作为用于治疗心血管疾病的可溶性鸟苷酸环化酶(SGC)刺激物的N‑取代的8‑[(2,6‑二氟苄基)氧基]‑2,6‑二甲基咪唑并[1,2‑A]吡嗪‑3‑甲酰胺衍生物的制作方法

文档序号:13426267
作为用于治疗心血管疾病的可溶性鸟苷酸环化酶(SGC)刺激物的N-取代的8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-A]吡嗪-3-甲酰胺衍生物本申请涉及新型的取代的咪唑并[1,2-a]吡嗪甲酰胺、它们的制备方法、它们独自或组合用于治疗和/或预防疾病的用途以及它们用于制造治疗和/或预防疾病,特别是治疗和/或预防心血管疾病的药剂的用途。哺乳动物细胞中最重要的细胞传输系统之一是环单磷酸鸟苷(cGMP)。其与从内皮中释放并传递激素和机械信号的一氧化氮(NO)一起形成NO/cGMP系统。鸟苷酸环化酶催化由三磷酸鸟苷(GTP)生物合成cGMP。迄今已知的这一家族的代表可以根据结构特征以及根据配体类型分成两类:可被钠尿肽刺激的微粒鸟苷酸环化酶和可被NO刺激的可溶性鸟苷酸环化酶。可溶性鸟苷酸环化酶由两个亚基构成并且非常可能每个异二聚体含有一个血红素,其是调节中心的一部分。这对活化机制至关重要。NO能键合到血红素的铁原子上并因此显著提高该酶的活性。相反,NO不能刺激无血红素的制品。一氧化碳(CO)也能结合到血红素的中心铁原子上,但CO的刺激比NO小得多。通过形成cGMP和由于造成的磷酸二酯酶、离子通道和蛋白激酶的调节,鸟苷酸环化酶在各种生理过程中,特别是在平滑肌细胞的松弛和增殖、血小板聚集和血小板粘附和神经元信号传递以及基于上述过程的破坏的疾病中起到重要作用。在病理生理条件下,NO/cGMP系统可能受到抑制,这可导致例如高血压、血小板活化、提高的细胞增殖、内皮功能障碍、动脉粥样硬化、心绞痛、心功能不全、心肌梗死、血栓形成、中风和性功能障碍。由于预期的高效率和低副作用水平,以生物体中的cGMP信号通路的影响为目标的可能用于此类疾病的不依赖于NO的疗法是有前途的方法。迄今,对于可溶性鸟苷酸环化酶的治疗性刺激,仅使用其作用基于NO的化合物,如有机硝酸酯。通过生物转化形成NO并通过攻击血红素的中心铁原子来活化可溶性鸟苷酸环化酶。除副作用外,耐药性的形成是这种治疗模式的重要缺点之一。近年来,已经描述了直接(即不预先释放NO)刺激可溶性鸟苷酸环化酶的一些物质,例如3-(5'-羟基甲基-2'-呋喃基)-1-苄基吲唑[YC-1;Wu等人,Blood84(1994),4226;Mülsch等人,Brit.J.Pharmacol.120(1997),681]、脂肪酸[Goldberg等人,J.Biol.Chem.252(1977),1279]、六氟磷酸二苯基碘鎓[Pettibone等人,Eur.J.Pharmacol.116(1985),307]、异甘草素[Yu等人,Brit.J.Pharmacol.114(1995),1587]和各种取代的吡唑衍生物(WO98/16223)。尤其在WO89/03833-A1和WO96/34866-A1中描述了各种咪唑并[1,2-a]吡嗪衍生物,它们可用于治疗疾病。本发明的一个目的是提供充当可溶性鸟苷酸环化酶的刺激物并因此适用于治疗和/或预防疾病并例如在它们的体内性质,例如它们的药代动力学和药效学特性、它们的溶解度和/或它们的代谢状况和/或它们的剂量-效应关系方面具有与现有技术中已知的化合物相同或改进的治疗状况的新型物质。本发明涉及通式(I)的化合物及其N-氧化物、盐、溶剂合物、N-氧化物的盐和N-氧化物的溶剂合物和盐的溶剂合物其中R1代表下式的基团其中*代表与氮原子的连接点。如果式(I)包括的并在下文中提到的化合物尚未是盐、溶剂合物和盐的溶剂合物,本发明的化合物是式(I)的化合物及其盐、溶剂合物和盐的溶剂合物、式(I)包括的并具有下文中提到的式的化合物及其盐、溶剂合物和盐的溶剂合物以及式(I)包括的并在下文中作为实施例提到的化合物及其盐、溶剂合物和盐的溶剂合物。本发明中优选的盐是本发明的化合物的生理可接受盐。还包括本身不适合药物用途但可例如用于本发明的化合物的分离或提纯的盐。本发明的化合物的生理可接受盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐,例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。本发明的化合物的生理可接受盐还包括常规碱的盐,例如和优选碱金属盐(例如钠和钾盐)、碱土金属盐(例如钙和镁盐)和衍生自氨或具有1至16个碳原子的有机胺,例如和优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、乙二胺和N-甲基哌啶的铵盐。溶剂合物在本发明中被描述为以固态或液态通过与溶剂分子配位而形成络合物的本发明的化合物的那些形式。水合物是溶剂合物的一种特定形式,其中与水发生配位。本发明中优选的溶剂合物是水合物。根据它们的结构,本发明的化合物可以以不同的立体异构形式,即以构型异构体或任选以构象异构体(对映体和/或非对映体,包括阻转异构体的情况中的那些)的形式存在。本发明因此包括对映体和非对映体和它们的各种混合物。可以以已知方式从对映体和/或非对映体的此类混合物中分离出立体异构一致的成分;为此优选使用色谱法,特别是在非手性或手性相上的HPLC色谱法。如果本发明的化合物可以以互变异构形式存在,则本发明包含所有互变异构形式。本发明还包括本发明的化合物的所有合适的同位素变体。本发明的化合物的同位素变体在此被理解为是指本发明的化合物内的至少一个原子已被具有相同原子序数但原子质量不同于自然界中通常或主要存在的原子质量的另一原子替换的化合物。可并入本发明的化合物中的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素,如2H(氘)、3H(氚)、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I和131I。本发明的化合物的特定同位素变体,尤其是其中已并入一种或多种放射性同位素的那些,可能有益于例如检查作用机制或体内的活性物质分布;由于相对容易的制备和检测,用3H或14C同位素标记的化合物尤其适用于此用途。此外,同位素,例如氘的并入可由于该化合物的更大代谢稳定性而带来特定治疗益处,例如体内半衰期的延长或所需活性剂量的降低;本发明的化合物的此类改性因此在一些情况下可能也构成本发明的优选实施方案。可通过本领域技术人员已知的方法,例如通过下文进一步描述的方法和实施例中描述的规程、通过使用各自的试剂和/或起始化合物的相应同位素改性来制备本发明的化合物的同位素变体。本发明另外还包括本发明的化合物的前药。术语“前药”在本文中是指本身在生物学上有活性或无活性但在其体内停留时间的过程中(例如通过代谢或水解途径)反应产生本发明的化合物的化合物。在本发明中,除非另行规定,取代基如下定义:在R1可代表的基团的式中,用*符号标记的线端点不代表碳原子或CH2基团,而是分别标记的与R1相连的原子的键的一部分。在本发明中,术语“治疗”包括抑制、延迟、阻止、缓解、减弱、限制、降低、遏止、击退或治愈疾病、病症、障碍、损伤或健康问题、或此类状态和/或此类状态的症状的发展、过程或进行。术语“疗法”在此被理解为与术语“治疗”同义。术语“防止”、“预防”或“预防措施”在本发明中同义使用并且是指避免或降低感染、发生、受困于或患上疾病、病症、障碍、损伤或健康问题或此类状态和/或此类状态的症状的发展或进行的危险。疾病、病症、障碍、损伤或健康问题的治疗或预防可以是部分或完全的。在本发明中优选的是式(I)的化合物及其N-氧化物、盐、溶剂合物、N-氧化物的盐和N-氧化物的溶剂合物和盐的溶剂合物,其中R1代表下式的基团其中*代表与氮原子的连接点。本发明中,优选的是具有系统名称ent-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-N-[(2S)-1-羟基-2-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙-2-基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酰胺和结构式的化合物及其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物。在本发明中,优选的是具有系统名称rac-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-N-{2-[2-(二氟甲基)-2H-四唑-5-基]-1-羟基丙-2-基}-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酰胺和结构式的化合物及其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物。在本发明中优选的是具有系统名称ent-N-[2-氨基-2-甲基(4,4,4-2H3)丁基]-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酰胺(对映体A)和结构式的化合物及其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物。在本发明中优选的是具有系统名称ent-N-[2-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁基]-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酰胺(对映体A)和结构式的化合物及其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物。在本发明中优选的是具有系统名称ent-N-[2-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁基]-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-甲酰胺(对映体B)和结构式的化合物及其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物。作为优选提到的基团定义适用于式(I)的化合物并相应地适用于所有中间产物。本发明还提供制备根据本发明的式(I)的化合物的方法,其特征在于使式(II)的化合物其中T1代表(C1-C4)-烷基或苄基,在惰性溶剂中在合适的碱或酸存在下反应以产生式(III)的羧酸后者随后在惰性溶剂中在酰胺偶联条件下与式(IV-A)、(IV-B)、(IV-C)或(IV-D)的胺反应其中R2代表氨基保护基,例如叔丁氧基羰基、苄氧基羰基或苄基,然后脱除任选存在的保护基,并任选用相应的(i)溶剂和/或(ii)酸或碱将所得式(I)的化合物转化成其溶剂合物、盐和/或盐的溶剂合物。可以例如通过下列合成图式(图式1)举例说明所述制备方法:图式1:[(a)氢氧化钠,1,4-二氧杂环己烷,90℃;(b)HATU,N,N-二异丙基乙胺,DMF,室温;(c)氢气,10%载钯活性炭,TFA,乙醇]。式(IV-A)、(IV-B)、(IV-C)和(IV-D)的化合物可购得、从文献中已知或可类似于文献方法制备。用于工艺步骤(III)+(IV)→(I)的惰性溶剂是例如醚,如二乙醚、二氧杂环己烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚或二乙二醇二甲醚,烃,如苯、甲苯、二甲苯、己烷、环己烷或石油馏分,卤代烃,如二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、1,2-二氯乙烷、三氯乙烯或氯苯,或其它溶剂,如丙酮、乙酸乙酯、乙腈、吡啶、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N'-二甲基丙烯脲(DMPU)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)。也可以使用所述溶剂的混合物。优选的是二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或这些溶剂的混合物。适合用作用于工艺步骤(III)+(IV)→(I)中的酰胺形成的缩合剂是例如碳二亚胺,如N,N'-二乙基-、N,N'-二丙基-、N,N'-二异丙基-、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)或N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),光气衍生物,如N,N'-羰基二咪唑(CDI),1,2-噁唑鎓化合物,如3-硫酸2-乙基-5-苯基-1,2-噁唑鎓或高氯酸2-叔丁基-5-甲基异噁唑鎓,酰氨基化合物,如2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉,或氯甲酸异丁酯、丙膦酸酐(T3P)、1-氯-N,N,2-三甲基丙-1-烯-1-胺、氰基膦酸二乙酯、双-(2-氧代-3-噁唑烷基)磷酰基氯、六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻、六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)鏻(PyBOP)、四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(TBTU)、六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(HBTU)、四氟硼酸2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(TPTU)、六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(HATU)或四氟硼酸O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(TCTU),其任选与其它辅助剂,如1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)以及碱,如碱金属碳酸盐,例如碳酸钠或碳酸钾或碳酸氢钠或碳酸氢钾,或有机碱,如三烷基胺,例如三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶或N,N-二异丙基乙胺组合。优选使用与N-甲基吗啉结合的TBTU、与N,N-二异丙基乙胺或1-氯-N,N,2-三甲基丙-1-烯-1-胺结合的HATU。缩合(III)+(IV)→(I)通常在-20℃至+100℃,优选0℃至+60℃的温度范围内进行。该转化可以在标准、升高或降低的压力(例如0.5至5巴)下进行。通常使用标准压力。或者,式(III)的羧酸也可以首先转化成相应的羰基氯,后者随后直接或在单独的反应中用式(IV)的胺转化成本发明的化合物。通过本领域技术人员已知的方法,例如通过在合适的碱存在下,例如在吡啶存在下以及任选在添加二甲基甲酰胺的情况下、任选在合适的惰性溶剂中用亚硫酰氯、硫酰氯或草酰氯处理而由羧酸形成羰基氯。通过常规方法通过在惰性溶剂中用酸或碱处理该酯,实现式(II)的化合物的酯基团T1的水解,在后一情况下,通过用酸处理将最初形成的盐转化成游离羧酸。在叔丁酯的情况下,优选用酸实现酯裂解。在苄酯的情况下,优选用载钯活性炭或雷尼镍通过氢解实现酯裂解。适用于此反应的惰性溶剂是水或常规用于酯裂解的有机溶剂。这些优选包括醇,如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇,或醚,如二乙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二氧杂环己烷或乙二醇二甲醚,或其它溶剂,如丙酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺或二甲亚砜。同样可以使用所述溶剂的混合物。在碱性酯水解的情况下,优选使用水与二氧杂环己烷、四氢呋喃、甲醇和/或乙醇的混合物。适用于酯水解的碱是常规无机碱。这些优选包括碱金属或碱土金属氢氧化物,例如氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钡,或碱金属或碱土金属碳酸盐,如碳酸钠、碳酸钾或碳酸钙。特别优选的是氢氧化钠或氢氧化锂。适用于酯裂解的酸通常是硫酸、氯化氢/盐酸、溴化氢/氢溴酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、甲苯磺酸、甲磺酸或三氟甲磺酸或其混合物,任选添加水。在叔丁酯的情况下优选的是氯化氢或三氟乙酸,在甲酯的情况下优选的是盐酸。酯裂解通常在0℃至+100℃,优选+0℃至+50℃的温度范围内进行。这些转化可以在标准、升高或降低的压力(例如0.5至5巴)下进行。在每种情况下通常使用标准压力。所用氨基保护基优选是叔丁氧基羰基(Boc)或苄氧基羰基(Z)。用于羟基或羧基官能的保护基优选是叔丁基或苄基。通过常规方法脱除这些保护基,优选通过在惰性溶剂,如二氧杂环己烷、二乙醚、二氯甲烷或乙酸中与强酸,如氯化氢、溴化氢或三氟乙酸反应;任选也可以不用附加惰性溶剂实现该脱除。在苄基和苄氧基羰基作为保护基的情况下,这些也可以通过在钯催化剂存在下的氢解除去。任选可以同时在一锅反应中或在分开的反应步骤中进行所述保护基的脱除。式(II)的化合物是文献中已知的或可如下制备[A]使式(V)的化合物在惰性溶剂中在合适的碱存在下与式(VI)的化合物反应以产生式(VII)的化合物然后使其在惰性溶剂中与式(VIII)的化合物反应其中T1各自具有上文给出的含义。所述方法通过下列图示(图示2)为例阐述:图示2:[(a)叔丁醇钾,1,2-二甲氧基乙烷,80℃;(b)乙醇,分子筛,回流]。所示合成次序可如下更改,即各个反应步骤以改变的次序进行。这类更改的合成次序的实例示于图示3。图示3:[(a):EtOH,分子筛,回流;b)叔丁醇钾,1,2-二甲氧基乙烷,80℃]。用于工艺步骤(V)+(VI)→(VII)或(X)+(VI)→(II)的惰性溶剂是例如醚,如二乙醚、二氧杂环己烷、四氢呋喃、二甲氧基甲烷、乙二醇二甲醚或二乙二醇二甲醚或其它溶剂,如丙酮、甲乙酮、乙酸乙酯、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、N,N'-二甲基丙烯脲(DMPU)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)。同样可以使用所述溶剂的混合物。优选使用二甲氧基乙烷。适用于工艺步骤(V)+(VI)→(VII)或(X)+(VI)→(II)的碱是常规无机或有机碱。这些优选包括碱金属氢氧化物,例如氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾,碱金属或碱土金属碳酸盐,如碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙或碳酸铯,任选添加碱金属碘化物,例如碘化钠或碘化钾,碱金属醇盐,如甲醇钠或甲醇钾、乙醇钠或乙醇钾或叔丁醇钠或叔丁醇钾,碱金属氢化物,如氢化钠或氢化钾,氨基化物,如氨基化钠、双(三甲基甲硅烷基)氨基化锂或双(三甲基甲硅烷基)氨基化钾或二异丙基氨基化锂,或有机胺,如三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、N,N-二异丙基乙胺、吡啶、4-(N,N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)或1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO®)。优选使用叔丁醇钠或叔丁醇钾。该反应通常在0℃至+120℃,优选+20℃至+80℃的温度范围内,任选在微波中进行。该反应可以在标准、升高或降低的压力(例如0.5至5巴)下进行。用于闭环以提供咪唑并[1,2-a]吡嗪基本骨架(VII)+(VIII)→(II)或(VIII)+(IX)→(X)的惰性溶剂是常规有机溶剂。这些优选包括醇,如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇或叔丁醇,或醚,如二乙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二氧杂环己烷或乙二醇二甲醚,或其它溶剂,如丙酮、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、乙腈、二甲基甲酰胺或二甲亚砜。同样可以使用所述溶剂的混合物。优选使用乙醇。该闭环通常在+50℃至+150℃,优选+50℃至+100℃的温度范围内,任选在微波中进行。闭环(VII)+(VIII)→(II)或(VIII)+(IX)→(X)任选在脱水反应添加剂存在下,例如在分子筛(孔径3Å或4Å)存在下或借助水分离器进行。使用过量式(VIII)的试剂,例如使用1至20当量的试剂(VIII)进行反应(VII)+(VIII)→(II)或(VIII)+(IX)→(X),任选添加碱(例如碳酸氢钠),在这种情况下这种试剂的添加可以一次性或分数份进行。其它的本发明的化合物也可以任选地由上述方法获得的式(I)的化合物出发通过各取代基的官能团,特别是R3下提及的那些的转化来制备。这种转化根据本领域技术人员已知的常见方法进行并例如包括如亲核和亲电取代、氧化、还原、氢化、过渡金属催化的偶联反应、消去、烷基化、胺化、酯化、酯裂解、醚化、醚裂解、形成羧酰胺之类的反应以及引入和脱除临时保护基。本发明的化合物具有有价值的药理性质并可用于预防和治疗人类和动物的疾病。本发明的化合物提供另一种治疗备选方案并因此扩展了药剂学领域。本发明的化合物充当可溶性鸟苷酸环化酶的强效刺激剂,具有有价值的药理性质并例如在其体内性质和/或其药代动力学特性和/或代谢状况方面具有改进的治疗状况。它们因此适用于治疗和/或预防人类和动物的疾病。本发明的化合物引起血管舒张和抑制血小板聚集并导致血压降低以及冠脉血流量提高。这些效应经由可溶性鸟苷酸环化酶的直接刺激和细胞内cGMP的升高得以促进。此外,本发明的化合物增强提高cGMP浓度的物质,例如EDRF(内皮衍生舒张因子)、NO供体、原卟啉IX、花生四烯酸或苯基肼衍生物的作用。本发明的化合物适用于治疗和/或预防心血管疾病、肺病、血栓栓塞病和纤维化疾病。因此,本发明的化合物可用在治疗和/或预防心血管疾病,例如血压升高(高血压)、顽固性高血压、急性和慢性心功能不全、冠心病、稳定和不稳定心绞痛、外周血管和心血管病、心律失常、房性和室性心律失常以及传导受损,例如I-III度房室传导阻滞(AB阻滞I-III)、室上性快速心律失常、心房颤动、心房扑动、心室颤动、心室扑动、室性快速心律失常、尖端扭转型心动过速(Torsadedepointes-Tachycardia)、房性和室性早搏、房室结性早搏(AV-junctionaleExtrasystolen)、病窦综合征、晕厥、房室结折返性心动过速、Wolff-Parkinson-White综合征、急性冠脉综合征(ACS)、自身免疫性心脏病(心包炎、心内膜炎、心瓣炎(Valvolitis)、主动脉炎、心肌病)、休克,如心源性休克、败血性休克和过敏性休克、动脉瘤、拳师犬心肌病(室性期前收缩(PVC))、治疗和/或预防血栓栓塞病和缺血,如心肌缺血、心肌梗死、中风、心肌肥厚、短暂性和缺血性发作、先兆子痫、炎性心血管疾病、冠状动脉和外周动脉痉挛、水肿形成,例如肺水肿、脑水肿、肾水肿或由心功能不全造成的水肿、外周血液循环障碍、再灌注损伤、动脉和静脉血栓形成、微量白蛋白尿、心肌机能不全、内皮功能障碍、预防再狭窄,例如在溶栓疗法、经皮腔内血管成形术(PTA)、腔内冠状动脉成形术(PTCA)、心脏移植和搭桥手术后,以及微血管和大血管损伤(血管炎)、提高的纤维蛋白原和低密度脂蛋白(LDL)水平以及提高的纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)浓度以及治疗和/或预防勃起功能障碍和女性性功能障碍的药剂中。在本发明中,术语“心功能不全”包括心功能不全的急性和慢性表现,以及更具体或相关的疾病类型,如急性失代偿性心功能不全、右心衰竭、左心衰竭、全心衰竭、缺血性心肌病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、特发性心肌病、先天性心脏缺损、与心脏瓣膜缺损相关的心功能不全、二尖瓣狭窄、二尖瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣闭锁不全、三尖瓣狭窄、三尖瓣闭锁不全、肺动脉狭窄、肺动脉瓣闭锁不全、联合心脏瓣膜缺损、心肌炎症(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病心功能不全、酒精性心肌病、心脏贮积病(kardialeSpeichererkrankung)、舒张性心功能不全和收缩性心功能不全,和现有慢性心功能不全的急性恶化期(恶化的心力衰竭)。此外,本发明的化合物也可用于治疗和/或预防动脉硬化、脂质代谢紊乱、低脂蛋白血症、血脂异常、高甘油三酯血症、高脂血症、高胆固醇血症、无β脂蛋白血症、谷固醇血症、黄瘤病、丹吉尔病、脂肪过多、肥胖和混合型高脂血症和代谢综合征。本发明的化合物也可用于治疗和/或预防原发性和继发性雷诺现象、微循环障碍、跛行、周围和自主神经病、糖尿病微血管病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病四肢溃疡、坏疽、CREST综合征、红斑狼疮(Erythematose)、甲癣、风湿病和用于促进伤口愈合。本发明的化合物也适用于治疗泌尿系统疾病,例如良性前列腺综合征(BPS)、良性前列腺增生(BPH)、良性前列腺增大(BPE)、膀胱出口梗阻(BOO)、下尿路综合征(LUTS,包括猫泌尿综合征(FUS))、泌尿生殖系统疾病,包括神经源性膀胱过度活动症(OAB)和(IC)、尿失禁(UI),例如混合性尿失禁、急迫性尿失禁、压力性尿失禁或充溢性尿失禁(MUI、UUI、SUI、OUI)、骨盆痛、男性和女性泌尿生殖系统的器官的良性和恶性疾病。本发明的化合物也适用于治疗和/或预防肾病,特别是急性和慢性肾功能不全和急性和慢性肾衰竭。在本发明中,术语“肾功能不全”包括肾功能不全的急性和慢性表现,以及基础的或相关的肾病,如肾灌注不足、透析中低血压、阻塞性尿路病、肾小球病、肾小球肾炎、急性肾小球肾炎、肾小球硬化症、肾小管间质性疾病,肾病,如原发性和先天性肾病、肾炎、免疫性肾病,如肾移植排斥、免疫复合物诱发的肾病、毒性物质诱发的肾病、造影剂诱发的肾病、糖尿病性和非糖尿病性肾病、肾盂肾炎、肾囊肿、肾硬化、高血压肾硬化和肾病综合征,它们在诊断上的特征例如在于异常降低的肌酐和/或水排泄、异常升高的尿素、氮、钾和/或肌酐的血浓度,肾酶,例如谷氨酰合成酶的活性改变、改变的尿渗透压或尿量、升高的微量白蛋白尿、大量白蛋白尿、肾小球和小动脉病变、肾小管扩张、高磷血症和/或需要透析。本发明还包括本发明的化合物用于治疗和/或预防肾功能不全的后遗症,例如肺水肿、心功能不全、尿毒症、贫血症、电解质紊乱(例如高钾血症、低钠血症)以及骨和碳水化合物代谢紊乱的用途。此外,本发明的化合物也适用于治疗和/或预防哮喘病、肺动脉高压(PAH)和其它形式的肺高压(PH),包括与左心室病、HIV、镰状细胞贫血、血栓栓塞(CTEPH)、结节病、COPD或肺纤维化相关的肺高压、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)、肺纤维化、肺气肿(例如香烟烟雾诱发的肺气肿)和囊性纤维化(CF)。本发明中所述的化合物也是用于对抗以NO/cGMP系统的紊乱为特征的中枢神经系统疾病的活性物质。它们特别适用于改善在认知障碍,例如特别与意外(Situation)/疾病/综合征相关发生的认知障碍,如轻度认知障碍、年龄相关的学习和记忆障碍、年龄相关的记忆丧失、血管性痴呆、脑损伤、中风、中风后发生的痴呆(中风后痴呆)、创伤后脑损伤、一般性注意力集中障碍、具有学习和记忆问题的儿童的注意力集中障碍、阿尔茨海默氏症、路易体痴呆、存在额叶退化的痴呆症,包括皮克氏综合征、帕金森氏病、渐进性核性麻痹、存在皮质基底节变性的痴呆症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病、脱髓鞘、多发性硬化症、丘脑退化、克雅氏痴呆、HIV痴呆、与痴呆有关的精神分裂症或柯萨可夫精神病后的认知、专注力、学习或记忆力。它们也适用于治疗和/或预防中枢神经系统疾病,如焦虑、紧张和抑郁状态、中枢神经相关的性功能障碍和睡眠障碍以及用于调整食物、兴奋剂和成瘾物质摄取的病理性障碍。此外,本发明的化合物也适用于调整脑供血并因此是有效的偏头痛控制剂。它们也适用于预防和对抗脑梗死(脑中风)的后遗症,如中风、脑缺血和颅脑外伤。本发明的化合物也可用于控制疼痛状态和耳鸣。此外,本发明的化合物具有抗炎作用并因此可用作治疗和/或预防败血症(SIRS)、多器官功能衰竭(MODS、MOF)、炎性肾病、慢性肠炎(IBD、克罗恩病、UC)、胰腺炎、腹膜炎、类风湿病、炎性皮肤病和炎性眼病的抗炎剂。此外,本发明的化合物也可用于治疗和/或预防自身免疫病。本发明的化合物也适用于治疗和/或预防内脏器官,例如肺、心、肾、骨髓,特别是肝的纤维化疾病,以及皮肤纤维化和眼部纤维化疾病。在本发明中,术语纤维化疾病特别包括下列术语:肝纤维化、肝硬化、肺纤维化、心内膜心肌纤维化、肾病、肾小球肾炎、肾间质纤维化、由糖尿病造成的纤维化损伤、骨髓纤维化和类似的纤维化疾病、硬皮病、硬斑病、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕(也在术后)、痣、糖尿病视网膜病变、增殖性玻璃体视网膜病变和结缔组织病(例如结节病)。本发明的化合物也适用于对抗术后瘢痕形成,例如由于青光眼手术。本发明的化合物也可以在化妆品中用于老化和角质化皮肤。此外,本发明的化合物适用于治疗和/或预防肝炎、肿瘤、骨质疏松、青光眼和胃轻瘫。本发明还提供本发明的化合物用于治疗和/或预防疾病,特别是上述疾病的用途。本发明还提供本发明的化合物用于治疗和/或预防心功能不全、心绞痛、高血压、肺高压、缺血、血管疾病、肾功能不全、血栓栓塞病、纤维化疾病、动脉硬化、痴呆病和勃起功能障碍的用途。本发明还提供用在治疗和/或预防心功能不全、心绞痛、高血压、肺高压、缺血、血管疾病、肾功能不全、血栓栓塞病、纤维化疾病和动脉硬化的方法中的本发明的化合物。本发明还提供本发明的化合物用于制备治疗和/或预防疾病,尤其是上述疾病的药剂的用途。本发明还提供本发明的化合物用于制备治疗和/或预防心功能不全、心绞痛、高血压、肺高压、缺血、血管疾病、肾功能不全、血栓栓塞病、纤维化疾病、动脉硬化、痴呆病和勃起功能障碍的药剂的用途。本发明还提供使用有效量的本发明化合物的至少一种治疗和/或预防疾病,特别是上述疾病的方法。本发明还提供使用有效量的本发明化合物的至少一种治疗和/或预防心功能不全、心绞痛、高血压、肺高压、缺血、血管疾病、肾功能不全、血栓栓塞病、纤维化疾病和动脉硬化的方法。本发明的化合物可以独自使用或如果需要,与其它活性物质联合使用。本发明还提供包含本发明化合物的至少一种和一种或多种附加活性物质的药剂,其尤其是用于治疗和/或预防上述疾病。合适的联合活性物质的优选实例包括:•有机硝酸酯和NO供体,例如硝普钠、硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、二硝酸异山梨酯、吗多明或SIN-1和吸入性NO;•抑制环单磷酸鸟苷(cGMP)降解的化合物,例如磷酸二酯酶(PDE)1、2和/或5的抑制剂,尤其是PDE5抑制剂,如西地那非、伐地那非和他达拉非;•抗血栓形成剂,例如和优选选自血小板聚集抑制剂、抗凝血剂和促溶纤(profibrinolytisch)物质;•降血压活性物质,例如和优选选自钙拮抗剂、血管紧张素AII拮抗剂、ACE抑制剂、内皮素拮抗剂、肾素抑制剂、α-受体阻滞剂、β-受体阻滞剂、盐皮质激素受体拮抗剂和利尿剂;和/或•改变脂肪代谢的活性物质,例如和优选选自甲状腺受体激动剂、胆固醇合成抑制剂,例如和优选HMG-CoA还原酶抑制剂或角鲨烯合成抑制剂、ACAT抑制剂、CETP抑制剂、MTP抑制剂、PPAR-α、PPAR-γ和/或PPAR-δ激动剂、胆固醇吸收抑制剂、脂肪酶抑制剂、聚合胆汁酸吸附剂、胆汁酸再吸收抑制剂和脂蛋白(a)拮抗剂。抗血栓形成剂优选被理解为是指选自血小板聚集抑制剂、抗凝血剂或促溶纤物质的化合物。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与血小板聚集抑制剂,例如和优选阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定或双嘧达莫联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与凝血酶抑制剂,例如和优选希美加群、达比加群、美拉加群、比伐卢定或克赛联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与GPIIb/IIIa拮抗剂,例如和优选替罗非班或阿昔单抗联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与因子Xa抑制剂,例如和优选利伐沙班(BAY59-7939)、依度沙班(DU-176b)、阿哌沙班、奥米沙班、Fidexaban、雷扎沙班、磺达肝癸钠(Fondaparinux)、艾卓肝素、PMD-3112、YM-150、KFA-1982、EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX9065a、DPC906、JTV803、SSR-126512或SSR-128428联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与肝素或与低分子量(LMW)肝素衍生物联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与维生素K拮抗剂,例如和优选香豆素联合给药。降血压剂优选被理解为是指选自钙拮抗剂、血管紧张素AII拮抗剂、ACE抑制剂、内皮素拮抗剂、肾素抑制剂、α-受体阻滞剂、β-受体阻滞剂、盐皮质激素受体拮抗剂和利尿剂的化合物。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与钙拮抗剂,例如和优选硝苯地平、氨氯地平、维拉帕米或地尔硫卓联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与α-1-受体阻滞剂,例如和优选哌唑嗪联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与β-受体阻滞剂,例如和优选普萘洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、阿普洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、布拉洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、甲吲洛尔、卡拉洛尔、索他洛尔、美托洛尔、倍他洛尔、塞利洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、艾司洛尔、拉贝洛尔、卡维地洛、阿达洛尔、兰替洛尔、奈必洛尔、依泮洛尔或布新洛尔联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与血管紧张素AII拮抗剂,例如和优选氯沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、替米沙坦、恩布沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、依普沙坦或阿齐沙坦或双重血管紧张素AII拮抗剂/NEP抑制剂,例如和优选LCZ696(缬沙坦/Sacubitril)联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与ACE抑制剂,例如和优选依那普利、卡托普利、赖诺普利、雷米普利、地拉普利、福辛普利、奎诺普利、培哚普利或群多普利联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与内皮素拮抗剂,例如和优选波生坦、达卢生坦、安倍生坦或西他生坦联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与肾素抑制剂,例如和优选阿利吉仑、SPP-600或SPP-800联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与盐皮质激素受体拮抗剂,例如和优选安体舒通或依普利酮联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与袢利尿剂,例如速尿、托拉塞米、布美他尼和吡咯他尼,与保钾利尿剂,例如阿米洛利和氨苯蝶啶,与醛固酮拮抗剂,例如安体舒通、坎利酸钾和依普利酮以及噻嗪类利尿剂,例如氢氯噻嗪、氯噻酮、希帕胺和吲达帕胺联合给药。脂肪代谢调节剂优选被理解为是指选自CETP抑制剂、甲状腺受体激动剂、胆固醇合成抑制剂,如HMG-CoA还原酶抑制剂或角鲨烯合成抑制剂,ACAT抑制剂、MTP抑制剂、PPAR-α、PPAR-γ和/或PPAR-δ激动剂、胆固醇吸收抑制剂、聚合胆汁酸吸附剂、胆汁酸再吸收抑制剂、脂肪酶抑制剂和脂蛋白(a)拮抗剂的化合物。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与CETP抑制剂,例如和优选达塞曲匹(Dalcetrapib)、BAY60-5521、安塞曲匹(Anacetrapib)或CETP-疫苗(CETi-1)联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与甲状腺受体激动剂,例如和优选D-甲状腺素、3,5,3'-三碘甲腺原氨酸(T3)、CGS23425或阿昔替罗(CGS26214)联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与选自他汀类的HMG-CoA还原酶抑制剂,例如和优选洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀或匹伐他汀联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与角鲨烯合成抑制剂,例如和优选BMS-188494或TAK-475联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与ACAT抑制剂,例如和优选阿伐麦布(Avasimibe)、甲亚油酰胺(Melinamide)、帕替麦布(Pactimibe)、Eflucimibe或SMP-797联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与MTP抑制剂,例如和优选Implitapide、BMS-201038、R-103757或JTT-130联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与PPAR-γ激动剂,例如和优选吡格列酮或罗格列酮联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与PPAR-δ激动剂,例如和优选GW501516或BAY68-5042联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与胆固醇吸收抑制剂,例如和优选依泽替米贝、替奎安或帕马苷联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与脂肪酶抑制剂,例如和优选奥利司他联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与聚合胆汁酸吸附剂,例如和优选消胆胺、考来替泊、Colesolvam、考来胶(CholestaGel)或Colestimid联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与胆汁酸再吸收抑制剂,例如和优选ASBT(=IBAT)抑制剂,例如AZD-7806、S-8921、AK-105、BARI-1741、SC-435或SC-635联合给药。在本发明的一个优选实施方案中,本发明的化合物与脂蛋白(a)拮抗剂,例如和优选Gemcabene钙(CI-1027)或烟酸联合给药。本发明还提供包含至少一种本发明的化合物与通常一种或多种惰性、无毒、药用合适的赋形剂的药剂,及其用于上述目的的用途。本发明的化合物可以全身和/或局部作用。为此,它们可以以合适方式给药,例如通过口服、肠道外、肺、鼻、舌下、舌、口腔、直肠、皮肤、透皮、结膜、经耳或作为植入物或支架。本发明的化合物可以以适合这些给药途径的给药形式给药。适合口服给药的给药形式是根据现有技术工作并快速和/或以调控方式释放本发明的化合物并含有结晶和/或非晶和/或溶解形式的本发明的化合物的那些,例如片剂(未包衣或包衣片剂,例如带有控制本发明的化合物的释放的抗胃酸或延迟溶出或不可溶包衣)、在口腔中快速崩解的片剂或薄膜剂/圆片、薄膜剂/冻干产物、胶囊(例如硬或软明胶胶囊)、糖衣片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、乳剂、混悬剂、气雾剂或溶液剂。肠道外给药可以避开吸收步骤(例如通过静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内或腰内途径)或包括吸收(例如通过肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹膜内途径)。适合肠道外给药的给药形式尤其包括溶液、混悬剂、乳剂、冻干产物或无菌粉末形式的注射和输液制剂。对于其它给药途径,合适的实例是可吸入剂型(尤其是粉末吸入器、喷雾器)、滴鼻剂、鼻用溶液剂或喷雾剂、舌、舌下或口腔给药的片剂、薄膜剂/圆片或胶囊、栓剂、耳或眼制剂、阴道胶囊、水混悬剂(洗剂、振荡混合物)、亲脂混悬剂、软膏剂、乳膏剂、透皮治疗系统(例如贴剂)、乳剂、糊剂、泡沫剂、扑粉剂、植入物或支架。优选的是口服或肠道外给药,尤其是口服给药。本发明的化合物可转化成所提到的给药形式。这可以以本身已知的方式通过与惰性、无毒、药用合适的赋形剂混合实现。这些赋形剂尤其包括载体(例如微晶纤维素、乳糖、甘露醇)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂和分散剂或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧山梨糖醇酐油酸酯(Polyoxysorbitanoleat))、粘合剂(例如聚乙烯基吡咯烷酮)、合成和天然聚合物(例如白蛋白)、稳定剂(例如抗氧化剂,例如抗坏血酸)、着色剂(例如无机颜料,例如氧化铁)和味道和/或气味矫正剂。通常发现在肠道外给药的情况下有利的是给予大约0.001至1mg/kg,优选大约0.01至0.5mg/kg体重的量以实现有效结果。在口服给药的情况下,该剂量为大约0.001至2mg/kg,优选大约0.001至1mg/kg体重。然而,在一些情况下可能必须偏离规定的量,尤其取决于体重、给药途径、个体对活性物质的响应、制剂性质和给药时间或时间间隔。因此,在一些情况下少于上述最低量可能是足够的,而在另一些情况下必须超过所提到的上限。在给予更大量的情况下,可能最好将它们在一天内分成几个单剂。下列实施例例示本发明。除非另行指明,下列试验和实施例中的百分比为重量百分比;份数为重量份。溶剂比、稀释比和液体/液体溶液的浓度数据各自基于体积。A.实施例缩写:abs.纯(=干燥)aq.水溶液ber.计算值Boc叔丁氧基羰基br.宽信号(NMR耦合图)CAS-Nr.化学文摘服务号Cbz苄氧基羰基δNMR谱中的位移(以ppm计)d双重峰(NMR耦合图)DC薄层色谱法DCI直接化学电离(在MS中)DMAP4-N,N-二甲基氨基吡啶DMF二甲基甲酰胺DMSO二甲亚砜EDCIN-[3-(二甲基氨基)丙基]-N’-乙基碳二亚胺d.Th.理论值的(在收率中)ent对映体纯eq.当量ESI电喷雾电离(在MS中)Et乙基gef.测量值h小时HATU六氟磷酸N-[(二甲基氨基)(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]-吡啶-3-氧基)亚甲基]-N-甲基甲铵HOBT1H-苯并三唑-1-醇HPLC高压高效液相色谱法HRMS高分辨质谱法ID内径konz.浓缩LC-MS液相色谱法-质谱法联用LiHMDS六甲基二硅基氨基锂m多重峰Me甲基min分钟MS质谱法NMR核磁共振谱法PDA光电二极管阵列检测器Pd2dba3三(二亚苄基丙酮)二钯Ph苯基q四重峰(NMR耦合图)quint.五重峰(NMR耦合图)rac外消旋rel相对立体化学RF保留因子(在薄层色谱法中)RT室温Rt保留时间(在HPLC中)s单重峰(NMR耦合图)t三重峰(NMR耦合图)THF四氢呋喃TBTU氟硼酸(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲鎓(methylium)UPLC-MS超高压液相色谱法-质谱法联用UV紫外分光法v/v(溶液的)体积比Xantphos4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨XPHOS二环己基-(2',4',6'-三异丙基联苯-2-基)膦。LC-MS和HPLC方法:方法1(LC-MS):仪器:MicromassQuattroPremier与WatersUPLCAcquity;柱:ThermoHypersilGOLD1.9µ50x1mm;洗脱液A:1升水+0.5毫升50%甲酸;洗脱液B:1升乙腈+0.5毫升50%甲酸;梯度:0.0min90%A→0.1min90%A→1.5min10%A→2.2min10%A;炉:50℃;流速:0.33ml/min;UV检测:210nm。方法2(LC-MS):仪器:WatersACQUITYSQDUPLCSystem;柱:WatersAcquityUPLCHSST31.8µ50x1mm;洗脱液A:1升水+0.25毫升99%甲酸;洗脱液B:1升乙腈+0.25毫升99%甲酸;梯度:0.0min90%A→1.2min5%A→2.0min5%A;炉:50℃;流速:0.40ml/min;UV检测:210–400nm。方法3(LC-MS):仪器:MicromassQuattroPremier与WatersUPLCAcquity;柱:ThermoHypersilGOLD1.9µ50x1mm;洗脱液A:1升水+0.5毫升50%甲酸;洗脱液B:1升乙腈+0.5毫升50%甲酸;梯度:0.0min97%A→0.5min97%A→3.2min5%A→4.0min5%A;炉:50℃;流速:0.3ml/min;UV检测:210nm。方法4(制备型HPLC):ChromatorexC1810µ250x20mm梯度:A=水+0.5%甲酸,B=乙腈,0min=5%B,3min=5%B无物质的预冲洗,然后注射,5min=5%B,25min=30%B,38min=30%B,38.1min=95%B,43.00min=95%B,43.01min=5%B,48.0min=5%B;流速20ml/min,波长210nm。方法5(制备型HPLC):ChromatorexC1810µ250x20mm梯度:A=水+0.5%甲酸,B=乙腈,0min=5%B,3min=5%B无物质的预冲洗,然后注射,5min=5%B,25min=50%B,38min=50%B,38.1min=95%B,43.00min=95%B,43.01min=5%B,48.0min=5%B;流速20ml/min,波长210nm。方法6(制备型HPLC):XBridgePrep.C185µ50x19mm梯度:A=水+0.5%氢氧化铵,B=乙腈,0min=5%B,3min=5%B无物质的预冲洗,然后注射,5min=5%B,25min=50%B,38.0min=50%B,38.1min=95%B,43.00min=95%B,43.01min=5%B,48.0min=5%B;流速15ml/min,波长210nm。方法7(LC-MS):MS仪器:Waters(Micromass)QM;HPLC仪器:Agilent1100系列;柱:AgilentZORBAXExtend-C183.0x50mm3.5micron;洗脱液A:1升水+0.01摩尔碳酸铵,洗脱液B:1升乙腈;梯度:0.0min98%A→0.2min98%A→3.0min5%A→4.5min5%A;炉:40℃;流速:1.75ml/min;UV检测:210nm。方法8(LC-MS):仪器:WatersACQUITYSQDUPLCSystem;柱:WatersAcquityUPLCHSST31.8µ30x2mm;洗脱液A:1升水+0.25毫升99%甲酸;洗脱液B:1升乙腈+0.25毫升99%甲酸;梯度:0.0min90%A→1.2min5%A→2.0min5%A;炉:50℃;流速:0.60ml/min;UV检测:208–400nm。方法9(制备型HPLC):MS仪器:Waters,HPLC仪器:Waters(柱WatersX-BridgeC18,18mmx50mm,5µm,洗脱液A:水+0.05%三乙胺,洗脱液B:乙腈(ULC)+0.05%三乙胺,存在梯度;流速:40ml/min;UV检测:DAD;210-400nm)。或:MS仪器:Waters,HPLC仪器:Waters(柱PhenomenexLuna5µC18(2)100A,AXIATech.50x21.2mm,洗脱液A:水+0.05%甲酸,洗脱液B:乙腈(ULC)+0.05%甲酸,存在梯度;流速:40ml/min;UV检测:DAD;210-400nm)。方法10(LC-MS):MS仪器:WatersSQD;HPLC仪器:WatersUPLC;柱:ZorbaxSB-Aq(Agilent),50mmx2.1mm,1.8µm;洗脱液A:水+0.025%甲酸,洗脱液B:乙腈(ULC)+0.025%甲酸;梯度:0.0min98%A-0.9min25%A–1.0min5%A-1.4min5%A–1.41min98%A–1.5min98%A;炉:40℃;流速:0.600ml/min;UV检测:DAD;210nm。方法11(MS):仪器:WatersZQ2000;电喷雾电离;洗脱液A:1升水+0.25毫升99%甲酸;洗脱液B:1升乙腈+0.25毫升99%甲酸;25%A,75%B;流速:0.25ml/min。方法12(DCI-MS):仪器:ThermoFisher-ScientificDSQ;化学电离;反应物气体NH3;源温度:200℃;电离能70eV。方法13(LC-MS):MS仪器:Waters(Micromass)QuattroMicro;HPLC仪器:Agilent1100系列;柱:YMC-TriartC183µ50x3mm;洗脱液A:1升水+0.01mol碳酸铵,洗脱液B:1升乙腈;梯度:0.0min100%A→2.75min5%A→4.5min5%A;炉:40℃;流速:1.25ml/min;UV检测:210nm。方法14(GC-MS):仪器:ThermoScientificDSQII,ThermoScientificTraceGCUltra;柱:RestekRTX-35MS,15mx200µmx0.33µm;氦气的恒定流速:1.20ml/min;炉:60℃;入口:220℃;梯度:60℃,30℃/min→300℃(保持3.33min)。方法15(LC-MS,分析):仪器:AgilentMSQuad6150;HPLC:Agilent1290;柱:WatersAcquityUPLCHSST31.8µ50x2.1mm;洗脱液A:1升水+0.25毫升99%甲酸;洗脱液B:1升乙腈+0.25毫升99%甲酸;梯度:0.0min90%A→0.3min90%A→1.7min5%A→3.0min5%A;炉:50℃;流速:1.20ml/min;UV检测:205-305nm。方法16(LC-MS,分析):MS仪器:Waters(Micromass)QuattroMicro;仪器WatersUPLCAcquity;柱:WatersBEHC181.7µ50x2.1mm;洗脱液A:1升水+0.01mol甲酸铵,洗脱液B:1升乙腈;梯度:0.0min95%A→0.1min95%A→2.0min15%A→2.5min15%A→2.51min10%A→3.0min10%A;炉:40℃;流速:0.5ml/min;UV检测:210nm。方法17(LC-MS):仪器:WatersACQUITYSQDUPLCSystem;柱:WatersAcquityUPLCHSST31.8µ50x1mm;洗脱液A:1升水+0.25毫升99%甲酸,洗脱液B:1升乙腈+0.25毫升99%甲酸;梯度:0.0min95%A→6.0min5%A→7.5min5%A;炉:50℃;流速:0.35ml/min;UV检测:210–400nm。进一步细节:在通过洗脱剂含有添加剂,例如三氟乙酸、甲酸或氨的上述方法通过制备型HPLC提纯本发明的化合物的情况下,如果本发明的化合物含有足够碱性或酸性的官能度,本发明的化合物可以以盐形式,例如作为三氟乙酸盐、甲酸盐或铵盐获得。这样的盐可通过本领域技术人员已知的各种方法转化成相应的游离碱或酸。因此,三氟乙酸盐、甲酸盐或铵盐可通过用饱和碳酸氢钠水溶液萃取(Ausschütteln)有机溶液或悬浮液转化成无盐形式。此外,脒可作为游离化合物或部分地(如果涉及乙酸,取决于制备)作为乙酸盐或乙酸盐溶剂合物存在。如果在本发明的下述合成中间体和实施例的情况下以相应碱或酸的盐的形式提及化合物,如通过各自的制备和/或提纯方法获得的此类盐的确切化学计量组成通常是未知的。除非更详细地规定,名称和结构式的加缀,如“盐酸盐”、“三氟乙酸盐”、“钠盐”或“xHCl”、“xCF3COOH”、“xNa+”在此类盐的情况中不应化学计量理解,而是仅对所含的成盐组分具有描述特性。如果合成中间体或实施例或其盐通过所述制备和/或提纯方法以化学计量组成(如果它们具有特定类型)未知的溶剂合物,例如水合物的形式获得,这相应地适用。此外,根据本发明的仲酰胺可作为旋转异构体/异构体混合物存在,特别是在NMR研究中。纯度数值通常基于LC/MS色谱图中的相应峰积分,但也可另外借助1HNMR谱测定。如果没有指出纯度,该纯度通常根据LC/MS色谱图中的自动化峰积分为100%,或尚未明确测定纯度。如果指出<100%的纯度,通常针对纯度校正以理论值的%为单位的收率数据。在含溶剂或受污染的批料中,在形式上(formal)收率可能">100%";在这些情况下不针对溶剂或纯度校正收率。在所有1HNMR谱数据中,化学位移δ以ppm表示。下列段落中给出的1HNMR谱中的质子信号的多重性代表在每种情况下观察到的信号形状,并且没有虑及更高级的信号现象。一般而言,化学位移的数据参照所涉信号的中心。在宽多重峰的情况下,给出区间。被溶剂或水掩盖的信号被暂定(tentativ)赋值或尚未列出。例如由分子部分的快速旋转或由于交换质子造成的严重增宽的信号同样被暂定赋值(通常被称作宽多重峰或宽单重峰)或未列出。在1HNMR谱中,化学体系“2-甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪”的甲基作为单重峰出现(常在DMSO-d6中和在2.40–2.60ppm的范围内)并因此清晰可辨、被溶剂信号叠加或完全在溶剂信号下。如果给出熔点和熔点范围,它们是未校正的。对于下文未明确描述其制备的所有反应物或试剂,它们购自一般可获取的来源。对于下文同样未描述其制备并且不可购得或获自通常不可获取的来源的所有其它反应物或试剂,参考描述了它们的制备的公开文献。起始化合物和中间体:实施例1A3-[(2,6-二氟苄基)氧基]-5-甲基吡嗪-2-胺将4.86g叔丁醇钾(43.3毫摩尔,3.0当量)加入到2.71克(2,6-二氟苯基)甲醇[CAS号:19064-18-7](18.8毫摩尔,1.3当量)在120毫升1,2-二甲氧基乙烷中的溶液中,将该混合物在室温下搅拌60分钟。然后加入2.602-氨基-3-氯-5-甲基吡嗪盐酸盐[CAS号:89182-14-9](14.4毫摩尔,1.0当量),并将该混合物在80℃下搅拌整夜。冷却到室温后,加入饱和碳酸氢钠水溶液并用二氯甲烷萃取水相三次。合并的有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤,用硫酸镁干燥,过滤并浓缩。残留物通过BiotageIsolera(340g硅胶滤筒,环己烷/乙酸乙酯梯度,10%→72%乙酸乙酯)提纯。这产生1.77g标题化合物(理论值的39%,纯度85%)。LC-MS(方法2):Rt=0.94minMS(ESpos):m/z=252(M+H)+1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]=2.20(s,3H),5.35(s,2H),5.88(s,2H),7.09-7.23(m,2H),7.37(s,1H),7.46-7.57(m,1H)。实施例2A8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酸乙酯将4A分子筛和11.1克2-氯乙酰乙酸乙酯[CAS号:609-15-4](70.5毫摩尔,10当量)加入到1.77g来自实施例1A的3-[(2,6-二氟苄基)氧基]-5-甲基吡嗪-2-胺(7.05毫摩尔,1.0当量)在50ml乙醇中的溶液中,在回流下加热整夜。然后加入11.1克2-氯乙酰乙酸乙酯(70.5毫摩尔,10.0当量),并在回流下加热整夜。然后过滤,浓缩滤液,将所得残余物与二乙醚搅拌并滤出,浓缩滤液。残余物通过BiotageIsolera(120g硅胶滤筒,环己烷/乙酸乙酯梯度)提纯两次。分离出0.81g标题化合物(理论值的16%,纯度52%)。LC-MS(方法2):Rt=1.28minMS(ESpos):m/z=362(M+H)+。实施例3A8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酸将5.8毫升1N氢氧化钠水溶液(5.8毫摩尔,5当量)加入到800毫克来自实施例2A的8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酸乙酯(纯度52%,1.15毫摩尔,1.0当量)在10ml二氧杂环己烷中的溶液中,在室温下搅拌2小时。然后浓缩该混合物,残余物置于水中,滤出不溶性固体。滤液用1N盐酸水溶液酸化,滤出形成的固体并干燥。分离出354毫克标题化合物(理论值的83%,纯度90%)。LC-MS(方法2):Rt=0.99minMS(ESpos):m/z=334(M+H)+1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]=2.41(s,3H),2.54(s,3H掩盖在该溶剂信号下),5.55(s,2H),7.12-7.28(m,2H),7.49-7.64(m,1H),8.64(s,1H),13.20-13.66(brs,1H)。实施例4Arac-2-氨基-2-甲基(4,4,4-2H3)丁腈将2.0克(26.62毫摩尔)(4,4,4-2H3)丁-2-酮[CAS登记号:53389-26-7]最初装载在22.3毫升在甲醇中的2N氨中,在室温下加入1.72克(35.14毫摩尔)氰化钠和1.88克(35.14毫摩尔)氯化铵并在回流下搅拌4小时。将反应混合物冷却,加入40毫升二乙醚并滤出所含的固体。在标准压力下从滤液中蒸馏出溶剂。作为残留物获得2.75克标题化合物(理论值的51%,纯度大约50%),其不经进一步提纯即用于后续阶段。GC-MS(方法14):Rt=1.66minMS(ESpos):m/z=86(M-CH3)+。实施例5Arac-[2-氰基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯将2.75克(13.59毫摩尔,纯度大约50%)来自实施例4A的rac-2-氨基-2-甲基(4,4,4-2H3)丁腈最初装载在33毫升四氢呋喃/水=9/1中并加入5.82克(42.13毫摩尔)碳酸钾。在0℃下,逐滴缓慢加入2.32克(13.59毫摩尔)氯甲酸苄酯。然后在搅拌下缓慢升温至室温并在室温下搅拌整夜。滗析出上清液溶剂,该残留物用每次25毫升四氢呋喃搅拌两次,然后每次滗析出上清液溶剂。将合并的有机相浓缩,粗产物通过硅胶色谱法提纯(流动相梯度:环己烷至环己烷/二氯甲烷梯度1/1至1/2)。这产生2.56克标题化合物(理论值的78%)。LC-MS(方法2):Rt=0.89minMS(ESpos):m/z=236(M+H)+1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]=1.51(s,3H),1.75-1.91(m,2H),5.08(s,2H),7.28-7.42(m,5H),7.96(br.s,1H)。实施例6Aent-[2-氰基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体A)2.56克来自实施例5A的rac-[2-氰基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯通过在手性相上的制备型分离而分离成对映体[柱:DaicelChiralcelOJ-H,5µm,250x20mm,洗脱液:70%异己烷、30%异丙醇,流速:15ml/min,温度:47℃,检测:220nm]。对映体A:1.03克(>99%ee)Rt=7.11min[DaicelChiralcelOJ-H,250x4.6mm,5µm,洗脱液:70%异己烷、30%异丙醇,流速:1ml/min,温度:50℃,检测:220nm]。实施例7Aent-[2-氰基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体B)2.56克来自实施例5A的rac-[2-氰基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯通过在手性相上的制备型分离而分离成对映体[柱:DaicelChiralcelOJ-H,5µm,250x20mm,洗脱液:70%异己烷、30%异丙醇,流速:15ml/min,温度:47℃,检测:220nm]。对映体B:0.99克(>99%ee)Rt=8.25min[DaicelChiralcelOJ-H,250x4.6mm,5µm,洗脱液:70%异己烷、30%异丙醇,流速:1ml/min,温度:50℃,检测:220nm]。实施例8Aent-[1-氨基-2-甲基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体A)将0.50克(2.13毫摩尔)来自实施例6A的ent-[2-氰基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体A)溶解在10毫升在甲醇中的7N氨溶液中,并在氩气下加入0.79克雷尼镍(50%水性浆料)。该反应混合物在高压釜中在20-30巴下氢化3小时。该反应混合物经硅藻土过滤,用甲醇冲洗并浓缩。这产生387毫克(理论值的75%)目标化合物,其不经进一步提纯即用于下一步骤。LC-MS(方法2):Rt=0.50minMS(ESpos):m/z=240(M+H)+。实施例9Aent-[1-氨基-2-甲基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体B)将0.50克(2.13毫摩尔)来自实施例7A的ent-[2-氰基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体B)溶解在10毫升在甲醇中的7N氨溶液中,并在氩气下加入0.79克雷尼镍(50%水性浆料)。该反应混合物在高压釜中在20-30巴下氢化3小时。该反应混合物经硅藻土过滤,用甲醇冲洗并浓缩。这产生487毫克(理论值的94%)目标化合物,其不经进一步提纯即用于下一步骤。LC-MS(方法2):Rt=0.53minMS(ESpos):m/z=240(M+H)+。实施例10Arac-2-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁腈将13.0克(90.10毫摩尔)4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-酮[可购得或可根据R.Acerete等人JournalofOrganicChemistry2011,76,10129-10139合成而得]最初装载在25毫升在甲醇中的7N氨中,在室温下加入5.83克(118.93毫摩尔)氰化钠和6.36克(118.93毫摩尔)氯化铵并在回流下搅拌3小时。将反应混合物冷却并滤出所含的固体。该滤液不经进一步提纯即用于下一步骤。实施例11Arac-[2-氰基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯将来自实施例10A的rac-2-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁腈的粗制溶液最初装载在16毫升水中,并加入37.36克(270.35毫摩尔)碳酸钾。在0℃下,逐滴缓慢加入23.06克(135.18毫摩尔)氯甲酸苄酯。然后在搅拌下缓慢升温至室温,并在室温下搅拌整夜。过滤该反应混合物,残留物用四氢呋喃多次洗涤。将滤液浓缩,该粗产物通过硅胶色谱法提纯(流动相:环己烷/乙酸乙酯=9/1)。这产生11.60克标题化合物(经2个步骤,理论值的42%)。LC-MS(方法2):Rt=1.23minMS(ESpos):m/z=305(M+H)+1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]=-0.01(s,9H),0.45-0.67(m,2H),1.52(s,3H),1.73-1.90(m,2H),2.24-2.52(m,2H),5.08(s,2H),7.29-7.44(m,5H),7.94(br.s,1H)。实施例12Aent-[2-氰基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体A)10.0克来自实施例11A的rac-[2-氰基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯通过在手性相上的制备型分离而分离成对映体[柱:DaicelChiralpakAY-H,5µm,250x20mm,洗脱液:15%乙醇,85%异己烷,流速:20ml/min,温度:30℃,检测:220nm]。对映体A:4.19克(>99%ee)Rt=5.24min[DaicelChiralpakAY-H,250x4.6mm,5µm,洗脱液:10%乙醇,90%异己烷,流速:1ml/min,温度:45℃,检测:220nm]。实施例13Aent-[2-氰基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体B)10.0克来自实施例11A的rac-[2-氰基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯通过在手性相上的制备型分离而分离成对映体[柱:DaicelChiralpakAY-H,5µm,250x20mm,洗脱液:15%乙醇,85%异己烷,流速:20ml/min,温度:30℃,检测:220nm]。对映体B:4.24克(>99%ee)Rt=6.89min[DaicelChiralpakAY-H,250x4.6mm,5µm,洗脱液:10%乙醇,90%异己烷,流速:1ml/min,温度:45℃,检测:220nm]。实施例14Aent-[1-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体A)将2.0克(6.57毫摩尔)来自实施例12A的ent-[2-氰基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体A)溶解在31毫升在甲醇中的7N氨溶液中,并在氩气下加入2.44克雷尼镍(50%水性浆料)。该反应混合物在高压釜中在20-30巴下氢化3小时。该反应混合物经硅藻土过滤,用甲醇冲洗并浓缩。这产生1.80克(理论值的87%,纯度98%)目标化合物,其不经进一步提纯即用于下一步骤。LC-MS(方法16):Rt=1.66minMS(ESpos):m/z=309(M+H)+。实施例15Aent-[1-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体B)将2.0克(6.57毫摩尔)来自实施例13A的ent-[2-氰基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体B)溶解在31ml在甲醇中的7N氨溶液中,在氩气下加入2.44克雷尼镍(50%水性浆料)。该反应混合物在高压釜中在20-30巴下氢化3小时。该反应混合物经硅藻土过滤,用甲醇冲洗并浓缩。这产生1.72克(理论值的83%,纯度98%)目标化合物,其不经进一步提纯即用于下一步骤。LC-MS(方法2):Rt=0.78minMS(ESpos):m/z=309(M+H)+。实施例16Aent-{1-[({8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基}羰基)氨基]-2-甲基(4,4,4-2H3)丁-2-基}氨基甲酸苄酯三氟乙酸盐(对映体A)将50毫克(0.15毫摩尔)来自实施例3A的8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酸与63毫克(0.17毫摩尔)HATU和0.13毫升(0.75毫摩尔)N,N-二异丙基乙胺最初装载在0.5毫升DMF中并在室温下搅拌10分钟。然后将44毫克(0.18毫摩尔;纯度88%)来自实施例8A的ent-[1-氨基-2-甲基(4,4,4-2H3)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体A)加入到该反应溶液中并在室温下搅拌2小时。然后用乙腈和水稀释,加入TFA并通过制备型HPLC提纯(RP18柱,流动相:乙腈/水梯度,添加0.1%TFA)。合并产物级分,浓缩并冻干。这产生56毫克目标化合物(理论值的53%;纯度95%)。LC-MS(方法2):Rt=1.29minMS(ESpos):m/z=555(M-TFA+H)+。实施例17Aent-{1-[({8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基}羰基)氨基]-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基}氨基甲酸苄酯三氟乙酸盐(对映体A)将60毫克(0.18毫摩尔)来自实施例3A的8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酸与75毫克(0.20毫摩尔)HATU和0.16毫升(0.90毫摩尔)N,N-二异丙基乙胺最初装载在0.6毫升DMF中并在室温下搅拌10分钟。然后将91毫克(0.29毫摩尔)来自实施例14A的ent-[1-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体A)加入到该反应溶液中并在室温下搅拌2小时。然后用乙腈和水稀释,加入TFA并通过制备型HPLC提纯(RP18柱,流动相:乙腈/水梯度,添加0.1%TFA)。合并产物级分,浓缩并冻干。这产生97毫克目标化合物(理论值的73%)。LC-MS(方法2):Rt=1.51minMS(ESpos):m/z=624(M-TFA+H)+。实施例18Aent-{1-[({8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基}羰基)氨基]-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基}氨基甲酸苄酯三氟乙酸盐(对映体B)将60毫克(0.18毫摩尔)来自实施例3A的8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酸与75毫克(0.20毫摩尔)HATU和0.16毫升(0.90毫摩尔)N,N-二异丙基乙胺最初装载在0.6毫升DMF中并在室温下搅拌10分钟。然后将91毫克(0.29毫摩尔)来自实施例15A的ent-[1-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基]氨基甲酸苄酯(对映体B)加入到该反应溶液中并在室温下搅拌2小时。然后用乙腈和水稀释,加入TFA并通过制备型HPLC提纯(RP18柱,流动相:乙腈/水梯度,添加0.1%TFA)。合并产物级分,浓缩并冻干。这产生94毫克目标化合物(理论值的70%)。LC-MS(方法2):Rt=1.51minMS(ESpos):m/z=624(M-TFA+H)+。实施例19Arac-2-氨基-2-[2-(二氟甲基)-2H-四唑-5-基]丙-1-醇可以根据文献中已知的方法通过在室温下在THF中使用四丁基氟化铵(TBAF)将1-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-[2-(二氟甲基)-2H-四唑-5-基]丙烷-2-胺(可类似于WO2014/084312中的中间体300由外消旋原材料制备)脱保护来制备目标化合物。实施例实施例1ent-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-N-[(2S)-1-羟基-2-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙-2-基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酰胺30毫克(0.09毫摩尔)来自实施例3A的8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酸与37毫克(0.10毫摩尔)HATU和123微升(0.71毫摩尔)N,N-二异丙基乙胺一起最初装载在0.34毫升DMF中,并在室温下搅拌10分钟。然后将101毫克(0.35毫摩尔)(2S)-2-氨基-2-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙-1-醇(可类似于WO2014/084312中的中间体307制备)加入到该反应溶液中,在60℃下搅拌2小时。然后用乙腈和水稀释,加入TFA并通过制备型HPLC提纯(RP18柱,流动相:乙腈/水梯度,添加0.1%TFA)。合并产物级分并浓缩。随后,残余物置于二氯甲烷和少量甲醇中,用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。水相用二氯甲烷萃取两次。合并的有机相经硫酸钠干燥,过滤,浓缩并冻干。这产生28毫克目标化合物(理论值的64%;纯度98%)。LC-MS(方法2):Rt=0.94minMS(ESpos):m/z=489(M+H)+1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=1.81(s,3H),2.35(s,3H),2.59(s,3H),2.69(s,3H),3.82-3.97(m,2H),5.45(t,1H),5.56(s,2H),7.18-7.26(m,2H),7.52-7.62(m,1H),8.27(s,1H),8.31(s,1H)。实施例2rac-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-N-{2-[2-(二氟甲基)-2H-四吡-5-基]-1-羟基丙-2-基}-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酰胺将40毫克(0.12毫摩尔)来自实施例3A的8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酸与47毫克(0.12毫摩尔)HATU和102微升(0.59毫摩尔)N,N-二异丙基乙胺最初装载在0.5毫升DMF中,并在室温下搅拌10分钟。然后将25毫克(0.13毫摩尔)来自实施例19A的rac-2-氨基-2-[2-(二氟甲基)-2H-四吡-5-基]丙-1-醇加入到该反应溶液中,在60℃下搅拌2小时。然后用乙腈和水稀释,加入TFA并通过制备型HPLC提纯(RP18柱,流动相:乙腈/水梯度,添加0.1%TFA)。合并产物级分并浓缩。随后,残余物置于二氯甲烷和少量甲醇中,用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。水相用二氯甲烷萃取两次。合并的有机相经硫酸钠干燥,过滤,浓缩并冻干。这产生33毫克目标化合物(理论值的55%)。LC-MS(方法2):Rt=1.03minMS(ESpos):m/z=509(M+H)+1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=1.83(s,3H),2.34(s,3H),2.59(s,3H),3.82-3.99(m,2H),5.34(t,1H),5.55(s,2H),7.17-7.26(m,2H),7.52-7.62(m,1H),8.18(s,1H),8.34(s,1H),8.58(t,1H)。实施例3ent-N-[2-氨基-2-甲基(4,4,4-2H3)丁基]-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酰胺(对映体A)将56毫克(0.08毫摩尔;纯度95%)来自实施例16A的ent-{1-[({8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基}羰基)氨基]-2-甲基(4,4,4-2H3)丁-2-基}氨基甲酸苄酯三氟乙酸盐(对映体A)溶解在2.7毫升乙醇中,并在氩气下加入30微升(0.40毫摩尔)TFA和6毫克(0.001毫摩尔)10%载钯活性炭,在标准压力下氢化2小时。将反应溶液使用Millipore过滤器过滤,用乙醇洗涤并浓缩滤液。将乙腈、水和TFA加入到残留物中,通过制备型HPLC提纯(RP18柱,流动相:乙腈/水梯度,添加0.1%TFA)。合并产物级分并浓缩。随后,残余物置于二氯甲烷和少量甲醇中,用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。水相用二氯甲烷萃取两次。合并的有机相经硫酸钠干燥,过滤并浓缩。这产生31毫克目标化合物(理论值的90%)。LC-MS(方法2):Rt=0.70minMS(ESpos):m/z=421(M+H)+1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=0.98(s,3H),1.28-1.38(m,2H),1.41(br.s,2H),2.34(s,3H),3.15-3.28(m,2H),5.55(s,2H),7.18-7.25(m,2H),7.52-7.62(m,1H),7.82(br.s,1H),8.38(s,1H),[进一步的信号隐藏在溶剂信号下]。实施例4ent-N-[2-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁基]-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酰胺(对映体A)将97毫克(0.13毫摩尔)来自实施例17A的ent-{1-[({8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基}羰基)氨基]-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基}氨基甲酸苄酯三氟乙酸盐(对映体A)溶解在4.5毫升乙醇中,并在氩气下加入51微升(0.66毫摩尔)TFA和1.5毫克(0.001毫摩尔)10%载钯活性炭,标准压力下氢化2小时。将反应溶液使用Millipore过滤器过滤,用乙醇洗涤并浓缩滤液。将乙腈、水和TFA加入到残留物中,通过制备型HPLC提纯(RP18柱,流动相:乙腈/水梯度,添加0.1%TFA)。合并产物级分并浓缩。随后,残余物置于二氯甲烷和少量甲醇中,用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。水相用二氯甲烷萃取两次。合并的有机相经硫酸钠干燥,过滤并浓缩。这产生58毫克目标化合物(理论值的88%)。LC-MS(方法17):Rt=2.79minMS(ESpos):m/z=490(M+H)+1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=-0.04(s,9H),0.42-0.60(m,2H),0.98(s,3H),1.22-1.38(m,2H),1.70(br.s,2H),2.34(s,3H),3.17-3.28(m,2H),5.54(s,2H),7.17-7.25(m,2H),7.52-7.62(m,1H),7.83(br.s,1H),8.37(s,1H),[进一步的信号隐藏在溶剂信号下]。实施例5ent-N-[2-氨基-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁基]-8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-甲酰胺(对映体B)将93毫克(0.13毫摩尔)来自实施例18A的ent-{1-[({8-[(2,6-二氟苄基)氧基]-2,6-二甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基}羰基)氨基]-2-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)丁-2-基}氨基甲酸苄酯三氟乙酸盐(对映体B)溶解在4.3毫升乙醇中,并在氩气下加入49微升(0.63毫摩尔)TFA和1.4毫克(0.001毫摩尔)10%载钯活性炭,在标准压力下氢化2小时。将反应溶液使用Millipore过滤器过滤,用乙醇洗涤并浓缩滤液。将乙腈、水和TFA加入到残留物中,通过制备型HPLC提纯(RP18柱,流动相:乙腈/水梯度,添加0.1%TFA)。合并产物级分并浓缩。随后,残余物置于二氯甲烷和少量甲醇中,用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。水相用二氯甲烷萃取两次。合并的有机相经硫酸钠干燥,过滤并浓缩。这产生52毫克目标化合物(理论值的82%)。LC-MS(方法17):Rt=2.80minMS(ESpos):m/z=490(M+H)+1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=-0.04(s,9H),0.42-0.60(m,2H),0.98(s,3H),1.22-1.38(m,2H),1.54(br.s,2H),2.34(s,3H),3.17-3.28(m,2H),5.54(s,2H),7.17-7.25(m,2H),7.51-7.62(m,1H),7.82(br.s,1H),8.37(s,1H),[进一步的信号隐藏在溶剂信号下]。B.药理效力的评估使用下列缩写:ATP三磷酸腺苷Brij35聚氧乙烯(23)十二烷基醚BSA牛血清白蛋白DTT二硫苏糖醇TEA三乙醇胺。可以在下列检测中证实本发明的化合物的药理作用:B-1.借助PPi检测测量sGC酶活性可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)在受刺激时将GTP转化成cGMP和焦磷酸盐(PPi)。借助WO2008/061626中描述的方法检测PPi。该检测中产生的信号随反应进行提高并充当sGC酶活性的量度。借助PPi参考曲线,该酶可以以已知方式表征,例如在转化率、可刺激性或米氏常数方面。该试验的实施为了进行该试验,最初将29微升酶溶液(0-10nM可溶性鸟苷酸环化酶(根据Hönicka等人,JournalofMolecularMedicine77(1999)14-23制备),在50mMTEA、2mM氯化镁、0.1%BSA(组分V)、0.005%Brij35中,pH7.5)装载在微板中,并加入1微升刺激物溶液(0-10µM3-吗啉代斯德酮亚胺,SIN-1,Merck在DMSO中)。在室温下培养10分钟。然后加入20微升检测混合物(1.2nM荧火虫荧光素酶(Photinuspyralisluziferase,Promega)、29µM脱氢荧光素(根据Bitler&McElroy,Arch.Biochem.Biophys.72(1957)358制备)、122μM荧光素(Promega)、153μMATP(Sigma)和0.4mMDTT(Sigma),在50mMTEA、2mM氯化镁、0.1%BSA(组分V)、0.005%Brij35中,pH7.5)。通过添加20微升底物溶液(1.25mM5’-三磷酸鸟苷(Sigma),在50mMTEA、2mM氯化镁、0.1%BSA(组分V)、0.005%Brij35中,pH7.5),启动酶反应并在光度计中连续测量。B-2.对重组鸟苷酸环化酶报告细胞系的作用如F.Wunder等人,Anal.Biochem.339,104-112(2005)中所述,在重组鸟苷酸环化酶报告细胞系上测定本发明的化合物的细胞效应。本发明的化合物的代表性MEC值(MEC=最低有效浓度)显示在下表中(在一些情况下作为各测定的平均值):。B-3.体外血管舒张作用将兔子在颈背上敲昏并放血。取出主动脉,除去粘附组织,分割成1.5毫米宽的环,在预加应力下单独地置于5毫升器官浴槽中,该器官浴槽含有具有下列组成(各自为mM)的37℃温热的卡波金(Carbogen)加气的Krebs-Henseleit溶液:氯化钠:119;氯化钾:4.8;二水合氯化钙:1;七水合硫酸镁:1.4;磷酸二氢钾:1.2;碳酸氢钠:25;葡萄糖:10。用StathamUC2细胞测定收缩力,放大并使用A/D转换器(DAS-1802HC,KeithleyInstrumentsMünchen)数字化,并行记录在线性记录器上。为了产生收缩,将苯肾上腺素以递增浓度的方式累积添加到该浴槽中。在几个对照周期后,在每一个进一步流程中每次以递增剂量加入待研究的物质并将收缩量级(Höhe)与在前一个流程中实现的收缩量级比较。由此计算为了将控制值的量级降低50%所需的浓度(IC50值)。标准施加体积为5微升;浴溶液中的DMSO含量相当于0.1%。B-4.麻醉大鼠的血压测量用戊硫代巴比妥(100mg/kg腹腔)将体重300-350克的雄性Wistar大鼠麻醉。在气管切开术后,在股动脉中插入导管以测量血压。受试物质以溶液形式借助管饲法经口给药或经股静脉在静脉内给药(Stasch等人Br.J.Pharmacol.2002;135:344-355)。B-5.清醒的自发性高血压大鼠的血压的无线电遥测来自DATASCIENCESINTERNATIONALDSI,USA的市售遥测系统用于对下述清醒大鼠的血压测量。该系统由3个主要部件构成:可植入发射器(Physiotel®遥测发射器)接收器(Physiotel®接收器),其经多路转换器(DSIDataExchangeMatrix)与数据采集计算机相连。该遥测系统能够连续记录清醒动物在它们的惯常生活空间中的血压、心率和身体活动。动物材料对体重>200克的成年雌性自发性高血压大鼠(SHROkamoto)进行研究。来自OkamotoKyotoSchoolofMedicine,1963的SHR/NCrl是血压极大提高的雄性WistarKyoto大鼠和血压略微提高的雌性大鼠的杂交品种,并在F13移交给U.S.NationalInstitutesofHealth。在发射器植入后,将实验动物单独饲养在Macrolon3型笼子中。它们可自由地获得标准饲料和水。在早上6:00和晚上19:00通过室内照明更替实验室中的日夜节律。发射器植入在初次实验使用前的至少14天,在无菌条件下在实验动物中手术植入所用TA11PA–C40遥测发射器。在伤口愈合和植入物稳定后,由此安装仪器的动物可以重复使用。为了植入,用戊巴比妥(耐波他,Sanofi:50mg/kg腹腔)将禁食动物麻醉并在腹部的大面积上刮毛和消毒。在沿白线打开腹腔后,在分叉点上方沿颅骨方向将该系统的充满液体的测量导管插入降主动脉中并用组织粘合剂(VetBonDTM,3M)固定。将发射器外壳在腹膜内固定到腹壁肌肉上并逐层闭合伤口。手术后施加抗生素(TardomyocelCOMP,Bayer1ml/kg皮下)以防止感染。物质和溶液除非另行指定,待研究的物质在每种情况下通过管饲法经口给予一组动物(n=6)。根据5毫升/千克体重的给药体积,将受试物质溶解在合适的溶剂混合物中或悬浮在0.5%纤基乙酸钠(Tylose)中。经溶剂处理过的动物组用作对照。实验程序为24个动物配置所存在的遥测装置。各实验记录在实验号下(V年月日)。生活在该系统中的带有仪器的大鼠各自配有自己的接收天线(1010Receiver,DSI)。植入的发射器可借助内置磁开关从外激活。在实验起动时,将它们切换至发射。可通过数据采集系统(DataquestTMA.R.T.forWINDOWS,DSI)在线检测发射的信号并相应地加工。数据在每种情况下储存在为此创建并带有实验号的文件夹中。在标准程序中,下列这些各测量10秒:收缩血压(SBP)舒张血压(DBP)平均动脉压(MAP)心率(HR)活动力(ACT)。在计算机控制下以5分钟为间隔重复采集测量值。在图表中用当前测得的气压(AmbientPressureReferenceMonitor;APR-1)校正作为绝对值获得的源数据并储存为独立数据。在来自制造商公司(DSI)的大量文件中给出进一步技术细节。除非另行指明,在实验日在9:00施用受试物质。在施用后,经24小时测量上述参数。评测在实验结束后,采集的各独立数据用分析软件(DATAQUESTTMA.R.T.TMANALYSIS)分类。空白值在此假定为施用前2小时,因此所选数据集包含从实验日的7:00到第二天的9:00的时期。通过平均值的测定(15分钟平均值)在可预定的时期内使数据平滑并作为文本文件转移到数据载体中。将由此预分类和压缩的测量值转移到Excel模板中并制表。对于每个实验日,将所得数据储存在带有实验号的专用文件夹中。结果和试验程序以凭号码分类的纸件形式归档。文献:KlausWitte,KaiHu,JohannaSwiatek,ClaudiaMüssig,GeorgErtlandBjörnLemmer:Experimentalheartfailureinrats:effectsoncardiovascularcircadianrhythmsandonmyocardialβ-adrenergicsignaling.CardiovascRes47(2):203-405,2000;KozoOkamoto:Spontaneoushypertensioninrats.IntRevExpPathol7:227-270,1969;MaartenvandenBuuse:CircadianRhythmsofBloodPressure,HeartRate,andLocomotorActivityinSpontaneouslyHypertensiveRatsasMeasuredWithRadio-Telemetry.Physiology&Behavior55(4):783-787,1994。B-6.在静脉和口服给药后的药代动力学参数的测定在雄性CD-1小鼠、雄性Wistar大鼠和雌性比格犬中测定本发明的化合物的药代动力学参数。在小鼠和大鼠的情况下借助物种特异性的血浆/DMSO制剂,在犬的情况下借助水/PEG400/乙醇制剂进行静脉给药。在所有物种中,基于水/PEG400/乙醇制剂,通过管饲法进行溶解物质的口服给药。在物质给药前将有机硅导管插入大鼠的右颈外静脉中,以简化采血。在实验前至少一天用异氟烷麻醉法并给予止痛剂(阿托品/力莫敌(3/1)0.1ml皮下)进行手术。在包括物质给药后至少24至最多72小时的终端时间点的时间范围内采血(通常多于10个时间点)。在采血时将血液导入肝素化的管中。然后通过离心获得血浆;如果需要,将其储存在-20℃下直至进一步加工。将内标(其也可以是化学无关的物质)添加到本发明的化合物的样品、校准样品和定性物(Qualifier)中,然后借助过量乙腈沉淀蛋白质。添加与LC条件匹配的缓冲液和随后涡旋后,以1000g离心。使用C18反相柱和可变洗脱液混合物通过LC-MS/MS分析上清液。通过来自特定选择的离子监测实验的提取离子色谱图的峰高度或峰面积量化物质。使用测得的血浆浓度/时间曲线图,借助核准的药代动力学计算程序计算药代动力学参数,如AUC、Cmax、t1/2(终末半衰期)、F(生物利用度)、MRT(平均停留时间)和CL(清除率)。由于在血浆中进行物质量化,必须测定该物质的血液/血浆分布以便能相应地调节药代动力学参数。为此,在翻滚(Taumelrollen)混合机中将特定量的物质在所涉物种的肝素化全血中培养20分钟。在以1000g离心后,测量血浆浓度(借助LC-MS/MS;见上文)并通过形成商得到C血液/C血浆值。B-7.代谢研究为了测定本发明的化合物的代谢状况,用重组人细胞色素P450(CYP)酶、肝微粒体或来自各种动物物种(例如大鼠、狗)以及人类来源的原发性新鲜肝细胞培养它们,以获得和比较关于尽可能完整的肝期I和肝期II代谢和关于参与代谢的酶的信息。以大约0.1-10µM的浓度培养本发明的化合物。为此,制备具有0.01-1mM浓度的本发明的化合物在乙腈中的储液,然后以1:100稀释度吸移到培养混合物(Ansatz)中。肝微粒体和重组酶在37℃下在含和不含由1mMNADP+、10mM6-磷酸葡萄糖和1单位6-磷酸葡萄糖脱氢酶构成的NADPH生成体系的50mM磷酸钾缓冲液pH7.4中培养。原发性肝细胞同样在37℃下悬浮在WilliamsE培养基中培养。在0-4小时培养时间后,用乙腈终止该培养混合物(最终浓度大约30%),并在大约15000xg下离心出蛋白质。由此终止的样品直接分析或储存在-20℃直至分析。通过在紫外线和质谱检测下的高效液相色谱法(HPLC-UV-MS/MS)进行分析。为此,培养样品的上清液用合适的C18反相柱和由乙腈和10mM甲酸铵水溶液或0.05%甲酸构成的可变洗脱液混合物进行色谱分离。与质谱数据联合的UV色谱图用于代谢物的识别、结构解析和定量估测以及用于本发明的化合物在培养混合物中的定量代谢减少(Abnahme)。B-8.Caco-2渗透性试验借助Caco-2细胞系——用于胃肠屏障的渗透性预测的公认体外模型(Artursson,P.和Karlsson,J.(1991)Correlationbetweenoraldrugabsorptioninhumansandapparentdrugpermeabilitycoefficientsinhumanintestinalepithelial(Caco-2)cells.Biochem.Biophys.175(3),880-885)测定受试物质的渗透性。将Caco-2细胞(ACCNo.169,DSMZ,德国微生物和细胞培养收藏室,Braunschweig,德国)播种在具有插件(Einsatz)的24孔板中并培养14至16天。对于渗透性研究,将受试物质溶解在DMSO中并用转移缓冲液(HanksBufferedSaltSolution,Gibco/Invitrogen,含19.9mM葡萄糖和9.8mMHEPES)稀释至最终试验浓度。为了测定受试物质从顶端到基底外侧的渗透性(PappA-B),将包含受试物质的溶液施加到Caco-2细胞单层的顶面上,并将转移缓冲液施加到基底外侧面上。为了测定受试物质从基底外侧到顶端的渗透性(PappB-A),将包含受试物质的溶液施加到Caco-2细胞单层的基底外侧面上,并将转移缓冲液施加到顶面上。在实验开始时,从各自的供体隔室中取样以确保质量平衡。在37℃下2小时培养时间后,从两个隔室中取样。借助LC-MS/MS分析样品并计算表观渗透系数(Papp)。对于各细胞单层,测定荧光黄的渗透性以确保细胞层完整性。在各试验流程中,也测定阿替洛尔(用于低渗透性的标记物)和柳氮磺胺吡啶(用于主动排泄的标记物)的渗透性作为定性对照。B-9.hERG钾电流测定所谓的hERG(人ether-a-go-go相关基因)钾电流对人心肌动作电位的复极化作出显著贡献(Scheel等人,2011)。通过药物抑制这种电流可能在少数情况下造成潜在致死的心律失常,因此在药物开发过程中早期研究。此处使用的功能hERG测定是基于稳定表达KCNH2(HERG)基因的重组HEK293细胞系(Zhou等人,1998)。在控制膜电压并在室温下测量hERG钾电流的自动化系统(PatchlinerTM;Nanion,München,德国)中借助"全细胞电压钳"技术(Hamill等人,1981)研究这些细胞。PatchControlHTTM软件(Nanion)控制该Patchliner系统、数据采集和数据分析。通过受PatchMasterProTM软件控制的2个EPC-10quadro放大器控制电压(两者都:HEKAElektronik,Lambrecht,德国)。具有中等电阻(~2MΩ;Nanion)的NPC-16芯片充当电压钳实验的平面基底。向NPC-16芯片填充细胞内和细胞外溶液(参见Himmel,2007)以及填充细胞悬浮液。在形成千兆欧姆封接和建立全细胞模式后(包括几个自动化质量控制步骤),在-80mV保持电位下钳住细胞膜。后续电压钳程序将命令电压改变成+20mV(持续1000ms)、-120mV(持续500ms)并恢复成-80mV保持电位;这每12秒重复一次。在初始稳定期(大约5-6分钟)后,通过吸移管以递增浓度(例如0.1、1和10µmol/l)引入受试物质溶液(每一浓度暴露大约5-6分钟),接着进行几个洗涤步骤。由从+20mV到-120mV的电位变化生成的内向性“尾”电流的幅值用于量化hERG钾电流并随时间描绘(IgorProTM软件)。在各时间间隔(例如受试物质前的稳定期、受试物质的第一/第二/第三浓度)结束时的电流幅值用于建立浓度/效应曲线,由其计算受试物质的半峰抑制浓度IC50。HamillOP,MartyA,NeherE,SakmannB,SigworthFJ.Improvedpatch-clamptechniquesforhigh-resolutioncurrentrecordingfromcellsandcell-freemembranepatches.PfluegersArch1981;391:85-100。HimmelHM.Suitabilityofcommonlyusedexcipientsforelectrophysiologicalin-vitrosafetypharmacologyassessmentofeffectsonhERGpotassiumcurrentandonrabbitPurkinjefiberactionpotential.JPharmacolToxicolMethods2007;56:145-158。ScheelO,HimmelH,Rascher-EggsteinG,KnottT.Introductionofamodularautomatedvoltage-clampplatformanditscorrelationwithmanualhumanether-a-go-gorelatedgenevoltage-clampdata.AssayDrugDevTechnol2011;9:600-607。ZhouZF,GongQ,YeB,FanZ,MakielskiJC,RobertsonGA,JanuaryCT.PropertiesofhERGchannelsstablyexpressedinHEK293cellsstudiedatphysiologicaltemperature.BiophysJ1998;74:230-241。...
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