用于增强的CGH分析的方法、载体和试剂盒与流程

文档序号:14267681阅读:580来源:国知局
用于增强的CGH分析的方法、载体和试剂盒与流程

本发明属于通过比较基因组杂交(cgh)分析染色体失衡的领域。



背景技术:

在比较基因组杂交(cgh)领域,微阵列的引入提供了优于常规细胞遗传学分析的明显优势,因为它们具有检测被调查的整个基因组上的大部分显微和亚显微染色体异常的潜力。1染色体分析能够在一个实验中对多种来源的细胞进行,包括外周血淋巴细胞或胎血、卵母细胞或衍生的极体和精子、胚胎的卵裂球以及任何相关的活检样品、绒膜绒毛、羊水细胞、皮肤、骨髓、胎儿组织(例如肺、肝)、实体瘤和腹水。该技术中涉及的现有方法首先意味着从这些细胞中分离出遗传物质。2,3

微阵列高通量技术也在兽医学中发挥潜在的作用,用于开发诊断及预后测试以及鉴定新型的治疗靶标。4

许多研究表明,遗传的染色体畸变可能影响生殖效率,使得多年来在动物育种中取得的成就大打折扣。在过去的40年里,已有数百份科学出版物报道了与临床疾病(主要是生育能力受损)有关的原始染色体异常。全世界每年的染色体分析大约有8,000和10,000例,主要在牛5,6、猪7和马中进行。例如,析通过鉴定引起先天异常、胚胎死亡和不育的染色体畸变,马的细胞遗传学分已使马产业受益,这也突出了染色体在动物繁殖中的角色的近期概念。8,9此外,许多人类和动物疾病具有同一发病基础,因此它们是人类疾病的良好的比较性模型,引发了“同一医学”的概念;存在许多特殊的相互依存的研究领域,其中最接近的一个领域是肿瘤学。10,11

染色体数目不规则性(非整倍性)在培养的有活力的癌细胞中、并且特别在人卵母细胞和胚胎中极为常见,其与自然周期和使用辅助受孕技术的各种负面结果相关。含有错误的染色体数目(非整倍性)的胚胎可能无法植入子宫、流产、或产生有严重医学问题的新生儿。因此,将正常胚胎与非整倍体胚胎区分开的可靠技术对于医师和胚胎学家来说是一种有用的工具,以帮助他们做出正确的选择,这似乎是合理的想法。这个概念已导致了用于检测来自体外受精(ivf)领域的不同样品中的染色体异常的多种方法(常被称为pgs(植入前遗传学筛查))的发展。12,13

pgs是一种通过确保选择用于子宫移植的胚胎是染色体正常的胚胎来寻求改善辅助生殖治疗(例如ivf)结果的方法。遗传学和胚胎学的进展的结合似乎正准备宣告一个治疗不孕症的新时代。特别地,非整倍性测试是用于描述对细胞中存在的染色体数目进行计数的过程的名称,而cgh是已用于检测其存在并鉴定扩增或缺失的dna序列的基因组位置的技术。如果一个细胞不具有恰好46条染色体,则其显然是“非整倍体”。14,15,16

除了出现多余的染色体外,可能还有胚胎中缺失染色体的情况(增益(gain)或损失(loss)是分别描述每个现象的名称)。在大多数情况下,染色体的损失或增益将导致胚胎不能植入或正常生长。在将胚胎移植到母体子宫中或冷冻备用之前对它们进行cgh测试,使得我们能够确定每个胚胎中的染色体数目。

可对通过ivf创建的每个个体胚胎进行测试并对存在的染色体的数量进行计数。这通过以下方式来完成:在胚胎发育的第3天或第5天从胚胎中取出细胞并对这些细胞进行测试来分析它们的遗传状态。胚胎能够容易地用几次细胞分裂来补偿细胞的去除。在状态良好的情况下,胚胎的活检对其生长几乎没有影响,尽管它可能稍微减缓其生长。17,18

除pgs之外,植入前遗传学诊断(pgd)旨在鉴定不具有遗传的遗传学状况的胚胎,这归因于影响基因功能的突变,或影响整个染色体或染色体区域的拷贝数的异常。遗传学正常的胚胎的选择和优先移植有较高的概率使任何建立的妊娠都将是健康的,从而减少了需要考虑终止的可能性,并且在某些情况下有助于根除家庭遗传疾病。19pgs和pgd方案都涉及使用ivf技术产生胚胎,然后进行胚胎物质的活检和测试。

由于移植染色体异常的胚胎不太可能导致健康的活产,因此已建议应该致力于鉴定并优先移植整倍体胚胎。从理论上讲,这种做法应该能够提高ivf后取得的植入率和妊娠率。

在过去的十年中,越来越多的生育诊所采用了染色体筛查策略来帮助识别和移植能生长发育的胚胎。这种方法的目标往往是被认为有较高的风险产生非整倍体卵母细胞和/或胚胎的患者,特别是经历过重复性植入失败(rif)或反复流产的夫妻,或者是在女方处于高生育年龄(ara)并且因此面临雄性因素的情况下。20,21,22

尽管pgs与pgd密切相关,但其临床应用已被证明具有更大的争议。在过去几年中,关于使用荧光原位杂交的pgs的诊断价值、单卵裂球或双卵裂球活检对胚胎存活力的影响、以及卵裂期镶嵌现象对准确诊断整倍性/非整倍性的影响引发了争议。23,24

荧光原位杂交(fish)已成为检查活检物质中的染色体的首选方法,并且已描述了各种方案,其对每个卵母细胞或胚胎的5至12条染色体进行评分。其并不允许对所有23对染色体进行完整的核型分析。25,26

单核苷酸多态性(snp)阵列技术不同于cgh阵列,并且也可以用于测定dna样品中的细胞拷贝数变化。所用的机制是不同的且不需要竞争性比较,该方法依赖于个体等位基因的量化和随后的放射性测量计算。缺点包括噪音水平增加、方案更长、数据解读复杂、对二倍体样品应用有限。27

最近引入了更先进的技术,例如cgh、光谱核型分析、引物原位标记(prins)和肽核酸(pna)技术,这使对所有23对染色体的核型分析成为可能。这些新的方法已证明在时间、技术和成本方面要求都相当高。28

此外,dna微阵列也为该测定提供了高质量的支持,并为大规模分析提供了宝贵的技术。在双通道dna微阵列测定中,从受测细胞和正常的参照细胞中分离出的dna分别用两种不同的荧光染料标记,而后与微阵列载玻片上的固定的dna探针共杂交。在杂交期间,两种带荧光标记的dna(受测dna和参照物dna)竞争与固定的dna探针链的杂交,并且通过某种方式去除或减少重复序列。互补链之间的杂交反应仅在标记的反义链和固定的正义链之间发生。

将两种带荧光标记的dna的强度比用于量化样品中基因组区域的相对水平。该方法很好地用于样品中cnv(拷贝数变异)水平的成对比较。29通过将超过一千种不同的dna探针固定在微阵列上,能够在单个测定中获得样品中所有染色体的相对cnv水平。30,31,32

dna微阵列已在基因发现、疾病诊断、癌症、药物基因组学和毒理学研究中找到应用。它们越来越多地用于需要跨所有样品进行比较的一系列相关样品。33,34

在基因表达中,将处理样品与对照样品进行比较是非常普遍的,其中最天然的参照物是野生型或生物对照,其往往是最丰富的。但是,如果研究的目的是将每个样品与其他样品进行比较,则没有天然对照。一种可靠的替代方式是参照物dna池,其减少了较大误差的数量。一些研究人员对其进行了扩展并创建了源于他们在实验中最常用的几个标准细胞系的“通用参照物”。使用通用参照物使得他们能够对所有实验的结果进行比较。35

为了对多个同等兴趣和高品质的样品进行比较,将每个样品与具有两种不同的染料取向的两种不同的样品中的每一种杂交。这种设计导致了每个估计值的变化减半,因为每个样品出现两次而不是一次,而代价仅仅是多一块芯片。缺点是如果一块芯片失效,或者品质不好,那么所有估计值的误差变化就会加倍。另一方面,只有两个条件能够应用于每个阵列的事实使得设计复杂化,这是因为通常存在多于两个的条件,或者因为不建议将两个样品在一个阵列中直接杂交(因为这会产生dna人工配对)。

两种色彩(竞争杂交斑点)阵列的最常见的设计是“参照设计”。以最简单的方式使每个实验样品与共同的参照样品进行杂交。

尽管使用未扩增的基因组dna作为参照在阵列-cgh中是非常常见的,但由于在两种dna制备物(扩增的样品和未扩增的参照)之间缺乏平衡,在pgs/pgd中的相应应用导致了高噪音水平。因此,如果在此情况下使用了dna参照物池,这种不平衡将会增加。

此情况下经常使用的参照物材料是正常的汇集dna样品,其被稀释到与少量单细胞的dna量大致相当的量。然后,紧接着dna样品,对相应比率的稀释的参照物dna进行平行扩增。尽管使用了这些分子生物学方法,但是将受测dna的性质与参照dna的性质匹配并不总是高效的,并且结果的清晰度常常可发生不明确的变化。证明实验在诊断应用中成功发挥作用的最常见方法是使用内部对照,并且在单个测定中使用具有已知拷贝数变异的参照样品。36

参照样品常常与性染色体不匹配,因此可以保证动态范围的测量。虽然这种方法在很多情况下是可以承担的,但不幸的是在pgs中不适用,因为样品的性别未知,特别是当涉及可能是性别不限的卵裂球或胚泡活检时。

另外,svetlanaa.等在他们的工作中证明:与使用性别错配的参照物dna的阵列cgh相比,使用性别匹配的参照物dna的基于微阵列的cgh对于检测性染色体失衡提供了更高的灵敏度。在阵列-cgh分析中使用性别错配的参照物dna可能会对性染色体特异性探针产生假阳性、假阴性和模棱两可的结果,从而掩盖了潜在的致病性基因组失衡。因此,不推荐使用携带已知拷贝数变异的dna参照物,因为胚胎/卵母细胞的相同变异是不稳定的并且因此是高度可变的。37

或者,有可能使用非人类对照序列,这在理论上是理想的方法,但在实际上是选择能够模拟人类序列行为的准确的基因组序列,并且它们还可能遭受相同的给定扩增偏差。

其余的方案是通过两项常规的cgh实验来分析受测样品,其中一项针对雄性参照物dna,另一项针对雌性参照物dna,这种方法的问题在于应用成本高。

作为对此技术的改进,buffart等38提出了一种被称为“跨阵列杂交”的经改造的阵列-cgh,其中从不同的阵列比较受测dna和样品dna。利用在不同的通道阵列上分析的参照物池来执行阵列-cgh。由于样品阵列内的第二通道不再用于杂交正常的参照物dna,因此能够利用该通道将第二样品杂交到同一阵列。这种方法因消除了染料偏差而在成本和潜在的数据品质方面具有优势,但是不建议将两个样品在一个阵列中直接杂交,因为如上所述会发生dna人工配对。

为了在这种情况下应用cgh测定,需要扩增全基因组以将细胞中可用的少量dna(5-10pg)增加到适合该分析的水平。通常使用的扩增方法包括dop-pcr(多样随机引物策略)或最近的plexysomes技术文库试剂盒,例如genomeplex(rubicongenomics),或采用phy聚合酶试剂盒(repli-g,qiagen)的支化-pcr。

为了获得最佳结果,阵列cgh要求dna参照物和样品都必须在品质和浓度方面达到平衡。值得注意的是,在这种情况下,遗传物质是任何分析的关键点所在,因为它代表每个被分析细胞。目前,可以从极体、卵裂球(卵裂期胚胎)或滋养外胚层活检(体外胚胎发育阶段的第5第6天)中分离出dna。

极体是在卵子生命周期的两个不同时刻排出的卵母细胞相似细胞。除了帮助细胞分裂之外,极体没有已知的功能。它们只是卵子分裂的“副产物”。一旦植入发生,极体解体,且并不作为正在发育的胎儿的一部分。39

胚胎活检是在ivf程序期间在胚胎达到六至八个细胞阶段(胚胎培养的约72小时或第三天)时进行的技术。将一个或两个细胞或卵裂球从胚胎的其余部分分离,并从作为围绕发育中的胚胎的外壳的透明带中取出。取出细胞后,将发育中的胚胎放回培养基中,并放回到培养箱,在培养箱中其能够恢复其正常生长和发育。40

滋养层活检是从发育中的胚胎获得细胞进行遗传测试的最新技术。到发育的第5天,胚胎分裂成大约100个细胞:内细胞团和滋养层细胞。滋养层活检的优点在于能够获得若干细胞而不会严重影响胚胎的发育。通过获得若干细胞,可获得更多的遗传信息。这将增加结果的准确性。41

然而,pgs应用要求独特的技术挑战。在一些实施方式中,染色体细胞内容的评估可以通过以下方式进行:在受精后取出细胞或间接测量遗传内容并对极体进行测定,从而测定生成胚胎的卵母细胞。在其他实施方式中,该应用存在的唯一目的是调查卵母细胞,并且不一定产生胚胎。这是样品收集在低温库中时的普通程序。

在目的是检测染色体失衡时,可用的cgh阵列方法需要大量的杂交测试,特别是在事先不知道样品性别的情况下(例如,进行pgs的胚胎的情况):这取决于以下事实:受测dna必须分别与雄性和雌性参照物dna杂交以获得关于可能的染色体失衡的可靠信息;测试的重复进一步乘以被分析的dna样品的数量。因此,对能够减少所需的杂交测试数量的新cgh阵列方法的需求十分强烈,理想的情况下,每个受测dna使用单个阵列。

拷贝数变异的鉴定已被广泛地用于检测整个基因组上的任意尺寸的畸变,然而即使在同一平台上测量,迄今为止也报道了来自重复样品的不同的差异结果。42另外,不同的算法对于同一样品可以提供不同的结果。因此,对用于cgh阵列数据的新分析途径有进一步的需求,该途径提供一组执行算法,其能够去除阵列特异性偏差并自动选择沿基因组的增益和损失区域,从而在假阳性(fp)和/或假阴性(fn)方面降低测定失败的风险。43,44

cgh测试的进一步可变性是由用于与受测dna竞争杂交的参照物dna的品质变化引起的。因此,进一步需求涉及针对所使用的参照物dna的内部品质控制的新chg方法。



技术实现要素:

目前,本发明人已经设计了确定受测dna样品中的染色体失衡的新方法,特别是当性别不明时(即,当所述受测dna的供体的性别未知时),这通常是在胚胎在植入前接受遗传学筛查的情况。需要指出的是,虽然用于确定性染色体中的dna失衡时该方法特别有利,但是它也能够用于确定性别染色体(性染色体)和非性别染色体(常染色体)这两种染色体类型中的失衡。基于cgh阵列技术的本方法的主要特征在于:消除了到目前为止还要求的对受测dna与双性参照物dna(即来自雄性供体的参照物dna+来自雌性供体的参照物dna)进行双重杂交的需求。因此,本方法利用单个杂交阵列(在本文中称为“受测”杂交阵列)来执行,其中受测dna竞争性地杂交至仅一种参照物dna(无论来自雄性或雌性供体都无差别);然后,将从所述受测物杂交阵列中获得的结果与从“参照物”杂交阵列中获得的结果进行组合,其中,在所述参照物杂交阵列上,从两个性别不同的供体中获得的参照物dna已经竞争性杂交。来自“受测物”和“参照物”杂交阵列的结果的组合提供了受测dna内染色体失衡(拷贝数变异,在本文中为“cnv”)的最终数目。需要指出的是,当对n个受测dna样品执行该方法时,参照物杂交不会重复n次,而是可以只执行其一次以产生相应的结果:这种结果在适当存储后能够进一步与由n个受测dna样品产生的结果中的每一个进行组合。因此,对于每个待分析的单个受测dna,仅使用单一一个杂交阵列。

因此,本发明的目的是一种单阵列cgh方法,其经由cgh技术,通过比较受测dna样品与来自雄性(或雌性)供体的参照物基因组dna[本文中的“参照物-dna”]来评估来自受测样品的整个性染色体和常染色体基因组dna[在本文中为“受测-dna”]中的拷贝数变异[在本文中为“cnv”]的存在和数量,所述方法包括以下步骤:

a)用第一标记物标记所述受测dna,从而获得标记的受测dna;

b)用与第一标记物不同的第二标记物标记雄性(或雌性)参照物-dna,从而获得标记的雄性(或雌性)参照物-dna;

c)使步骤a)和b)中获得的dna杂交至受测物杂交阵列,从而从两种标记物获得源自相应的杂交的dna分子的信号强度的组合图形;

d)根据步骤c)的组合图形,确定由所述第一和第二标记物产生的单个信号强度;

e)通过将步骤d)中获得的两个信号强度相互比较,对所述受测-dna中的cnv进行首次评估;

f)用所述第一标记物标记参照物-dna(其性别与步骤b)中使用的参照物dna相反),从而获得所述第一标记物标记的参照物-dna;

g)用所述第二标记物标记所述参照物-dna(其性别与步骤b)中使用的参照物dna相反),从而获得所述第二标记物标记的参照物-dna;

h)使步骤f)和g)中获得的两种dna杂交至参照物杂交阵列,从而从两种标记物获得源自相应的杂交dna分子的信号强度的组合图形;

i)根据步骤h)的组合图形,确定由所述第一和第二标记物产生的单个信号强度;

j)通过将下述两者相互比较来对所述受测-dna中的cnv进行第二次评估:

-在步骤d)中确定的所述第一标记物标记的所述受测dna的信号强度,

-在步骤i)中确定的所述第二标记物标记的所述参照物-dna的信号强度;

k)将步骤e)和j)中获得的cnv值组合,以获得与性染色体和常染色体基因组dna相关的最终cnv确定,从而获得与所分析的整个基因组dna相关的最终cnv值。

本方法可以使得用于对n个dna样品进行cgh测试的载体中所需的阵列数减半,并因此使得这种分析所需的时间减半。本发明因此涉及用于cgh分析的新的、更紧凑的载体,其中提供了n个受测物杂交阵列以根据本方法的步骤a)-e)测试n个dna样品,并且提供单个参照物杂交阵列用于执行步骤h),从而避免了现有技术所需的阵列重复。本发明还涉及用于执行这种方法的试剂盒。本发明还包括如下可能性:通过合适的数据处理减少由标记的dna分子的杂交产生的信号强度的偏差。本发明还包括用于杂交的参照物dna的内部品质控制。

附图说明

图1是描述本发明的用于确定cnv的新型cgh微阵列方法的流程图。

图2是描述本发明的基于第一dna振幅图谱的cnv确定方法的流程图。

图3是描述本发明的基于第二dna振幅图谱的cnv确定方法的流程图。

图4是描述本发明的基于第一和第二dna振幅图谱的最终cnv确定方法的流程图。

图5是描述本发明中详述的每个测试使用单一区域的基于第一和第二dna振幅图谱的cnv确定方法的总结。

图6是描述图像品质控制方法的流程图。

图7是描述用于首次cnv评估的图像噪声减少方法和算法系列应用方法的流程图。

图8是描述用于第二次cnv评估和最终cnv确定的方法的流程图。

图8a是根据染色体的增益和损失在受测物(test)和雄性或雌性参照物(ref)之间对一组cnv分析的结果进行比较的表;雌性参照物来自品质控制和直接用微阵列测得的参照物。根据常染色体和性染色体的增益和损失,估计pgs核型,并将其与对照核型进行比较。将雌性参照物(参照物(a)至(e))的一致性与品质控制进行了比较,并且报告了相应地一致性值。

图8b是不同的正常和非正常的潜在基因型相对于正常雄性或雌性参照物(指的是性染色体)的cnv读数。

图9是在不同微芯片上测量的雌性参照物的标准偏差的比较。还报告了这些值的中值和标准偏差的估算值。

图10是测试分析的标准偏差的比较。还报告了这些值的中值的和标准偏差的评估值。

图11是受测物针对对照的染色体定位图。

图12是针对ibsa品质控制测量受测物时的雌性参照物趋势。

图13是本发明的单个区域cnv检测的示例。

具体实施方式

在本说明书和权利要求书中,除非另有说明,所使用的术语应该具有本领域技术人员通常赋予其的相同含义。此外,在整个说明书和权利要求中:

“cgh”是指比较基因组杂交(competitivegenomichybridization)。

“受测dna”是指待分析的dna,特别是需要确定其上的拷贝数变异的数量的dna。

“拷贝数变异”或“cnv”是指结构变异的一种形式,即基因组的dna的变化,这种变异导致细胞具有dna的一个或多个部分的异常拷贝数。

“增益/损失”表示正值(增益)或负值(损失)。“参照物dna”是指在本方法中使用的微阵列上与受测dna竞争杂交的dna。“标准dna”是指固定在阵列上的、受测dna和参照物dna都与之竞争性杂交的dna。

“受测物杂交阵列”是指在本方法的步骤c)中杂交有受测dna样品的阵列。“参照物杂交阵列”是指在本方法的步骤h)中杂交有参照物dna的阵列。“阵列”(或“微阵列”,在本文中可互换使用)是指涂覆的表面支撑材料(例如玻璃或塑料载片),在其上以规则的图案附着有序列已知的多个分子或片段(通常为单链dna或蛋白质的分子或片段),用于生化或遗传分析。在本方法中,所使用的阵列具有相同的结构和组成,而不管它们是否用于杂交受测dna或参照物dna。

本方法中所使用的受测dna是来源于任意生物体(特别是雄性或雌性供体)的、需要测定其中的cnv的dna。当执行本发明的方法时,受测dna的供体的性别可以是已知的或未知的。受测dna可以携带在数量上增加或减少的基因组片段。受测dna所源自的生物体可以是例如来自卵母细胞的一个或多个极体1和2、胚胎的卵裂球、精子、源于以下一种或多种的细胞:外周血淋巴细胞、胎血、绒膜绒毛、羊水细胞、皮肤、骨髓、胎儿组织、肺、肝、实体瘤或腹水,等等。

本文已参考“受测dna”描述了该方法。然而,本发明的方法目的不限于逐个测试单个dna:只要提供合适的cgh载体,它就能够对n个受测dna(来自相同或不同的供体)同时进行测试,这种cgh载体应该包括n个受测物杂交阵列,在其上根据本发明的方法分析n个受测dna中的每一个。该实施方式是本发明的方法的组成部分。最后,尽管被合适地设计成用于测试dna样品,但本方法还能够适用于可应用双通道微阵列的所有情况。

所述方法中使用的参照物dna可以来自单个供体,或者来自多个雄性供体或多个雌性供体;在多个供体的情况下,各基因型也可以以不同的浓度存在。使用具有这些变异的参照物dna具有减少基因型偏差的优点。该方法中使用的参照物dna可以临时制备或者可以从市场上购买。因此,在整个申请中,术语“雄性参照物dna”是指从一个或多个雄性供体获得的参照物dna;术语“雌性参照物dna”是指从一个或多个雌性供体获得的参照物dna。“与……性别相反的参照物dna”(其中“与……相反”用于指与另一参照物dna相反)的表述是指从性别与另一参照物dna的供体相反的供体中获得的参照物dna。

在诊断实践中,待分析的受测dna常常是单个dna分子(例如从单个细胞中获得的)。这样的单个dna分子可能不能产生用于cgh分析的足够强的信号。在这些情况下,可以通过本领域公知的常规技术适当地扩增受测dna分子。扩增技术的非限制性示例有dop-pcr(多样化随机引物策略)、plexysome技术文库试剂盒(例如genomeplex(rubicongenomics))、使用phy聚合酶试剂盒(repli-g,qiagen)的支化pcr等。本说明书的实验部分中给出了扩增技术的其他示例。目标扩增程度应该能够提供与参照物dna相同或至少相似的信号水平。

扩增参照物dna的需求较少:事实上,它们通常是对cgh处理具有足够高的扩增程度的多分子样品;然而,在任何必要的时候(始终为了获得与受测dna相当的信号),本发明并不排除扩增参照物dna的可能。dna(受测物和/或参照物)的扩增可以在单个步骤中进行,或者通过分开的增加的步骤进行,例如,两个跟随的增量步骤,其中产生的适量dna完全足以使其通过第二步扩增来被标记。

本方法的各个步骤a)至k)可以详细描述如下:

步骤a)

用于标记受测-dna的标记物通常是荧光标记物。本领域众所周知的合适的标记物的非限制性示例是cy3或cy5修饰的双脱氧核苷酸(cy3-cy5-dctpgehealthcare或perkinhelmer)。替代性的标记物也是可行的,例如有色的非荧光标记物、放射性标记物等。标记可以通过已知的程序实现,例如,使用大肠杆菌的dna聚合酶i的klenow片段的随机引物标记法,或该领域已知的等同方法。

步骤b)

该步骤中使用的参照物dna可以是雄性或雌性来源,这对该方法的最终结果没有影响。然而,在这个步骤中使用的参照物dna的类型决定了稍后在步骤f)和g)中使用的参照物dna的类型。在步骤b)中使用的雄性参照物dna要求在步骤f)和g)中使用雌性参照物dna(因此在性别上相反);于此相反,在步骤b)中使用的雌性参照物dna要求在步骤f)和g)中使用雄性参照dna。用于该步骤的标记物可以选自步骤a)中描述的那些标记物,条件是:如cgh所要求的,两个标记物彼此不同。通常,使用颜色/发射波长不同的、具有不同的荧光团的标记物。优选地,这两个标记物属于同一标记物家族(例如,“荧光”或“放射性”),以便能够通过同一检测仪器鉴别相应的标记的dna。这两种标记物适合以相同的比例使用。

步骤b)在本文中是广义的,也包括使用预先标记的商业参照物dna的可能性;在这种情况下,物理标记参照dna的行为被从商业来源获得预先标记的标记物代替:该实施方式也意图包括在本方法的步骤b)中。

步骤c)

该步骤代表整个方法中受测dna所经历的唯一杂交反应:因此,本方法被表征为“单阵列”方法。在该阶段,在步骤a)和b)中获得的标记的dna(受测dna和参照物dna)在同一受测物杂交阵列上竞争性地杂交。杂交通过本领域已知的方法进行:通常,将标记的dna溶解在适当的杂交溶液中;使dna变性以使单链可用于与阵列的dna探针杂交;然后,将所得溶液分配在阵列上,从而开始杂交反应。如在cgh中常见的一样,受测dna和参照物dna竞争与阵列上存在的各种dna克隆(bac/探针)中的每一种的杂交:在单个bac信号处的任何可能的受测/参照物失衡杂交表明受测dna在其相应部分中可能有异常。在合适的温育时间之后,对阵列进行清洗以去除未结合的dna,并干燥。

步骤d)

在该步骤中,通过在阵列的每个点处评估结合于其上的标记的dna的信号强度,来测量受测dna和参照物dna的杂交水平。适合的软件辅助的读取仪器(例如激光扫描仪)针对阵列的每个点区分和量化两种标记物对测量的信号强度的贡献。记录并保存所得的信号强度,以稍后在该方法中使用。

步骤e)

受测dna中的cnv是通过检测对应于特定阵列点的杂交水平的失衡来确定的;如在cgh中常见的一样,失衡可以被检测为特定阵列点处的发射信号的损失/增益。特别地,当两个信号强度(受测dna和参照物dna)之间的log2比值表示为正值(增益)或负值(损失)时,则能够确定cnv。根据本领域公知的技术,通过对信号进行软件处理来执行cnv的计算:这些信号涉及例如信号强度的量化、数据标准化、统计学分析、偏差减少、染色体相关强度的计算、染色体相关dna片段的产生,等等。用于该目的的合适软件的示例是在专利申请wo2013/171565a2中描述的软件。用于该计算的软件和算法的进一步细节示于本说明书的实验部分。在该步骤中读取的染色体cnv值对于非性别染色体(常染色体)而言是最终的,而对于性别染色体(性染色体)而言则是临时的。这是因为当所分析的受测dna的性别未知(即所述受测dna的供体的性别是未知的)时,其与单一的(雄性或雌性)参照物dna的杂交将不足以最终区分正常存在的cnv和最终异常的性别染色体。

步骤f)

在该步骤中使用的参照物dna与步骤b)中使用的参照物dna在性别上相反:因此,如果在步骤b)中使用了雄性/雌性参照物dna,那么其将是雌性/雄性参照物dna。该dna的第一等分试样用第一标记物标记。该标记物将优选地是在步骤a)和b)中已使用的两种标记物中的一种。

步骤g)

在该步骤中,步骤f)中用于标记的参照物dna的第二等分试样用与第一标记物不同的第二标记物标记。这里使用的标记物将优选地是在步骤a)或b)中使用的、未在步骤f)中选用的标记物。

步骤h)

如步骤c)所述,在正常cgh条件下进行杂交。

步骤i)

阵列的每个bac上的两个参照物dna的杂交水平可以通过步骤d)中描述的方法来测量。记录并保存相关的信号强度,以在该方法中随后使用。如果该些强度已被获得并且可用且保存在合适的数据存储装置上(例如,来自之前的方法执行,或者来自数据库采集),那么它们就能够作为“历史参照物dna杂交数据”从该来源直接使用,避免了重复执行步骤f)至i)的子工序。

步骤j)

与标准cgh不同的是,在步骤i)中的杂交之后,并不是直接在同一杂交阵列上确定cnv;这是合乎逻辑的,因为在步骤i)中,同样的参照物dna与其自身竞争,在此阶段不应期望有显著的cnv。而本步骤j)则是将步骤i)中获得的信号强度与步骤d)中获得的信号强度进行比较,并由此获得受测dna中的cnv的二次评估。在步骤j)中比较的信号强度是来自两种类型染色体的信号强度,特别是来源于性别染色体的信号强度;因此,待比较的信号强度中存在的任何x-增益和y-损失(反之亦然)将特别受关注。步骤j)将受测dna的杂交信号与雄性和雌性参照物dna的杂交信号进行比较,因此该阶段的cnv读取值补充步骤e)中通过单性别参照物dna获得的临时cnv信息。

步骤k)

在该软件辅助的步骤中,将步骤e)和j)中获得的cnv组合,以提供所分析的整个受测dna的完整和最终的cnv特征。

如上所述,步骤子工序a)-e)和子工序f)-i)是指两个不同且独立的杂交测定。如上所示的这两个子工序的执行顺序仅仅是说明性的而不是限制本方法:后者可以通过将它们的顺序颠倒来一样地执行,即首先执行步骤f)-i),再执行步骤a)-e),然后用步骤j)和k)结束该方法;该实施方式意在成为本发明的方法的组成部分。

本发明的方法还包括能够进一步提高cnv的评估精度的一些优选实施方式。

根据第一优选实施方式,使用相应数量的相同参照物dna样品来多次重复进行参照物dna的杂交程序(方法的步骤f-g-h-i);这样的重复杂交在来自多种生产批次的微阵列上进行;然后,对每次杂交产生的信号强度进行软件处理以消除/减少可能的偏差和非特异性信号。本说明书的实验部分详细描述了这种处理的示例性描述。然后,将如此处理的信号强度视为“步骤i)的结果”,并根据上述本发明的方法进行进一步处理。

根据第二优选实施方式,从第一实施方式获得的信号强度被存储,并且用作本方法中使用的任意其他参照物dna的“品质控制标准”。根据该实施方式,为了确定/控制使用中的参照物dna的品质水平,将在步骤i)中源自所用的参照物dna的信号强度与相应的“品质控制标准”的信号强度进行比较:其信号强度越接近“品质控制标准”的信号水平,品质越高。

通过避免受测dna与双性别参照物dna的重复杂交,本方法在事先不知道性别的dna受测样品的cnv确定中引入了重要的简化(即,当所述dna受测样品的供体性别未知时),例如在体外受精(ivf)方案中的植入前诊断中的通常情况。这种简化意味着分析时间的显著减少(当需要分析多个受测dna时尤其明显),并减少所需的cgh阵列的数量。cnv的确定可以选择顶部卵母细胞、精子或用于获得正确的染色体状态的正确胚胎等。

由于本方法使阵列减少,这可以提供新的、更紧凑的chg载体,其特征在于包括在合适的载体上分层的用于对一个或多个受测-dna执行所述步骤a)-e)的一个或多个杂交阵列和用于执行所述步骤h)的单个阵列:后者可以在载体上通过载体自身上的适当的印刷指示来识别,或者通过将其放置在载体的特定区域中、使其与包含杂交受测dna所需的阵列的区域区分开而被识别。这些新的、更紧凑的载体这样形成了本发明的另一个实施方式。

本发明的另一目的是用于执行上述方法的试剂盒,其包括:(a)用于对一个或多个受测-dna执行所述步骤a)至e)的一个或多个杂交阵列;(b)记录在合适的数据存储载体上的、步骤i)的参照信号强度,或者替代地,用于执行所述步骤h)的参照物阵列以及执行该步骤所需的经标记的雄性和雌性参照物dna,可选地与所述参照物dna的品质控制相关联。

现在通过参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实验

以下程序解释了将差异标记的人类探针dna样品与印刷在涂布载玻片上的人类bac阵列杂交的步骤。整个程序已在我们的实验室和临床中心证明是可靠的。

细菌人工染色体(bac)阵列由数千个斑点组成,每个斑点包括覆盖相对较大的染色体区域(大小约150-200kb)的dna片段,并且代表单个bac克隆。每个bacdna克隆对不同的染色体区域是特异性的,并且完整的克隆组已被定位到相应的染色体位置。为了避免实验偏差,每个克隆在微芯片载玻片的每个阵列中以至少两个复制品呈现。

为此,bac阵列包含具有指定数量的bac克隆的特定的人类基因组设计,每个克隆以单独的探针表示,并被证明足以满足细胞染色体筛查的主要目的:即检测受增益和/或损失影响的整个染色体。

在两种不同的dna杂交后,每个斑点所采用的标记物,例如两个对比标记物的荧光强度比,揭示染色体的损失或增益。

微阵列cgh已经成功地应用于在利用单个阵列进行全基因组扩增(wga)之后检测单个细胞中的非整倍性。例如,整个方法允许在卵母细胞或卵裂期胚胎筛查所需的时间范围内进行综合染色体分析,并且还成功实现了细胞系遗传分析。

微阵列被设计用于与扩增的dna一起使用,其中全基因组扩增(wga)对于具有较少量的基因组dna的样品是必需的,并且为了获得足够的材料以通过dna微阵列进行遗传基因分析,也需要扩增(wga)技术。

研究设计-本研究的目的是利用从ivf程序或培养的细胞系中收集的至少两种不同的整倍体或非整倍体样品基质来验证和证明本文描述的cnv检测方法。对于第一种基质,进行回顾性研究,收集临床ivf中心每日例行的一组样品。所述样品的整倍性或非整倍性状态已通过以下方式预测:利用替代技术对极体1或2或者卵裂球进行染色体评估。对于第二种基质,针对本研究的范围,从公共储存库中选择携带一个或多个已知的染色体畸变的人类淋巴母细胞系。

首先,将受测dna与雄性参照物dna进行比较,以评估第一细胞非整倍体状态。为此,应用一组特定的调用算法(算法1至6)并计算第一染色体cnv。存储dna测试物的数字文件中的斑点强度,用于稍后与以下两者的图像数据进行比较:即,本研究所使用的五个微阵列中测量的参照物雌性dna,和来自品质控制的相同的参照物雌性dna。

染色体cnv的第二测量使用相同的调用算法获得。然后,将两个染色体cnv测量结果与特定算法(算法7)进行比较,从而计算并获得受测dna的整体拷贝数评估值。

在5个不同的微阵列上对标记有两个对比荧光团的5个参照物雌性dna(参照物1至参照物5)中的每一个进行杂交。存储相应的数字文件并将其与存储的dna测试物数据集的图像进行比较。

参照物雌性dna品质控制是从对每个微阵列批量生产进行的cgh分析中获取的存储图像数据,并且代表对雌性或雄性参照物dna的最高品质测定。

为了对测试结果进行评估,使用了两个参数:细胞倍性条件和染色体一致性。前者定义了整倍性或非整倍性细胞状态,而后者定义了所研究的染色体在已知染色体cnv的受测物和对照之间的对应关系。

当使用参照物dna时,假定大部分克隆位置是整倍体,并且大部分log2比率应该在零附近变化。当应用于微阵列研究时,dna可能在所测的log2比率中引入了系统性的阵列特异性偏差,因此,在阵列cgh测试期间正常的cnv测量可导致数据的错误解读。

为了减少该项研究中的这种现象,我们提供了一种用于校正参照物dna阵列的“全面的标准化”和三个数据图像品质控制步骤:斑点形态和信号强度的品质控制参数、克隆复制品品质控制、克隆品质控制。

简而言之,在品质控制过程中,在性别匹配和错配条件下针对每个批次的阵列运行参照物dna,并评估具体参数:内容物克隆的百分比、实验标准偏差、信噪比和x和y染色体的cnv能力。当在测试测定过程中运行参照物dna时,首先将其与相应的品质控制参照物进行比较,以在下面测量之前评估其实验有效性。

在这项研究中,分别测量每个参照物dna,并与参照物品质控制进行比较,并考虑实验标准偏差(sd)作为评估参数。

受测dna和参照物dna的制备-对于阵列,利用picoplexsinglecellwga试剂盒(rubicongenomicsinc.)获得dna-wga,因为所有的内部验证研究都是使用该试剂盒进行的。然而,对于dna扩增,由于扩增产物的性质不像非扩增产物那么重要,所以可以使用任意其他合适的扩增系统。对受测dna和参照物dna(雄性或雌性)进行wga扩增,将所得物切割成片段。评估扩增产物的品质,并将全部扩增反应的十分之一标记并使其适用于cgh阵列。

标记扩增的样品和参照物dna-涉及大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段的随机引物标记法用于以两种不同的标记物独立地标记受测dna和参照物dna,进一步将其分割成片段。所述的两种dna可以例如使用cy3或cy5修饰的双脱氧核苷酸进行标记,并以相同比例混合以进行cgh测试。这使得可以在芯片扫描期间获取到分别与dna样品和对照相关的两个或一个复合图像,并针对沉积在载玻片上的每个斑点测量来自两种dna的竞争杂交的信号强度。

经标记的受测dna和参照物dna的沉淀-将所述经标记的dna与阻断溶液一起共沉淀,以避免高度重复序列的交叉杂交产生的任意偏差,该偏差会干扰cnv的计算。随后将经标记的dna干燥,以使标记的探针可用于特定的杂交运输缓冲液。

经标记的受测dna和参照物dna的杂交-将干燥的沉淀块溶解在试剂盒中可获得的适当体积的杂交溶液中。使dna变性以使单链可用于杂交过程并将其分配到微阵列上,从而允许与阵列探针接触并发生杂交。该系统是利用水浴在专用盒中进行的温度控制的浮动杂交。杂交后,载玻片以专门的严格度进行洗涤,以去除任何未结合的标记的dna或可干扰信号振幅测量的任何非特异性核酸或更高级的核酸复合物。

信号强度提取-杂交和洗涤后,读取微阵列载玻片,并使用双激光扫描仪(innoscan710a和后续版本,innopsys)捕获微阵列信息并保存为图像。微阵列读数具有专门的配置来提高数据品质。激光激发荧光标签,而光电倍增管将信号强度增加到专用值以获得特定比率值。输出信号的强度与结合到阵列中每个点的目标分子的数量成比例。扫描仪被配置成为每个通道阵列创建两个数字图像,并且对从每个通道的每个斑点处获取的信息进行存储,并利用软件图像进行进一步分析,以进行每个斑点的强度提取和计算。

数据分析–获取一组六个受测dna和雄性参照物dna的杂交的微阵列原始数据(由每个通道中列出强度值的斑点组成),并且可以针对每个特征计算通道之间的强度比。两个通道的强度比对应于每个受测dna中靶分子相对于参照物dna的相对丰度。数据解读涉及适合于微阵列分析的专用统计学方法,并且开发了专门的软件来使这些微阵列结果可视化。图6、7和8中描述了主要步骤的逻辑顺序。

该过程的细节如下:

对微阵列的每个克隆位置处的受测物杂交和参照物杂交的振幅信号进行测量、预处理并将其合并为log2比率。假定该信号与相应基因组区域中的受测物和参照物拷贝数变化的log2比率成比例。如果选择参照物dna为整倍体,则可获得受测样品中的拷贝数变化的信息。从一个cgh-阵列实验中获取的原始数据由几千个克隆特异性log2比率组成。

本发明的算法执行能够实现单芯片和多芯片分析,以及支持相关的统计学调查。图5给出了整个分析步骤的示意图,每个单独的步骤在图2、3和4中详细描述。

为了进一步提高该方法的灵敏度,可以应用图像品质控制算法来计算和减少背景噪声。在这种情况下,在图像强度提取后,形态和斑点强度的品质控制在三个不同的步骤(图6)中进行,并且在图7中应用两种不同的算法(算法1和2)来计算和降低较高的噪声。

我们还实施了一套特定的算法,旨在检测具有相同拷贝数的相邻克隆的片段,并为每个染色体分配一个品质参数值(算法3)。将所获得的片段分类为增益、损失和具有正常拷贝数量的片段。接下来的算法(算法4)用于在损失或增益类别内进行阈值识别和区分。在该项技术中,因为算法1、2和3的实施提供了稳健的噪声估计,所以为所有阵列在log2比率尺度上统一指定了固定阈值。

如果片段水平高于阈值,则将其归类为增益,如果低于阈值,则将片段计为损失,并且将处在阈值边界处的片段归类为警告情况。在该步骤中,算法5和6能够分别识别真正的染色体畸变和最终的边界染色体(图7)。

参照物dna的第二分析经历了相同的图像处理:三个图像品质控制步骤,然后是算法1至6的实施。所述品质控制的结果在图9中突出显示,其中报告了每个雌性参照物实验的sd与相应的数据标记之间的比较。发现总体sd值是均匀的,并且它们之间的差异(sd约0.004)非常低,这些数据证实了参照物制备物的准确性,并且使得该过程足够稳健以解读具有相关比例的畸变克隆的受测物的cgh阵列。

测试结果显示在图8a的表格中,其中报告了针对雄性和雌性参照物dna的所分析的相应的增益/损失染色体。已将测试物振幅图谱与品质控制和雌性参照物dna的五种不同阵列杂交进行了比较。各自的sd值在图10中描述,同时完成了它们的中值和总体sd值(分别为0.037和0.014)。尽管对dna受测物的分析导致了sd之间的偏离值,但是整体数据的全面标准化使得数据读取较不容易出现误差并且耗时更少,从而实现了cnv检测的整个过程的成功。事实上,除了其他受测物,在5例细胞系分析中仍仅有1例未能确保检测。

然后,如图8a所例示的,将dna受测物相对于dna雄性参照物(dna参照物1)的cnv检测(报告为染色体增益/损失)与dna受测物相对于“经品质控制的”dna雌性参照物或标准dna雌性参照物(dna参照物2)的cnv检测进行比较(在该实验中,为了标准化目的,在5个分开的杂交阵列上重复进行涉及dna参照物2的杂交,并且在参照物(a)-(e)标签下指示了所获得的相应cnv(报告为染色体增益/损失);对不同来源的六种受测dna同时进行测定,在图8a中表示为受测物1至受测物6)。这一结果是通过应用于前面步骤的同一图像程序来实现的,以获取两组数据(一组与dna受测物相关,而另一组与dna参照物2相关),其中利用特定的算法(算法7)对这两组数据进行比较并使其标准化(图8)。一致的染色体畸变的测量是通过以下方式获得的:对来自第一组(dna受测物vsdna参照物1)的临时结果与雌性品质控制以及每个第二cgh阵列(dna受测物vsdna参照物2)进行组合。图13显示了描述单个区域分析的输出的图形示例,其中将受测样品与雄性参照物dna进行比较,并且在同一窗口中还报告了受测样品与雌性参照物dna相比的结果。

根据图8b中的cnv读数,将通过对照分析获得的相应核型与pgs核型进行比较,图11中设计的图谱染色体强调了所研究的所有染色体的完全对应性。

还对每组雌性参照物和品质控制之间的cnv检测一致性进行了评估,并且在染色体增益、损失、正常和边界方面测得的cnv趋势示于图12中。结果清楚地示出从受测物1到受测物5的100%一致性,而雌性参照物1仅在一例(细胞系)中未能检测到正确的x染色体,并且在同一例中,参照物3显示了处于边界水平的x染色体检测。尽管这通常是由于类淋巴母细胞细胞系的性质所致的现象,但总体上的一致性大约是60%。

总之,30项实验的整个实验组的一致性是93%,ivf样品的一致性是100%。

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