自体抗原识别的多肽的内源基因来修饰所述细胞；和iii)使所述免疫细胞与至少一种非内源性免疫抑制多肽接触。在另一个特定的方面中，本发明涉及一种工程化免疫细胞如t细胞，特别是免疫治疗的方法。在特定的实施方式中，该方法包括：i)提供同种异体细胞；ii)通过失活至少一种编码涉及自体和非自体抗原识别的多肽的内源基因来修饰所述细胞；和iii)在所述免疫细胞中表达至少一种非内源性免疫抑制多肽。t细胞介导的免疫包括多个顺序步骤，其包括抗原特异性细胞的克隆选择，它们在次级淋巴组织中的激活和增殖，它们向抗原和炎症部位的转运，直接效应物功能的执行和提供帮助(通过细胞因子和膜配体)用于大量效应物免疫细胞。这些步骤中的每一个都通过平衡刺激和抑制信号来调节，其微调反应。例如，ctla-4是在某些cd4和cd8t细胞上表达的细胞表面蛋白；当在抗原呈递细胞上通过它的配体(b7-1和b7-2)接合时，t细胞激活和效应物功能被抑制。因此，本发明涉及一种工程化t细胞的方法，特别地用于免疫治疗，其包括通过使参与免疫检查点，特别是pd1和/或ctla-4中的至少一种蛋白质失活来基因修饰t细胞。在另一个实施方式中，该方法的基因修饰步骤依赖多于两种基因的失活。基因修饰优选是离体操作的。tale-核酸酶切割人tcr基因(trac和trbc)人类基因组包含两个功能性t细胞受体β链(trbc1和trbc2)。在发育α/βt淋巴细胞期间，在每个细胞中选择这两条恒定链之一，以将其剪接到tcr-β的可变区，并形成功能性全长β链。在trbc1和trbc2之间保守的序列中选择2个trbc靶标，使得相应的tale-核酸酶同时切割trbc1和trbc2二者。如wowo2013176915所教导的，虽然人类tcr基因可能在同种异体免疫细胞中被破坏，但本发明包括其中这样的失活与任何上述自体/非自体识别基因的失活以及前述至少一种非内源性免疫抑制多肽的异位表达相结合的这种失活的情况。下表7显示用于5个trac和2个trbc靶标的核苷酸序列，以及一些它们相应的左和右talen。另外的序列可在申请wo2014/184741和wo2014/184744中获悉。表7：trac和trbctale-核酸酶和人类相应基因中的tale-核酸酶靶位点的序列的描述。单链car根据本发明的一个方面，该方法包括向所述t细胞中引入包含编码针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原的嵌合抗原受体(car)的核苷酸序列的外源核酸分子的步骤。它们可根据单链或多链体系结构进行设计。在一个实施方式中，嵌合抗原受体(car)是单链car。在优选的实施方式中，所述细胞外配体结合结构域是scfv。其它与scfv结合的结构域也可用于淋巴细胞的预定义靶向，例如骆驼单结构域抗体片段或受体配体如血管内皮生长因子多肽、整合素结合肽、调节蛋白或il-13突变蛋白、抗体结合结构域、抗体高变环或cdr作为非限制性实例。根据本发明的scfv的优选实例，vh和vl链作为抗原靶序列与seqidno67(cd19抗原)、seqidno68(cd38抗原)、seqidno69(cd123抗原)、seqidno70(cs1抗原)、seqidno71(bcma抗原)、seqidno72(flt-3抗原)、seqidno73(cd33抗原)、seqidno74(cd70抗原)、seqidno75(egfr-3v抗原)和seqidno76(wt1抗原)具有超过80％的同一性、优选超过90％、且更优选超过95％。要靶向的肿瘤细胞的表面抗原的其它实例是cll1、hsp70、cd22、muc16、prame、tspan10、ror1、gd3、ct83和间皮素。根据一个实施方式，本发明涉及如上所述的方法，其中步骤c)步骤c)通过非内源性免疫抑制多肽pd-l1配体和/或ctla-4免疫球蛋白在所述同种异体免疫细胞中的表达进行，所述同种异体免疫细胞通过表达抗-cd123嵌合抗原受体被进一步修饰。根据优选的实施方式，所述抗-cd123car/pd-l1配体/ctla-4ig表达的同种异体免疫细胞在方法的步骤c)期间被进一步修饰以进行pd-1基因表达的失活。a)的所述多肽还可包含所述细胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的茎区。本文所用的术语“茎区”通常是指起作用以连接跨膜结构域与细胞外配体结合结构域的任何寡肽或多肽。特别地，茎区用于为细胞外配体结合结构域提供更多的柔性和可接近性。茎区可包含多达300个氨基酸，优选为10至100个氨基酸，且最优选为25至50个氨基酸。茎区可衍生自全部或部分天然存在的分子，例如来自cd8、cd4或cd28的全部或部分胞外区，或来自全部或部分抗体恒定区。或者，茎区可以是对应于天然存在的茎序列的合成序列，或者可以是完全合成的茎序列。所述多肽还可包含至少一个信号转导结构域。在最优选的实施方式中，所述信号转导结构域选自cd28、ox40、icos、cd137和cd8。fcεriα、β和/或γ链片段的所述c末端胞质尾区还包含tnfr相关因子2(traf2)结合基序。在最优选的实施方式中，fcεriα、β和/或γ链的所述c-末端胞质尾区由共刺激tnfr成员家族的胞浆内尾区代替。共刺激tnfr家族成员的胞质尾区含有由主要保守基序(p/s/a)x(q/e)e)或次要基序(pxqxxd)组成的traf2结合基序，其中x为任何氨基酸。响应于受体三聚，traf蛋白被募集到许多tnfr的细胞内尾区。fcεriα、β和/或γ链的所述胞质内结构域被tcrζ链(也称为cd3ζ)的胞质内结构域代替。在另一个优选的实施方式中，fcεriα、β和/或γ链的所述胞质内结构域包含至少一种另外的免疫受体酪氨酸基激活基序(itam)。itam是用作syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的各种受体的胞质内尾区中发现的完整信号基序。本发明中使用的itam的实例包括衍生自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。例如，单链car的实例由seqidno:77描述。在优选的实施方式中，如上所述的car是选自由抗-cd123单链car、抗-cs1单链car、抗-cd38单链car、抗-cll1单链car、抗-hsp70单链car、抗-egfrviii单链car、抗-bcma单链car、抗-cd33单链car、抗-flt3单链car、抗-cd70单链car、抗-wt1单链car、抗-muc16单链car、抗-prame单链car、抗-tspan10单链car、抗-ror1单链car、抗-gd3单链car、抗-ct83单链car和间皮素单链car组成的组的单链car；-在免疫细胞中表达的所述car具有选自v1、v3或v5的多肽结构之一，如图24所示。-所述结构包括：o包含来自分别选自抗-cd123mab、抗-cs1mab、抗-cd38mab、抗-cll1mab、抗-hsp70mab,抗-egfrviiimab、抗-bcmamab、抗-cd33mab、抗-flt3mab、抗-cd70mab、抗-wt1mab、抗-muc16mab、抗-pramemab、抗-tspan10mab、抗-ror1mab、抗-gd3mab、抗-ct83mab和抗-间皮素mab的单克隆抗体的vh和vl的细胞外配体结合结构域；o选自由cd8α、fceriiiγ和igg1组成的组的铰链；ocd8α跨膜结构域；o包括cd3ζ信号结构域的胞质结构域；和o4-1bb共刺激结构域。在car体系结构中选择的所有其它成分包括跨膜结构域(即，cd8αtm)、共刺激结构域(即，4-1bb)、铰链(cd8α、fceriiiγ、igg1)、胞质信号结构域(itamcd3ζ)可以是已在上述wo2015140268和wo2015121454申请中描述的那些。作为实例，vh和vl可以是针对抗-cd123在申请wo2015140268、针对抗-cs1和抗-cd38在wo2015121454中描述的那些。多链嵌合抗原受体(car)在另一个实施方式中，本发明涉及一种特别适于生产和扩增本发明的诸如t细胞的工程化免疫细胞的多链嵌合抗原受体(car)。所述多链car包括以下成分中的至少两个：a)一种多肽，其包含fc多肽，fcεriα链的跨膜结构域和细胞外配体结合结构域，b)一种多肽，其包含一部分的n-和c-末端胞质尾区和fc胞质尾fcεriβ链的跨膜结构域和/或c)两种多肽，其包含胞质内尾区的一部分和fc多肽，fcεriγ链的跨膜结构域的每一个，由此不同的多肽自发地多聚在一起以形成二聚体、三聚体或四聚体car。本发明的car也可以是如前所述的“多链car”，这意味着细胞外结合结构域和信号结构域优选位于不同的多肽链上，而共刺激结构域可位于相同或第三多肽上。通过用细胞外配体结合域如scfv替代fcεriα链的高亲和力ige结合结构域，可从fcεri(ravetch等人，1989)得到这样的多链car，而fcεriβ和/或γ链的n和/或c末端尾区被分别融合到信号转导结构域和共刺激结构域。细胞外配体结合结构域具有将t细胞特异性重定向到细胞靶标的作用，而信号转导结构域激活或降低免疫细胞应答。不同的多肽衍生自fcεriα、β和γ多肽的事实是位于近膜位置的跨膜多肽，为car提供更柔性的体系结构，提高针对靶向分子的特异性并降低免疫细胞的背景激活。更具体地，多链体系结构在wo2014039523中公开。在另一个实施方式中，如前所述在免疫细胞中表达的所述car选自由抗-cd123多链car、抗-cs1多链car、抗-cd38多链car、抗-cll1多链car或抗-hsp70多链car组成的组。在另一个优选的实施方式中，上述car是选自由抗-cd123多链car、抗-cs1多链car、抗-cd38多链car、抗-cll1多链car、抗-hsp70多链car、抗-egfrviii多链car、抗-bcma多链car、抗-cd33多链car、抗-flt3多链car、抗-cd70多链car、抗-wt1多链car、抗-muc16多链car、抗-prame多链car、抗-tspan10多链car、抗-ror1多链car、抗-gd3多链car、抗-ct83多链car和间皮素多链car组成的组的多链car。这种多链car体系结构在wo2014/039523中公开，特别是在图2至4以及第14至21页中，其通过引用并入本文。本文使用的术语“一部分”是指分子的任何子集，即较短的肽。或者，可通过编码多肽的dna中的突变来制备多肽的氨基酸序列功能变体。这种功能变体包括例如，氨基酸序列内的残基的缺失或插入或取代。也可进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有期望的活性，特别是显示特异性抗-靶细胞免疫活性。在本发明的范围内还包括多核苷酸、编码根据本发明的上述多链car的载体。在特定的实施方式中，本发明涉及制备用于免疫治疗的免疫细胞如t细胞的方法，其包括将构成所述多链car并扩增所述细胞的不同多肽导入所述t细胞中。本发明还涉及易于通过所述工程化细胞的方法获得的分离的细胞或细胞系。特别地，所述分离的细胞包含编码构成所述多链car的多肽的外源多核苷酸序列。双特异性抗体根据另一个实施方式，可用双特异性抗体进一步暴露通过如前所述的不同方法获得的工程化免疫细胞如t细胞。可将所述t细胞在给予患者之前离体暴露于双特异性抗体，或者在给予患者之后在体内暴露于双特异性抗体。所述双特异性抗体包含具有不同抗原性质的两个可变区，其允许使工程化细胞接近靶抗原。作为非限制性实例，所述双特异性抗体针对肿瘤标志物和淋巴细胞抗原如cd3，并且具有重定向并激活任何对抗肿瘤的循环t细胞的潜力。递送方法上述不同的方法包括将任选具有dna末端加工酶或外源核酸的ptα或其功能变体、稀有切割核酸内切酶、tale-核酸酶、car或多链car引入到细胞中。作为非限制性实例，可引入任选具有dna末端加工酶或外源核酸的稀有切割核酸内切酶、tale-核酸酶、编码非内源性免疫抑制多肽的基因、car或多链car作为由一种编码的转基因或作为不同的质粒载体。不同的转基因可被包括在一个载体中，其包含编码核糖体跳跃序列的核酸序列，例如编码2a肽的序列。在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒亚群中鉴定的2a肽导致从一个密码子核糖体“跳跃”到下一个密码子，而不在由密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(参见donnelly等人，j.ofgeneralvirology82:1013-1025(2001)；donnelly等人，j.ofgen.virology78:13-21(1997)；doronina等人，mol.and.cell.biology28(13):4227-4239(2008)；atkins等人，rna13:803-810(2007))。“密码子”是指由核糖体转译成一个氨基酸残基的mrna(或dna分子的有义链)上的三个核苷酸。因此，当多肽被框架中的2a寡肽序列分离时，两个多肽可由mrna内的单个邻接开放读码框架合成。这种核糖体跳跃机制是本领域公知的，并且已知被几种载体使用用于表达由单个信使rna编码的几种蛋白质。作为非限制性实例，在本发明中，已使用2a肽在细胞中表达稀有切割核酸内切酶和dna末端加工酶或多链car的不同多肽。所述质粒载体可含有选择标志物，其提供接收所述载体的细胞的鉴定和/或选择。由于将编码所述多肽的多核苷酸引入到细胞中，可在细胞中原位合成多肽。或者，所述多肽可在细胞外产生，然后被引入其中。将多核苷酸构建体引入到动物细胞中的方法是本领域已知的，并且包括作为非限制性实例的其中将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中的稳定转化方法，其中未将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中的瞬态转化方法和病毒介导的方法。可通过例如重组病毒载体(例如，逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等将所述多核苷酸引入到细胞中。例如，瞬态转化方法包括例如显微注射、电穿孔或粒子轰击。鉴于在细胞中表达，所述多核苷酸可包括在载体中，更特别地包括在质粒或病毒中。-电穿孔编码根据本发明的多肽的多核苷酸可以是直接引入到细胞中的mrna，例如通过电穿孔。本发明人确定了用于t细胞中的mrna电穿孔的最佳条件。发明人使用细胞波(cytopulse)技术，其允许通过使用脉冲电场来瞬时渗透活细胞以将材料输送到细胞中。该技术基于pulseagile(cellectis属性)电穿孔波形的使用，允许精确控制脉冲持续时间、强度以及脉冲之间的间隔(美国专利6,010,613和国际pct申请wo2004083379)。所有这些参数都可进行修改，以达到用于高转染效率的最佳条件，并且死亡率最低。基本上，第一高电场脉冲允许孔形成，而随后的较低电场脉冲允许移动多核苷酸进入细胞中。在本发明的一个方面，发明人描述了导致t细胞中的mrna达到>95％的转染效率的步骤，以及使用电穿孔方案在t细胞中瞬态表达不同种类的蛋白质。特别地，本发明涉及一种转化t细胞的方法，其包括使所述t细胞与rna接触并向t细胞应用敏捷脉冲序列，其由下述组成：(a)电压范围为2250至3000v/cm、脉冲宽度为0.1ms、且在步骤(a)和(b)的电脉冲之间的脉冲间隔为0.2至10ms的一个电脉冲；(b)电压范围为2250至3000v、脉冲宽度为100ms、且在步骤(b)的电脉冲和步骤(c)的第一电脉冲之间的脉冲间隔为100ms的一个电脉冲；和(c)电压为325v、脉冲宽度为0.2ms、且4个电脉冲中的每一个之间的脉冲间隔为2ms的4个电脉冲。转化t细胞的方法可包括使所述t细胞与rna接触并向t细胞应用敏捷脉冲序列，其由下述组成：(a)电压为2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000v/cm、脉冲宽度为0.1ms且在步骤(a)和(b)的电脉冲之间的脉冲间隔为0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ms的一个电脉冲；(b)电压范围为2250、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000v、脉冲宽度为100ms、且在步骤(b)的电脉冲和步骤(c)的第一电脉冲之间的脉冲间隔为100ms的一个电脉冲；和(c)电压为325v、脉冲宽度为0.2ms、且4个电脉冲中的每一个之间的脉冲间隔为2ms的4个电脉冲。在本申请中公开了包括在上述值范围内的任何值。电穿孔培养基可以是本领域已知的任何合适的培养基。优选地，电穿孔培养基具有在0.01至1.0毫西门子范围内的电导率。作为非限制性实例，所述rna编码稀有切割内切核糖核酸酶、稀有切割核酸内切酶的一种单体如半-tale-核酸酶、嵌合抗原受体、多链嵌合抗原受体的至少一种成分、外源核酸、一种另外的催化结构域。免疫细胞的激活和扩增无论在诸如t细胞的免疫细胞的基因修饰之前或之后，通常可使用例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中描述的方法激活和扩增免疫细胞。可在体外或体内扩增t细胞。通常，通过与在其上附着刺激cd3tcr复合物相关信号的试剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增本发明的t细胞。特别地，可在体外刺激诸如t细胞群的免疫细胞，例如通过与抗-cd3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗-cd2抗体接触或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶c激活剂(例如，苔藓抑素)接触。为了共同刺激t细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激免疫细胞增殖的条件下，可将免疫细胞群与抗-cd3抗体和抗-cd28抗体接触。刺激cd4+t细胞或cd8+t细胞、抗-cd3抗体和抗-cd28抗体的增殖。例如，提供各个信号的试剂可在溶液中或耦合到表面。如本领域普通技术人员可容易地理解的，颗粒与细胞的比例可取决于相对于靶细胞的粒度。在本发明的另外的实施方式中，将诸如t细胞的细胞与试剂包被的珠粒组合，随后分离珠粒和细胞，然后培养细胞。在替代实施方式中，在培养之前，试剂包被的珠粒和细胞不被分离但在一起培养。可通过使抗-cd3和抗-cd28附接的顺磁珠(3×28珠粒)与t细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，将细胞(例如，4至10个t细胞)和珠粒(例如，1:1的比例的m-450cd3/cd28t顺磁珠粒)在缓冲液，优选为pbs(不含二价阳离子如钙和镁)中组合。同样地，本领域普通技术人员可容易地理解，可使用任何细胞浓度。可将混合物培养几小时(约3小时)至约14天，或在其之间的任何小时整数值。在另一个实施方式中，可将混合物培养21天。适用于t细胞培养的条件包括可能含有增殖和生存力所必需的因子的合适培养基(例如，最低必需培养基或rpmi培养基1640或x-vivo5,(lonza))，包括血清(例如，胎牛或人类血清)、白细胞介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-g、1l-4、1l-7、gm-csf、-10、-2、1l-15、tgfp和tnf-或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂如n-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括rpmi1640、a1m-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo1和x-vivo20，优化剂，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量的血清(或血浆)或一组定义的激素，和/或一定量的足以使t细胞生长和扩增的细胞因子。抗生素例如青霉素和链霉素仅包括在实验培养物中，而不是在要输注到受试者的细胞的培养物中。靶细胞保持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如，37，长)和气氛(例如，空气加5％的co2)。已暴露于不同刺激时间的免疫细胞如t细胞可能表现出不同的特征。在另一个特定的实施方式中，可通过与组织或细胞共培养来扩增所述细胞。还可在体内扩增所述细胞，例如在将所述细胞施用于受试者之后在受试者的血液中扩增。工程化免疫细胞及其与宿主免疫细胞的相互作用在本发明的范围内还包括根据前述方法中的任一种获得的分离的免疫细胞。根据本发明的所述免疫细胞可衍生自造血干细胞。干细胞可是成体干细胞、胚胎干细胞，更特别为非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。根据一个实施方式，所述免疫细胞是造血细胞，且更优选为原代细胞。根据优选的实施方式，工程化同种异体免疫细胞在接触至少一种非内源性免疫抑制多肽之后，不特异性诱导t调节细胞的抑制。根据更优选的实施方式，工程化同种异体免疫细胞在接触至少一种非内源性免疫抑制多肽之后，特异性诱导cd8+t细胞的抑制。在本发明的细胞的扩增和基因修饰之前，可通过各种非限制性方法从受试者获得细胞来源。免疫细胞如t细胞可从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。可使用本领域技术人员可获得和已知的任何数量的免疫细胞系。在另一个实施方式中，所述细胞可衍生自健康供体、诊断患有癌症的患者或诊断患有感染的患者。所述细胞是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。在本发明的范围内还包括根据前述方法从转化的免疫细胞如t细胞获得的细胞系。对免疫抑制治疗有抗性且易于通过前述方法获得的修饰细胞包括在本发明的范围内。在另一个实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞包含编码参与自体和非自体抗原识别的多肽的一种失活的内源基因，例如tcr、mhc类i类组分、b-2微球蛋白(b2m)、tap1和巨大多功能蛋白酶2。此外，所述工程化同种异体免疫细胞通过表达至少一种分泌的非内源性免疫抑制多肽或通过用至少一种非内源性免疫抑制多肽孵育所述免疫细胞而与至少一种非内源性免疫抑制多肽接触。治疗应用在另一个实施方式中，如前所述通过不同方法或衍生自所述分离的细胞的细胞系获得的分离的细胞可用作药物。在另一个实施方式中，所述药物可用于治疗有需要的患者中的癌症或感染。在另一个实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞或衍生自所述分离的细胞的细胞系可用于制备用于治疗有需要的患者中的癌症或病毒感染的药物。在另一方面中，本发明依赖治疗有需要的患者的方法，所述方法包括以下步骤中的至少一个：(a)提供免疫细胞，例如可通过前述方法中的任一种获得的t细胞；(b)将所述转化的免疫细胞如t细胞给予所述患者。在一个实施方式中，本发明的所述免疫细胞如t细胞可经受强壮的体内免疫细胞如t细胞扩增，并且可持续延长的时间。所述治疗可以是改善、治愈或预防。它可能是自体免疫治疗的一部分或同种异体免疫治疗的一部分。自体意思是用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群源自所述患者或人类白细胞抗原(hla)相容的供体。同种异体意思是用于治疗患者的细胞或细胞群不是源自所述患者，而是源自供体。本发明特别适用于同种异体免疫治疗，只要它能够将通常从供体获得的免疫细胞如t细胞转化为非同种异体反应性细胞。这可在标准方案下完成，并根据需要可多次再现。可将所得的修饰的免疫细胞合并并施用于一个或几个患者，可作为“现成”治疗产品获得。可与所公开的方法一起使用的细胞在前面的部分中描述。所述治疗可用于治疗诊断患有癌症、病毒感染、自体免疫疾病或移植物抗宿主病(gvhd)的患者。可治疗的癌症包括没有血管化或尚未基本上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(例如，血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或者可包括实体瘤。用本发明的car治疗的癌症的类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。它可以是联合一种或多种抗癌疗法的治疗，所述抗癌疗法选自抗体治疗、化疗、细胞因子治疗、树突细胞治疗、基因治疗、激素治疗、激光治疗和放射治疗组中的组。根据本发明的优选实施方式，可将所述治疗施用于进行免疫抑制治疗的患者。实际上，本发明优选地依赖细胞或细胞群，其由于编码这种免疫抑制剂的受体的基因的失活而使其对至少一种免疫抑制剂具有抗性。在这方面，免疫抑制治疗应有助于在患者体内选择和扩增根据本发明的t细胞。根据本发明的细胞或细胞群的施用可以任何方便的方式进行，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。本文所述的组合物可通过静脉内或淋巴管内注射或腹膜内皮下、皮内、瘤内、结内，髓内、肌内给予患者。在一个实施方式中，优选通过静脉注射给予本发明的细胞组合物。细胞或细胞群的施用可包括施用104-109个细胞/千克体重，优选为105至106个细胞/千克体重，包括在该范围内的所有细胞数的整数值。可以一种或多种剂量施用细胞或细胞群。在另一个实施方式中，以单一剂量形式给予所述有效量的细胞。在另一个实施方式中，在一段时间内以多于一种剂量施用所述有效量的细胞。施用时间在管理医师的判断之内，并且取决于患者的临床状况。可从任何来源获得细胞或细胞群，例如血库或供者。虽然个体需要变化，但确定用于特定疾病或病况的给定细胞类型的有效量的最佳范围在本领域的技术范围内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。施用的剂量取决于受体的年龄、健康和体重，同期治疗(如有的话)的种类、治疗频率和所需效果的性质。在另一个实施方式中，肠胃外施用所述有效量的细胞或包含这些细胞的组合物。所述施用可以是静脉施用。所述施用可通过在肿瘤内注射直接进行。在本发明的某些实施方式中，可结合任何数量的相关治疗方式(例如，之前、同时或之后)将细胞施用于患者，其包括但不限于用诸如抗病毒治疗、西多福韦和白介素-2、阿糖胞苷(也称为ara-c)的治疗或针对ms患者的那他丽珠单抗(nataliziimab)治疗或针对银屑病患者的依法丽珠单抗(efaliztimab)治疗或针对pml患者的其它治疗。在另外的实施方式中，可联合化学疗法、辐射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506抗体或其它免疫烧蚀剂如campath、抗-cd3抗体或其它抗体疗法，细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228、细胞因子和辐照使用本发明的t细胞。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和fk506)或抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的p70s6激酶(liu等人，cell66:807-815,11；henderson等人，immun.73:316-321,1991；bierer等人，citrr.opin.mmn.5:763-773,93)。在另一个实施方式中，联合骨髓移植(例如，之前、同时或之后)、使用化疗剂如氟达拉滨、体外放射线治疗(xrt)、环磷酰胺或抗体如okt3或阿仑单抗(campath)的t细胞消除治疗将本发明的细胞组合物施用于患者。在另一个实施方式中，在b细胞消除治疗后施用本发明的细胞组合物，例如与cd20反应的药剂如利妥昔单抗。例如，在一个实施方式中，受试者可通过高剂量化疗，随后进行外周血干细胞移植进行标准治疗。在某些实施方式中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方式中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。通过本文所述的任何一种方法获得的所述修饰的细胞可用于本发明的特定方面，用于治疗有需要的患者的宿主抗移植物(hvg)排斥和移植物抗宿主病(gvhd)；因此在本发明的范围内的是一种治疗有需要的患者的宿主抗移植物(hvg)排斥和移植物抗宿主病(gvhd)的方法，其包括通过向所述患者施用有效量的修饰的细胞来治疗所述患者，所述修饰的细胞包含失活的tcrα和/或tcrβ基因。其它定义-多肽序列中的氨基酸残基在本文根据单字母密码指定，其中例如，q是指gln或谷氨酰胺残基，r是指arg或精氨酸残基，且d是指asp或天冬氨酸残基。-氨基酸取代是指用另一个取代一个氨基酸残基，例如用肽序列中的谷氨酰胺残基代替精氨酸残基是氨基酸取代。-核苷酸指定如下：单字母密码用于指定核苷的碱基：a是腺嘌呤、t是胸腺嘧啶、c是胞嘧啶，且g是鸟嘌呤。对于变性的核苷酸，r表示g或a(嘌呤核苷酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d表示g、a或t，v表示g、a或c，b表示g、t或c，h表示a、t或c，且n表示g、a、t或c。-“如本文所用，“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸和/或多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)、寡核苷酸、通过聚合酶链反应(pcr)产生的片段，以及由连接、裂解、核酸内切酶作用和外切核酸酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸的单体(例如，dna和rna)或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合组成。修饰的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖改性包括例如，用卤素、烷基、胺和叠氮基取代一个或多个羟基，或糖可被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可用空间和电子相似的结构代替，例如氮杂-糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶或其它众所周知的杂环取代基。核酸单体可通过磷酸二酯键或这种键的类似物连接。核酸可以是单链或双链的。-“dna靶标”、“dna靶序列”、“靶标dna序列”、“核酸靶序列”、“靶序列”或“加工位点”是指可通过根据本发明的稀有切割核酸内切酶靶向和加工的多核苷酸序列。这些术语是指特定的dna位置，优选为细胞中的基因组位置，而且还是指可独立存在于遗传物质的主体如质粒、游动基因、病毒、转座子或细胞器如线粒体中的一部分遗传物质作为非限制性实例。作为tale-核酸酶靶标的非限制性实例，靶向基因组序列通常由15-bp间隔物分开的两个17-bp长的序列(称为半靶标)组成。通过在作为非限制性实例的表2、7和11中列出的在ef1-α启动子或t7启动子的控制下，通过质粒编码的tale-核酸酶的重复序列识别各个半靶标。核酸靶序列由所述靶标的一条链的5’至3’序列定义，如表2和7所示。-嵌合抗原受体(car)是指结合对抗存在于靶细胞上的组分的结合结构域的分子，例如对具有t细胞受体激活细胞内结构域的所需抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性以产生展现特异性抗-靶细胞免疫活性的嵌合蛋白。通常，car由与t细胞抗原受体复合物ζ链(scfvfc:ζ)的细胞内信号转导结构域融合的细胞外单链抗体(scfvfc)组成，并且当在t细胞中表达时具有基于单克隆抗体的特异性重定向抗原识别的能力。本发明中使用的car的一个实例是针对cd19抗原的car，并且可包括氨基酸序列作为非限制性实例：seqidno:6-“递送载体”或“多种递送载体”是指可用于本发明中以使细胞接触(即“接触”)或递送到细胞内或亚细胞区室(即“引入”)药剂/化学物质的任何递送载体以及本发明所需的分子(蛋白质或核酸)。它包括但不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物递送载体、化学载体、聚合物载体、脂质复合物、多聚复合物、树状聚合物、微泡(超声造影剂)、纳米颗粒、乳剂或其它合适的转移载体。这些递送载体允许递送分子、化学物质、大分子(基因、蛋白质)或其它载体如质粒、由diatos开发的肽。在这些情况下，递送载体是分子载体。“递送载体”或“多种递送载体”也意指用于进行转染的递送方法。-术语“载体”或“多个载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。本发明中的“载体”包括但不限于可由染色体、非染色体、半合成或合成的核酸组成的病毒载体、质粒、rna载体或线性或环状dna或rna分子。优选的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达与它们连接的核酸的(表达载体)。大量合适的载体是本领域技术人员已知的并且可商购。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、负链rna病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台病毒)、正链rna病毒如小核糖核酸病毒和甲病毒，以及双链dna病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、艾普斯登-巴尔病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、禽痘和金丝雀痘)。其它病毒包括例如，诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝dna病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤、哺乳动物c型、b型病毒、d型病毒、htlv-blv组、慢病毒、泡沫病毒(coffin,j.m.,逆转录病毒：病毒及其复制(retroviridae:thevirusesandtheirreplication),infundamentalvirology,第三版,b.n.fields,等人编辑,lippincott-ravenpublishers,philadelphia,1996)。-“慢病毒载体”是指基于hiv的慢病毒载体，因为它们具有相对较大的包装能力，降低的免疫原性及其以高效率稳定地转导大范围不同细胞类型的能力，因此其对于基因递送是非常有前景的。通常在将三种(包装、包膜和转移)或更多质粒瞬态转染入生产细胞后产生慢病毒载体。与hiv一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体的相互作用进入靶细胞。进入时，病毒rna经历逆转录，其由病毒逆转录酶复合物介导。逆转录产物是双链线性病毒dna，其是用于感染细胞的dna中的病毒整合的底物。“综合慢病毒载体(或lv)”是指能够整合靶细胞基因组的作为非限制性实例的载体。相反，“非综合慢病毒载体(或nilv)”是指不能通过病毒整合酶的作用整合靶细胞的基因组的有效的基因递送载体。-递送载体和载体可与任何细胞透化技术(例如，声致穿孔或电穿孔或这些技术的衍生物)相关联或组合。-细胞或多个细胞是指衍生自这些生物体的任何真核活细胞、原代细胞和细胞系用于体外培养。-“原代细胞”或“多个原代细胞”是指从活组织(即，活组织检查材料)直接取出并建立用于体外生长的细胞，其经历非常少的群体倍增值，因此与连续致瘤或人工永生化细胞系相比，从其衍生自的组织的主要功能成分和特征更具代表性。作为非限制性实例，细胞系可选自由以下各项组成的组中：cho-k1细胞；hek293细胞；caco2细胞；u2-os细胞；nih3t3细胞；nso细胞；sp2细胞；cho-s细胞；dg44细胞；k-562细胞、u-937细胞；mrc5细胞；imr90细胞；jurkat细胞；hepg2细胞；hela细胞；ht-1080细胞；hct-116细胞；hu-h7细胞；huvec细胞；molt4细胞。所有这些细胞系可通过本发明的方法进行修饰以提供细胞系模型从而产生、表达、定量、检测、研究感兴趣的基因或蛋白质；作为非限制性实例，这些模型也可用于筛选研究和生产以及诸如化学、生物燃料、治疗和农学的各个领域中的感兴趣的生物活性分子。-“突变”是指替代、删除、插入多达一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、二十个、二十五个、三十个、四十个、五十个或更多个多核苷酸(cdna、基因)或多肽序列中的核苷酸/氨基酸。突变可影响基因或其调控序列的编码序列。它也可能影响基因组序列的结构或编码的mrna的结构/稳定性。-“一个或多个变体”是指重复变体、变体、dna结合变体、tale-核酸酶变体、通过在母体分子的氨基酸序列中突变或替换至少一个残基获得的多肽变体。-“功能性变体”是指蛋白质或蛋白质结构域的催化活性突变体；与其亲本蛋白质或蛋白质结构域或另外的性质相比，这种突变体可具有相同的活性，或更高或更低的活性。-“基因”是指遗传的基本单位，由编码特定蛋白质或蛋白质片段的沿染色体以线性方式排列的dna片段组成。基因通常包括启动子、5’非翻译区、一个或多个编码序列(外显子)、任选的内含子、3’非翻译区。基因还可包含终止子、增强子和/或沉默子。-如本文所用，术语“基因座”是染色体上的dna序列(例如，基因)的具体物理位置。术语“基因座”可以是指染色体上的稀有切割核酸内切酶靶序列的具体物理位置。这种基因座可包含被根据本发明的稀有切割核酸内切酶识别和/或切割的靶序列。应当理解，本发明的感兴趣的基因座不仅可限定存在于细胞的遗传物质(即，染色体)的主体中的核酸序列，而且可限定可独立于所述遗传物质的主体存在的遗传物质的一部分如质粒、游离基因、病毒、转座子或细胞器如线粒体的主体作为非限制性实例。-术语“核酸内切酶”是指能够催化dna或rna分子，优选为dna分子中的核酸之间的键的水解(切割)的任何野生型或变体酶。不考虑它的序列，核酸内切酶不切割dna或rna分子，但在特定的多核苷酸序列，进一步称为“靶序列”或“靶位点”处识别和切割dna或rna分子。当通常具有大于12个碱基对(bp)长度，更优选为14-55bp的多核苷酸识别位点时，核酸内切酶可被分类为稀有切割核酸内切酶。稀有切割核酸内切酶通过在定义的基因座处诱导dna双链断裂(dsb)而显著增加hr(rouet,smihetal.1994；choulika,perrinetal.1995；pingoudandsilva2007)。稀有切割核酸内切酶可例如是归巢核酸内切酶(paquesandduchateau2007)，由工程化锌指结构域与限制酶的催化结构域融合产生的嵌合锌指核酸酶(zfn)，例如foki(porteusandcarroll2005)或化学核酸内切酶(eisenschmidt,lanioetal.2005；arimondo,thomasetal.2006)。在化学核酸内切酶中，化学或肽切割器与核酸的聚合物或识别特定靶序列的另一dna缀合，从而将切割活性靶向特定序列。化学核酸内切酶还包括合成核酸酶，例如邻二氮菲的缀合物、dna切割分子和已知结合特异性dna序列的三链体形成寡核苷酸(tfo)(kalishandglazer2005)。这种化学核酸内切酶包括在根据本发明的术语“核酸内切酶”中。稀有切割核酸内切酶也可以是例如，tale-核酸酶，使用foki催化结构域的新一类嵌合核酸酶和衍生自类转录激活因子效应物(tale)的dna结合结构域，这是用于通过黄单胞菌属(xanthomonasgenus)的植物病原体的感染过程的蛋白质家族(boch,scholzeetal.2009；moscouandbogdanove2009；christian,cermaketal.2010；li,huangetal.)。基于foki的tale-核酸酶(tale-核酸酶)的功能布局基本上是zfn的功能布局，其中锌指dna结合结构域被tale结构域代替。因此，通过tale-核酸酶的dna切割需要在非特异性中心区域侧翼的两个dna识别区。包含在本发明中的稀有切割核酸内切酶也可衍生自tale-核酸酶。稀有切割核酸内切酶可以是归巢核酸内切酶，也称为大范围核酸酶。这种归巢核酸内切酶是本领域公知的(stoddard2005)。归巢核酸内切酶识别dna靶序列并产生单链或双链断裂。归巢核酸内切酶是高度特异性的，识别长度为12至45个碱基对(bp)的dna靶位点，通常长度为14至40bp。根据本发明的归巢核酸内切酶可例如对应于laglidadg核酸内切酶，对应于hnh核酸内切酶，或对应于giy-yig核酸内切酶。根据本发明的优选归巢核酸内切酶可以是i-crei变体。-“tale-核酸酶”旨在是由通常衍生自类转录激活因子效应物(tale)的核酸结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成的融合蛋白，以切割核酸靶序列。催化结构域优选为核酸酶结构域，且更优选为具有核酸内切酶活性的结构域，例如i-tevi、cole7、nuca和fok-i。在特定的实施方式中，可将tale结构域与例如i-crei和i-onui或其功能变体的大范围核酸酶融合。在更优选的实施方式中，所述核酸酶是单体tale-核酸酶。单体tale-核酸酶是为了特异性识别和切割不需要二聚化的tale-核酸酶，例如wo2012138927中描述的具有i-tevi催化结构域的工程化tal重复序列的融合。类转录激活因子效应物(tale)是来自细菌种黄单胞菌属(xanthomonas)的蛋白质，其包括多个重复序列，每个重复序列包含对核酸靶序列的每个核苷酸碱基特异的位置12和13(rvd)的二残基。具有相似的模块化碱基-每-碱基核酸结合性质(mbbbd)的结合结构域也可衍生自由申请人在不同细菌种中最近发现的新模块化蛋白质。新的模块化蛋白质具有比tal重复序列显示更多序列变异性的优点。优选地，与不同核苷酸的识别相关的rvd是用于识别c的ng、用于识别t的ng、用于识别a的ni、用于识别g或a的nn、用于识别a、c、g或t的ns、用于识别t的hg、用于识别t的ig、用于识别g的nk、用于识别c的ha、用于识别c的nd、用于识别c的hi、用于识别g的hn、用于识别g的na、用于识别g或a的sn和用于识别t的yg、用于识别a的tl、用于识别a或g的vt和用于识别a的sw。在另一个实施方式中，关键氨基酸12和13可以突变为其它氨基酸残基，以调节它们对核苷酸a、t、c和g的特异性，且特别是增强这种特异性。tale-核酸酶已进行描述并且用于刺激基因靶向和基因修饰(boch,scholzeetal.2009；moscouandbogdanove2009；christian,cermaketal.2010；li,huangetal.)。工程化的tal-核酸酶可以商品名talentm(cellectis,8ruedelacroixjarry,75013paris,france)商购。-术语“切割”是指多核苷酸的共价骨架的断裂。切割可通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的，并且由于两个不同的单链切割事件可能发生双链切割。双链dna、rna或dna/rna混合切割可导致平端或交错端的产生。-“融合蛋白”是指本领域公知的方法的结果，该方法包括两个或多个最初编码单独的蛋白质或它们的一部分的基因的连接，所述“融合基因”的转译导致衍生自每种原始蛋白质的功能性质的单一多肽。-“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。同一性可通过比较每个序列中的位置来确定，为了比较的目的可将其比对。当比较序列中的位置被相同的碱基占据时，那么该位置处的分子是相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列共有的位置上的相同或匹配核苷酸数量的函数。可使用各种比对算法和/或程序来计算两个序列之间的同一性，包括可作为gcg序列分析包的一部分使用的fasta或blast(威斯康星州大学(universityofwisconsin),madison,wis.)，并且可与例如，默认设置一起使用。例如，考虑了与本文所述的特异性多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性并且优选显示基本上相同功能的多肽，以及编码这种多肽的多核苷酸。-“相似性”描述了两种或多种多肽的氨基酸序列之间的关系。还可使用相似性基质如blosum45、blosum62或blosum80将blastp用于鉴定与参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％的序列相似性的氨基酸序列。除非另有说明，相似性得分将基于blosum62的使用。当使用blastp时，百分比相似性基于blastp正得分，且百分比序列同一性基于blastp同一性得分。blastp“同一性”显示总残基在相同的高得分序列对中的数量和分数；并且blastp“正”显示残基的数量和分数，对于其对比得分具有正值并且其彼此相似。本公开预期和包括具有这些同一性或相似性程度的氨基酸序列或本文公开的氨基酸序列的相似性的任何中等同一性程度。使用遗传密码推导出类似多肽的多核苷酸序列，并且可通过常规方法获得。-“信号转导结构域”或“共刺激配体”是指特异性结合t细胞上的同源共刺激分子的抗原呈递细胞上的分子，从而提供一种信号，除了由例如tcr/cd3复合物与载有肽的mhc分子的结合提供的原始信号之外，其介导t细胞应答，包括但不限于增殖激活、分化等。共刺激配体可包括但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、可诱导的共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、m1cb、hvem、淋巴毒素β受体、3/tr6、ilt3、ilt4、结合toll配体受体的激动剂或抗体以及与b7-h3特异性结合的配体。共刺激配体还特别地包括与t细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，例如但不限于cd27、cd28、4-ibb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、ltght、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性结合的配体。“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合的t细胞上的同源结合配偶体，从而介导通过细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于mhci类分子、btla和toll配体受体。本文所用，“共刺激信号”是指与原始信号如tcr/cd3连接相结合的信号，其导致关键分子的t细胞增殖和/或上调或下调。-如本文所用，术语“细胞外配体结合结构域”被定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，该结构域能够与细胞表面分子相互作用。例如，可选择细胞外配体结合结构域以识别用作与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。因此，可用作配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自体免疫疾病和癌细胞相关的那些。如本文所用，术语“受试者”或“患者”包括动物界的所有成员，包括非人类灵长类和人类。本发明的上述书面描述提供了制造和使用它的方式和方法，使得本领域的技术人员能够制造和使用它们，特别是为了所附权利要求书的主题而提供该可实施性，其构成原始描述的一部分。在本文列出数字限制或范围的情况下，包括端点。此外，数值限制或范围内的所有值和子范围都被具体地包括，如同明确地写出一样。提供上述描述以使本领域技术人员能够制造和使用本发明，并且在特定应用及其要求的背景下提供。优选实施方式的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本文定义的一般原理可应用于其它实施方式和应用。因此，本发明不旨在限于所示的实施方式，而是被给予与本文公开的原理和特征一致的最宽范围。一般地已描述了本发明，可通过参考某些具体实施例获得进一步的理解，在本文提供这些具体实施例仅为了说明的目的，除非另有说明，否则不旨在限制。实施例本发明人提出探索三种不同的策略，以通过hvg预防同种异体cart细胞耗竭(图9)。如实施例1所述，第一种包括在cart细胞的表面处表达pd-l1。这种抗原的存在可能通过pd1/pd-l1抑制途径抑制宿主t细胞，因此降低了它们对cart细胞的细胞溶解活性(图10a)。没有这种诱饵系统并且在一定时间长度之后，预期宿主t细胞会攻击和排除同种异体cart细胞(图10b)。第二个策略包括工程化的cart细胞，使它们排出ctla4ig，由融合igg恒定区的ctla4蛋白质构成的嵌合体构建体。ctla4ig在细胞外介质中的释放可能与抗原呈递细胞(apc)表面处暴露的cd86/cd80结合，并阻止它们通过cd28/cd80或cd28/cd86相互作用激活宿主t细胞。涉及宿主apc和宿主t细胞相互作用/激活的hvg反应显示在图11a中，并且通过排泄ctla4ig的cart细胞排斥的预防显示在图11b中。包括组合上述两种策略的第三种策略也可用于预防hvg反应，并允许cart细胞在同种异体细胞过继转移的设置中增殖。在以下实施例3至7中，为了延长它们的存活并提高它们的治疗活性，本发明人描述了通过使用特异性talen使b2m基因失活来工程化同种异体t细胞来预防nk细胞介导的治疗性同种异体t细胞排斥的方法，与：i)由ul18和β2-m(b2m-ul18)组成的嵌合单链分子的表达或ii)nkg2d配体的分泌结合。特殊性在于将在肿瘤细胞或病毒感染的细胞中正常发生的机制应用于原代t细胞。因此，作用机制是潜在不同的：在肿瘤细胞中，排除的nkg2d配体导致它们在表面上的存在减少，而在工程化细胞中，分泌的nkg2d配体将用作潜在地仍存在于t细胞表面的几种其它nkg2d配体的诱饵。在以下实施例8至11中，提供了一种方法，其中同种异体cart细胞被工程化以从病毒蛋白(isu或fp作为膜结合或分泌肽)表达免疫抑制多肽，其允许抑制患者t细胞，因此允许输注到患者中的同种异体cart细胞的有效持久性。一般方法原代t细胞培养使用ficoll梯度密度培养基从efs(etablissementdusang,paris,france)提供的血沉棕黄层样品中纯化t细胞。回收pbmc层，并使用市售的t细胞富集试剂盒纯化t细胞。在补充有20ng/ml的人il-2、5％的人和dynabeads人t激活物cd3/cd28的x-vivotm-15培养基(lonza)中以珠粒:细胞比1:1激活纯化的t细胞(lifetechnologies)。sccarmrna转染在t细胞纯化和激活后，在第4天或第11天进行转染。用15μg的编码不同sccar构建体的mrna转染5百万个细胞。使用细胞波技术进行的t7mrna聚合酶转染产生sccarmrna，通过在最终体积为200μl的“细胞穿孔缓冲液t”(btxharvardapparatus)中，以3000v/cm施加两个0.1ms脉冲，随后在0.4cm缺口比色皿中以325v/cm施加四个0.2ms脉冲。在x-vivotm-15培养基中立即稀释细胞，并在37℃下用5％co2孵育。电穿孔后2h，以20ng/ml加入il-2。细胞毒性测定在96孔板(100,000个细胞/孔)中，将t细胞连同在同一孔中的10,000个靶细胞(表达cd123)和10,000个对照(cd123neg)细胞一起孵育。在用cd123car+t细胞共培养它们之前，用荧光细胞内染料(cfse或细胞痕量紫)标记靶细胞和对照细胞。在37靶细下用5％co2将共培养物孵育4小时。在该孵育期后，用可固定的生存力染料标记细胞，并通过流式细胞术进行分析。确定每个细胞群(靶细胞或cd123对照细胞)的生存力，并计算特异性细胞裂解的百分比。在mrna转染后48小时进行细胞毒性测定。t-细胞转导用t细胞纯化/激活后3天，进行用重组慢病毒载体转导t细胞表达sccar。使用重组蛋白进行t细胞表面处的sccar检测，该重组蛋白由人cd123蛋白的细胞外结构域的融合连同鼠igg1fc片段组成。用靶向蛋白质的小鼠fc部分的荧光染料缀合的二抗检测该蛋白与sccar分子的结合，并通过流式细胞术分析。实施例1.在原代t细胞和cart细胞表面处转基因表达pd-l1在这些实验中，证实了用编码载体的pd-l1(mrna或慢病毒)转染或转导的人激活t细胞表达细胞表面处的可检测水平的pd-l1。pd-l1的表达本实施例描述了在t细胞或cart细胞表面处的pd-l1的表达以及这种表达对它们对肿瘤细胞的细胞溶解活性的影响。为了在原代t细胞表面处表达pd-l1，首先从含有抗-cd19car工具(pcls23856，seqidno77)的慢病毒颗粒激活转导的血沉棕黄层样品中纯化原代t细胞，并根据galettor等人(2014)moleculartherapy-methods&clinicaldevelopment1,货号：14021doi:10.1038/mtm.2014.2描述的步骤转染。简单地说，关于转导，通过dynabeads人t激活剂cd3/cd28激活2天后，使用含有抗-cd19car工具的慢病毒颗粒以5moi孵育t细胞。mrna的转染关于转染，在它们的激活5天后，用20用，的编码pd-l1(pcls27069，seqidno18)的mrna转染500万的cart细胞或t细胞。使用agilpulse技术进行转染，通过在最终体积为200转染的细胞穿孔缓冲液t(btxharvardapparatus,holliston,massachusetts)中，以3,000v/cm施加两个0.1ms脉冲，随后在0.4cm缺口比色皿中以325v/cm施加四个0.2ms脉冲。然后在补充有20ng/ml的il-2(终浓度)和5％人血清ab的x-vivo-15培养基中立即稀释细胞。最终以1×106/ml稀释转染的t细胞，并在5％co2和20ng/mlil-2(终浓度)以及5％人ab血清的存在下保持在37℃下的培养基中，用于进一步表征。转染一天后，回收cart细胞以表征在它们的细胞表面处的pd-l1的表达，并确定这种表达对通过它们的抗cd19工具car靶向的相关肿瘤细胞的特异性细胞溶解活性的影响。我们的研究结果表明，在用编码pd-l1(>90％的细胞表达pd-l1，图12)的mrna转染的cart细胞中表达pd-l1，而在模拟转染的t细胞或cart细胞中没有检测到表达。用未转导的t细胞获得相似的结果，表明pd-l1在cart细胞和t细胞上成功表达(图12)。用慢病毒载体(lv)转染制备含有pd-l1cdna的lv载体。首先从血沉棕黄层样品中纯化原代t细胞，激活，用含有pd-l1的慢病毒颗粒(seqidno.18的pcls27062)以moi为5转导任何一个。转导3天后，回收转导的t细胞，以表征它们的细胞表面处的pd-l1的表达。结果表明，在用单独的编码pd-l1(>70％的细胞表达pd-l1，结果未示出)的lv载体转导的t细胞中表达pd-l1，而在未转导的t细胞中未检测到表达。特异性细胞裂解关于cart细胞对相关肿瘤细胞(daudi)的特异性细胞裂解活性，使用zhao,y.等人，(2010)cancerres70,9053-9061中描述的基于流式的测定法测定，我们的结果表明，pd-l1在cart细胞表面处的再表达并不显著影响它们的活性(图13)。该结果可用来自不同献血者的工程化cart细胞再现(图13，参见用模拟cart细胞b和pd-l1cart细胞b获得的结果)。实施例2.由原代t细胞和cart细胞转基因表达和排泄阿巴西普和贝拉西普(ctla4ig)mrna和用慢病毒载体(lv)的转染阿巴西普和贝拉西普(分别以orencia和nulojix市售)是由融合到ctla-4的细胞外结构域的免疫球蛋白igg1的fc区组成的融合蛋白。该实施例描述了在培养基中通过原代t细胞以moi为5的ctla4aig和ctla4big(分别为阿巴西普，或贝拉西普pcls27068seqidno3和pcls27066，seqidno4)和通过含有ctla4ig(seqidno.16的pcls27064)的lv的表达和排泄。阿巴西普描述于morelandl等人；(2006)naturereviewsdrugdiscovery5,185-186。贝拉西普由larsencp等人，(2005)“lea29y(贝拉西普)的合理开发，ctla4-ig的高亲和力变体具有强大的免疫抑制特性(rationaldevelopmentoflea29y(belatacept),ahigh-affinityvariantofctla4-igwithpotentimmunosuppressiveproperties)”amjtransplant.5(3):443-53描述。ctla4a/big表达为了通过原代t细胞表达ctla4ig，首先从血沉棕黄层样品中纯化原代t细胞，由含有抗-cd19car工具(pcls23856，seqidno77)的慢病毒颗粒激活转导，并按照实施例1所述的步骤转染。关于转染，在它们激活5天后，分别用20分别编码ctla4a或big(分别为阿巴西普或贝拉西普pcls27068seqidno:16和pcls27066，seqidno:17)的mrna转染5百万的cart细胞或t细胞并根据实施例1中所述的方案进行培养。转染一天后，回收cart细胞以表征它们通过elisa在培养基中排泄ctla4ig的能力，并确定这种表达/排泄对它们针对靶向的相关和非相关肿瘤细胞(分别为daudi和k562)的特异性细胞溶解活性的影响。我们的结果表明，通过编码ctla4a或big的mrna转染原代t细胞导致培养基中相应融合蛋白的出现。在我们的实验条件下，培养基中ctla4ig的量与分别以最大值为2.1和3.1pg/ml的ctla4aig和ctla4big转染的mrna的量近似成正比。如预期的，模拟转染的t细胞的培养基不含任何可检测的ctla4ig蛋白。这些结果表明ctla4aig和ctla4big被原代t细胞成功表达，并在培养基中排泄。特异性细胞溶解活性为了研究ctla4ig对cart细胞活性的影响，使用实施例1中描述的基于流程的测定法测定它们对相关和非相关肿瘤细胞系的细胞溶解活性。我们的研究结果表明，模拟转染的cart细胞和ctla4igcart细胞对daudi细胞显示出显著的细胞溶解活性。总的看来，这些结果表明原代t细胞成功表达并排泄ctla4ig，同时保留了它们的抗肿瘤活性。实施例3.由原代t细胞转基因表达和排泄ctla4ig和ctla4ig/pd-l1配体在本实验中，如前所述用编码pd-l1和ctla4ig的lv载体共转导t细胞。图17显示了用单独的编码ctla4ig的lv载体(平均值＝250pg/用编)转导的t细胞分泌的上清液中或者在用编码pd-l1和ctla4ig的lv载体(平均值＝270pg/者在)共转导的t细胞中的ctla4ig的水平，而在pd-l1转导的t细胞中没有检测到表达。结果表明，pd-l1在用单独的编码pd-l1的lv载体(>70％的细胞表达pd-l1，图17)转导的t细胞中或在用编码pd-l1和ctla4ig的lv载体共转导的t细胞中表达(59％)，而在未转导的t细胞中或ctla4ig转导的t细胞中无法检测到表达。实施例4：混合反应测定(mlr)测试同种异体t细胞反应实验的基本原理和方案为了检测由cart细胞过表达的pd-l1和/或ctla4ig是否对宿主免疫系统具有影响，建立了体外测试，其中将来自供体1的初始pbmc与来自hla-错配的供体2的t细胞共培养。简言之，用cfse标记pbmc(供体1)并与未标记的丝裂霉素处理或照射的工程化t细胞(供体2)混合，是指它们不能增殖。在6天的时间后，使用以下门控策略进行流式细胞术分析：fsc/ssc->活细胞->cd3+(来自供体1pbmc的t细胞)->cfse由于存在hla错配的供体2的t细胞，cfse染色的减少指示细胞分裂和供体1的t细胞的同种异体反应。图18中从左到右设置了一系列实验：-(a)单独培养没有任何处理的来自供体1的pbmc，-(b)单独培养已经以增加浓度的pha(植物血球凝集素)处理的来自供体1的pbmc，一种t细胞丝裂原；-(c)将来自供体1的pbmc与来自供体2的未转导的t细胞共培养；-(d)将来自供体1的pbmc与来自供体2的pd-l1转导的t细胞共培养；-(e)将来自供体1的pbmc与来自供体2的ctla4ig转导的t细胞共培养；-(f)将来自供体1的pbmc与来自供体2的pd-l1和ctla4ig共转导的t细胞共培养。结果从图18可以看出，当不共培养(a)或在自体t细胞存在(c)时，cd3+t细胞似乎不增殖。作为对照(b)，如预期的，来自供体1的pbmc，cfse阳性人群随着pha浓度增加而降低。cd3+t细胞在同种异体t细胞(c)的存在下增殖(cfse阳性人群的消失)。当同种异体t细胞被工程化以表达pd-l1(d)、ctla4ig(e)或两者(f)时，观察到应答t细胞保持明亮的cfse染色，得出结论：通过工程化t细胞表达pd-l1和/或ctla4ig抑制应答增殖。因此，图18得到的结果表明，在体外混合淋巴细胞反应(mlr)测定中，表达pd-l1、ctla4ig或两者的工程化t细胞较不易刺激同种异体t细胞应答。此外，结果显示当表达pd-l1、ctla4ig两者时的累积效应。实施例5：细胞毒性检测测试表达pd-l1和/或ctla4ig的抗-cd123cart细胞的杀死molm13靶细胞的能力该实验旨在通过car分子的表达来测试表达pd-l1和/或ctla4ig的t细胞的杀死特异性靶细胞的能力。用pd-l1lv、ctla4ig或两者转导的t细胞已经用20经用的编码抗-cd123car(seqidno.69)的mrna转染。在2天时间后，使用作为特异性靶细胞的molm13细胞系进行细胞毒性测定。来自细胞毒性测定的结果，图19和图20显示，表达pd-l1、ctla4ig或两者的工程化t细胞，并且进一步工程化以表达cd123car分子，维持它们杀死特异性靶标的能力。此外，这些数据表明pd-l1、ctla4ig或两者的表达增加它们的内在细胞溶解活性。实施例6：体内实验这些实验的目的是验证修饰的t细胞仍能够在体内消除同源肿瘤细胞。因此，已经进行体内实验来研究pd-l1、ctla4ig或两者的表达是否影响cart细胞抗肿瘤活性。方案概要如图21所示。获得用于以下处理组的激活t细胞：-未转导的t细胞；-使用cd123car慢病毒(lv)转导的t细胞；-使用cd123carlv和pd-l1lv转导的t细胞；-使用cd123carlv、ctla4iglv转导的t细胞；-使用cd123carlv、pd-l1lv和ctla4iglv转导的t细胞。转染2天后，在g-rex中扩增t细胞进行体内实验。19天后，回收细胞并计数。图22显示与carcd123工程化t细胞相比，表达pd-l1、ctla4ig或两者的工程化t细胞，并进一步工程化以表达cd123car分子，维持相似的增殖能力。将由此获得的t细胞注射到nog小鼠中进行体内实验。抗-肿瘤小鼠模型将免疫缺陷nog小鼠静脉内(iv)注射(cd123表达_molm13-萤光素酶细胞作为aml异种移植小鼠模型。然后，将小鼠静脉内注射(在注射肿瘤细胞系2或7天后)不同剂量的待测试的cd123car+t细胞，或使用未使用cd123car慢病毒载体转导的t细胞。在t细胞注射当天(d0)，在t细胞注射后d7和d14测定生物发光信号，以跟踪不同动物上的肿瘤进展。来自图23a和图23b的生物发光分析结果表明，与对照组相比，注射有工程化cart细胞的所有组的小鼠有效地根除肿瘤，以及工程化cart细胞在体内的明显抗体活性。实施例7使用特异性b2mtalen的有效的b2m基因敲除。已产生了靶向b2m基因的第一个编码外显子(基因库登录号nc_000015)中的序列(seqidn°1)的特异性talen(左dna结合结构域rvd：具有seqidno:2的nn-nn-hd-hd-ng-ng-ni-nn-hd-ng-nn-ng-nn-hd-ng-ng，和右dna结合结构域rvd：具有seqidno:3的ni-nn-hd-hd-ng-hd-hd-ni-nn-nn-hd-hd-ni-nn-ni-ng)。为了测试该b2m特异性talen在b2m基因座上促进易出错nhej事件的能力，根据制造商方案，使用脉冲敏捷技术在原代t细胞中电穿孔2或10μg的编码talen的mrna。转染三天后，回收细胞，并用与藻红蛋白的荧光染料偶联的特异性β2-微球蛋白抗体标记。然后，通过流式细胞术分析细胞的活力和β2-m表达。结果如图16所示。在顶板上，接近100％的未转染的t细胞表达β2-m(右上图)。使用特异性b2mtalen转染t细胞显著降低2-m表达，因为当分别用2μg或10μg的talenmrna转染时，38％(右中图)和80％的t细胞(右下图)变为β2-m阴性。这些数据表明，可以高效率实现t细胞中的b2m敲除。实施例8：t细胞中的单链分子b2m-ul18的生产和表达。hcmvul18编码i型跨膜糖蛋白，其与β2-m缔合并结合内源性肽的mhci类分子共有高水平的aa序列同一性。由于我们的目标是在其中使b2m基因无效的t细胞中表达该分子，因此我们的策略是产生嵌合分子，其中β2-m和ul18被融合为单链多肽。seqidn°39显示了嵌合蛋白的氨基酸序列。含有嵌合b2m-ul18的慢病毒颗粒被转导入t细胞中。通过使用β2-m抗体的facs分析来监测转基因的表达。来自该实验的结果旨在表明b2m-ul18嵌合蛋白在t细胞中有效表达。实施例9：t细胞中的nkg2d配体的产生和表达nkg2d天然配体是跨膜蛋白或gpi锚定蛋白。为了实现通过t细胞分泌这些分子，nkg2d配体的细胞外结构域已在它们的n末端融合成分泌肽形式。分泌的嵌合nkg2d配体的氨基酸序列如下所示(seqidno:40至seqidno:47)。含有嵌合nkg2d配体的慢病毒颗粒被转导入t细胞中。通过使用特异性抗体的蛋白质印迹分析来监测培养上清液中的转基因表达。来自该实验的结果旨在显示嵌合nkg2d配体蛋白在t细胞中有效表达。实施例10：β2-m例有缺陷型cart细胞不被同种异体t细胞识别将来自健康供体a的pbmc与来自供体b的经辐照或丝裂霉素处理的工程化的β2-m缺陷型t细胞共培养。作为对照，将来自健康供体a的pbmc与来自供体b的经辐照或丝裂霉素处理的工程化的β2-m阳性t细胞共培养。7天后，通过xtt比色测定或cfse稀释法(facs分析)测量来自供体a的细胞增殖。虽然在对照中观察到细胞增殖，但当工程化t细胞不表达β2-m时，没有观察到细胞增殖或观察到有限的细胞增殖。来自该实验的结果旨在表明同种异体反应t细胞不能识别和增殖抗β2-m缺陷型t细胞。实施例11：高效抑制nk介导的t细胞裂解从健康供体apbmc中纯化nk细胞。作为靶标，在下面制备和列出来自健康供体b的工程化t细胞。a)工程化t细胞(阴性对照)、b)β2-m缺陷型工程化t细胞(阳性对照)、c)表达b2m-ul18的β2-m缺陷型工程化t细胞(seqidn°39)、d-k)分别表达sp-micaed(seqidn°40)、sp-micbed(seqidn°41)、sp-ulbp1ed(seqidn°42)、sp-ulbp2ed(seqidn°43)、sp-ulbp3ed(seqidn°44)、sp-n2dl4ed(seqidn°45)、sp-ret1ged(seqidn°46)、sp-raetiled(seqidn°47)的β2-m缺陷型工程化t细胞。通过cfse标记测定法测定由nk细胞介导的细胞毒性。将靶细胞用cfse标记，用pbs洗涤，以各种e:t细胞比例与nk细胞混合，在37混合孵育4小时。然后通过流式细胞术分析细胞，并测定cfse阳性工程化t细胞的百分比，表明在nk细胞的存在下工程化t细胞的存活。意图是，尽管在阳性对照中观察到nk介导的细胞裂解(β2-m缺陷型工程化t细胞)，但当β2-m缺陷型工程化t细胞工程化t细胞表达b2m-ul18(seqidn°39)或分泌的nkg2d配体(sp-micaed(seqidn°40)、sp-micbed(seqidn°41)、sp-ulbp1ed(seqidn°42)、sp-ulbp2ed(seqidn°43)、sp-ulbp3ed(seqidn°44)、sp-n2dl4ed(seqidn°45)、sp-ret1ged(seqidn°46)、sp-raetiled(seqidn°47))时，没有观察到nk介导的细胞裂解或观察到有限的nk介导的细胞裂解。来自该实验的结果旨在表明，当在工程化t细胞中表达嵌合分子，作为抑制信号受体(b2m-ul18)或刺激信号受体(nkg2d配体)的诱饵时，同种异体nk细胞的细胞毒性活性受损。实施例12：isu在工程化t细胞中的表达将携带来自莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)(seqidn°78)的包膜蛋白的慢病毒颗粒，来自mmlv(seqidn°79)的包膜蛋白的跨膜截短形式或分泌的14聚体isu肽(来自hiv-1病毒seqidn°19至24的6个变体；来自hiv-2病毒seqidn°25至30的6个变体；来自分别为seqidn°32、33、34、35、36、37和38的siv、momulv、htlv-1、mpmv、syncitin1、syncitin2、herv-k和felv病毒的)转导到t细胞中。通过facs分析监测膜结合转基因的表达，而通过蛋白质印迹在细胞培养上清液中监测分泌的isu肽的表达。来自该实验的结果旨在表明两种形式的isu在t细胞中有效表达。实施例13：fp肽在工程化t细胞中的表达将携带分泌的9聚体fp多肽的慢病毒颗粒(1个来自hiv-1病毒，和2个来自具有各自的seqidn°48和49-50的人工序列)转导到t细胞中。通过蛋白质印迹在细胞培养上清液中监测分泌的fp肽的表达。来自该实验的结果旨在表明分泌的fp肽在t细胞中有效表达。实施例14：对表达isu的工程化t细胞的t细胞增殖的有效抑制将来自健康供体a的pbmc与表达isu的来自供体b的辐照或丝裂霉素处理的工程化t细胞共培养。作为对照，将来自健康供体a的pbmc与不表达isu的来自供体b的经辐照或丝裂霉素处理的工程化t细胞共培养。7天后，通过xtt比色测定法或通过cfse稀释法(facs分析)测量来自供体a的细胞增殖。虽然在对照中观察到细胞增殖，但当工程化t细胞表达膜结合或分泌的isu时，没有观察到细胞增殖或观察到有限的细胞增殖。本实验的结果旨在表明当工程化t细胞表达isu时，同种异体反应的t细胞增殖被抑制。实施例15：对表达fp的工程化t细胞的t细胞增殖的有效抑制将来自健康供体a的pbmc与表达fp的来自供体b的辐照或丝裂霉素处理的工程化t细胞共培养。作为对照，将来自健康供体a的pbmc与不表达fp的来自供体b的经辐照或丝裂霉素处理的工程化t细胞共培养。7天后，通过xtt比色测定法或通过cfse稀释法(facs分析)测量来自供体a的细胞增殖。虽然在对照中观察到细胞增殖，但当工程化t细胞表达分泌的fp时，没有观察到细胞增殖或观察到有限的细胞增殖。本实验的结果旨在表明当工程化t细胞表达fp时，同种异体反应的t细胞增殖被抑制。说明书中引用的参考文献列表arimondo，p.b.，c.j.thomas，etal.(2006).″exploringthecellularactivityofcamptothecin-triple-helix-formingoligonucleotideconjugates.″molcellbiol26(1)：324-33.arnould，s.，p.chames，etal.(2006).″engineeringoflargenumbersofhighlyspecifichomingendonucleasesthatinducerecombinationonnoveldnatargets.″jmolbiol355(3)：443-58.ashwell，j.d.andr.d.klusner(1990).″geneticandmutationalanalysisofthet-cellantigenreceptor.″annurevimmunol8：139-67.boch，j.，h.scholze，etal.(2009).″breakingthecodeofdnabindingspecificityoftal-typeiiieffectors.″science326(5959)：1509-12.boni，a.，p.muranski，etal.(2008).″adoptivetransferofallogeneictumor-specifictcellsmediateseffectiveregressionoflargetumorsacrossmajorhistocompatibilitybarriers.″blood112(12)：4746-54.brahmer，j.r.，c.g.drake，etal.(2010).″phaselstudyofsingle-agentanti-programmeddeath-1(mdx-1106)inrefractorysolidtumors：safety，clinicalactivity，pharmacodynamics，andimmunologiccorrelates.″jclinoncol28(19)：3167-75.cermak，t.，e.l.doyle，etal.(2011).″efficientdesignandassemblyofcustomtalenandothertaleffector-basedconstructsfordnatargeting.″nucleicacidsres39(12)：e82.choulika，a.，a.perrin，etal.(1995).″inductionofhomologousrecombinationinmammalianchromosomesbyusingthel-scelsystemofsaccharomycescerevisiae.″molcellbiol15(4)：1968-73.christian，m.，t.cermak，etal.(2010).″targetingdnadouble-strandbreakswithtaleffectornucleases.″genetics186(2)：757-61.coutinho，a.e.andk.e.chapman(2011).″theanti-inflammatoryandimmunosuppressiveeffectsofglucocorticoids，recentdevelopmentsandmechanisticinsights.″molcellendocrinol335(1)：2-13.critchlow，s.e.ands.p.jackson(1998).″dnaend-joining：fromyeasttoman.″trendsbiochemsci23(10)：394-8.deng，d.，c.yan，etal.(2012).″structuralbasisforsequence-specificrecognitionofdnabytaleffectors.″science335(6069)：720-3.eisenschmidt，k.，t.lanio，etal.(2005).″developingaprogrammedrestrictionendonucleaseforhighlyspecificdnacleavage.″nucleicacidsres33(22)：7039-47.egeissler，r.，h.scholze，etal.(2011).″transcriptionalactivatorsofhumangeneswithprogrammabledna-specificity.″plosone6(5)：e19509.huang，p.，a.xiao，etal.(2011).″heritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedtalens.″natbiotechnol29(8)：699-700.jena，b.，g.dotti，etal.(2010).″redirectingt-cellspecificitybyintroducingatumor-specificchimericantigenreceptor.″blood116(7)：1035-44.kalish，j.m.andp.m.glazer(2005).″targetedgenomemodificationviatriplehelixformation.″annnyacadsci1058：151-61.li，l.，m.j.piatek，etal.(2012).″rapidandhighlyefficientconstructionoftale-basedtranscriptionalregulatorsandnucleasesforgenomemodification.″plantmolbiol78(4-5)：407-16.li，t.，s.huang，etal.(2011).″talnucleases(talns)：hybridproteinscomposedoftaleffectorsandfokldna-cleavagedomain.″nucleicacidsres39(1)：359-72.li，t.，s.huang，eta1.(2011).″modularlyassembleddesigne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