活减毒病毒以及生产和使用方法与流程

发明领域本发明总体上涉及活减毒病毒的领域，特别是制备和使用活减毒流感病毒的领域。发明背景流感是各国家医学上重要的病毒之一。对于该病毒，在所有充分建立的控制措施中，接种疫苗是预防流感传染的最有效方式之一。目前市售可得的疫苗可主要分类为灭活疫苗或活减毒疫苗。两种类型的疫苗都具有其局限性。灭活疫苗，亦称为死疫苗，包含非传染性病毒蛋白产物，并且在接种疫苗后，这种疫苗可诱导抗体-介导的免疫，但不诱导细胞-介导的免疫。因此，灭活疫苗不能刺激适应性免疫系统的重要分支之一。相反地，活减毒疫苗可诱导抗体-介导的和细胞-介导的免疫反应二者。然而，许多研究表明，当前的商业活减毒疫苗不具有足够的免疫原性以诱导稳健的免疫反应。当前的商业活减毒疫苗的免疫原性差主要归因于用于减弱病毒的突变(亦称为冷适应突变)。制备减毒疫苗的最常用的方法包括在低温条件(例如24°c)下通过一系列细胞培养物或动物胚胎(通常是鸡胚胎)传代病毒。使用鸡胚胎为例，病毒在不同的胚胎中连续生长。随着每次传代，病毒在蛋中复制方面变得更好，但降低其在人细胞中复制的能力。目的用于疫苗的病毒可生长通过—“传代”通过—超过200个不同的胚胎或细胞培养物。最后，病毒将在人细胞中被减弱，并且其可在受限的条件下复制。使用冷适应病毒为例，其复制受限于上呼吸道，其中温度不超过32–33ºc。包括通过非人宿主传代病毒的所有方法产生仍可被人免疫系统识别，但不能在人宿主中良好复制的病毒版本。因此，减毒病毒可用于疫苗。当前的活减毒流感疫苗例如flumist包含冷适应病毒。认为冷适应疫苗不具有足够的免疫原性以诱导稳健的免疫反应，这可能是因为该病毒可仅在上呼吸道(33ºc)中复制。冷适应突变限制病毒在低温(33ºc)下生长。具有这些“冷适应突变”的病毒在正常体温(37ºc)下生长得差。因此，该类型的活减毒疫苗在鼻内接种疫苗后仅能够在上呼吸道(33ºc)中复制，导致有限的疫苗-诱导的免疫反应。此外，该病毒的减毒策略主要依赖于位于流感a病毒基因的3的5种突变。因此，仍存在关于由基因再分类或回复突变引起的可能不可预测的结果的安全性顾虑。存在产生活减毒病毒的其它方法。这些减毒病毒显示在各种实验模型中诱导保护性免疫反应。然而，这些方法经常转换研究的病毒为慢复制病毒，和这些减毒病毒通常在蛋中不能产生高病毒效价。因为大部分的疫苗生产商利用受精鸡蛋产生流感疫苗，因此这些减毒病毒不可能以成本有效的方式产生。对于用作疫苗的活减毒病毒仍存在需要，其在宿主中产生抗体-介导的和细胞-介导的免疫反应二者，和在蛋中产生高病毒效价。因此，本发明的目的是提供改进的活减毒病毒，其在哺乳动物宿主中复制减少，但在禽类宿主中不是如此。本发明的另一个目的是提供改进的活减毒病毒，其在哺乳动物宿主中引发与未减毒的亲代病毒相当的抗体-介导的和细胞-介导的免疫反应。本发明的另一个目的是提供改进的活减毒病毒，其在33ºc和37ºc下具有基本上相同的复制。本发明的又一个目的是提供改进的活减毒病毒，其对同源或异源病毒的攻击产生免疫保护作用。本发明的又一个目的是提供制备所述改进的活减毒病毒的方法。本发明的又一个目的是提供使用所述改进的活减毒病毒的方法。发明简述本文提供了从野生型病毒经基因工程改造的改进的活减毒病毒。活减毒病毒具有含经突变以具有禽类密码子选择偏好、例如禽类病毒的密码子选择偏好的密码子的基因组。具有禽类密码子选择偏好的密码子通常在氨基酸水平上存在于保守位点，和不存在于涉及包装或剪接，或重叠编码多个蛋白的读码框的基因组区域。在一个方面，经突变以具有禽类密码子选择偏好的活减毒病毒的密码子是同义取代。在另一方面，经突变以具有禽类密码子选择偏好的活减毒病毒的密码子是沉默突变。通常，相对于它们所来源的野生型病毒，活减毒病毒不具有任何氨基酸突变。在某些形式中，活减毒病毒从流感a型或流感b型病毒经基因工程改造。一般而言，具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子随机地但均匀地分布在活减毒病毒的基因组中。通常，具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子存在于至少一个基因、至少两个基因、至少三个基因、至少四个基因、至少五个基因、至少六个基因、至少七个基因、至少八个基因中。具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子可存在于至少三个基因中。具有禽类密码子选择偏好的密码子可存在于至少八个基因中。通常，当与野生型病毒在各个宿主中的复制相比，本文提供的活减毒病毒在哺乳动物宿主中，而非在禽类宿主中具有较慢的复制。活减毒病毒可产生类似于由野生型病毒产生的抗体-介导的免疫。活减毒病毒还可产生类似于由野生型病毒产生的细胞-介导的免疫。一般而言，活减毒病毒在33ºc和37ºc下以基本上相同的速率复制。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒可缺少任何温度-敏感性突变。不同形式的活减毒病毒可在哺乳动物宿主中针对同源和异源病毒的攻击产生保护性免疫反应。在一些形式中，本文所述的活减毒病毒可以是用于生产疫苗的母株。不同形式的活减毒病毒，当用作疫苗时，可提供针对与接种疫苗中使用的病毒相同或不同的病毒亚型的免疫。因此，本文所述的活减毒病毒可产生同亚型免疫/保护，异亚型免疫/保护，或二者。活减毒病毒可包括相对于野生型病毒突变的其基因组的一个或多个区段。在一些形式中，在活减毒病毒中病毒的基因组的所有区段，包括所有基因，被突变。可选择基因组突变的程度，以改变活减毒病毒在哺乳动物宿主中的复制速率。还可选择基因组突变的程度，以改变同亚型免疫/保护、异亚型免疫/保护或二者的水平。或者，在其它形式中，在活减毒病毒中病毒的基因组的仅一个或一些区段被突变。例如，相对于它们所来源的野生型病毒的相应区段，病毒的基因组的一个或多个区段，例如片段或基因，被突变。活减毒病毒通常可具有来自超过一个病毒株或亚型的基因组。例如，在公开的活减毒流感病毒的一些形式中，编码内部基因(pb2,pb1,pa,np,m和ns)的片段可来自一个毒株或亚型，和表面糖蛋白编码基因(血凝素(ha)和神经氨酸酶(na))可来自另一个毒株或亚型。在活减毒病毒中，任何数量的内部基因、任何数量的表面糖蛋白编码基因、任何数量的内部基因以及任何数量的表面糖蛋白编码基因，或所有基因可被突变以具有禽类密码子选择偏好。活减毒病毒可在接种疫苗中用作母株。在一些形式中，这可在接种疫苗的受试者中产生异亚型免疫。本文还提供了制备和使用活减毒病毒的方法。还提供了包含活减毒病毒的改进的药物组合物，例如疫苗。公开了具有从野生型病毒经基因工程改造以具有突变的密码子(其具有禽类病毒的密码子选择偏好)的基因组的活减毒病毒。具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子通常在氨基酸水平上存在于保守位点，不存在于涉及包装、剪接、重叠编码多个蛋白的读码框或其组合的基因组区域，或二者。在一些形式中，具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是同义取代。在一些形式中，具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是沉默突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒不具有任何氨基酸突变。在一些形式中，具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子随机地但均匀地分布在基因组中。在一些形式中，具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子存在于至少一个基因、至少两个基因、至少三个基因、至少四个基因、至少五个基因、至少六个基因、至少七个基因或至少八个基因中。在一些形式中，当与野生型病毒在各个宿主中的复制相比，活减毒病毒在哺乳动物宿主中，而非在禽类宿主中具有较慢的复制。在一些形式中，活减毒病毒产生类似于由野生型病毒产生的抗体-介导的免疫。在一些形式中，活减毒病毒产生类似于由野生型病毒产生的细胞-介导的免疫。在一些形式中，活减毒病毒产生类似于由野生型病毒产生的抗体-介导的免疫和细胞-介导的免疫。在一些形式中，活减毒病毒在33ºc和37ºc下以基本上相同的速率复制。在一些形式中，活减毒病毒在哺乳动物宿主中针对同源和异源病毒的攻击产生保护性免疫反应。在一些形式中，野生型病毒是流感a型或流感b型。在一些形式中，活减毒病毒是8-mut。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒不具有任何温度-敏感性突变。在一些形式中，活减毒病毒是母株。在一些形式中，本文所述的活减毒病毒可针对同亚型病毒(同亚型保护)、针对异亚型病毒(异亚型保护)或针对同亚型和异亚型病毒二者(同亚型和异亚型保护)产生免疫反应。在一些形式中，禽类病毒的密码子选择偏好是在与野生型病毒相同类型的禽类病毒或单一或一组参比禽类病毒的基因、片段或整个编码序列中，对于各给定的氨基酸的同义密码子的比率。还公开了通过突变不具有禽类病毒的密码子选择偏好的野生型病毒的一个或多个密码子为具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子，以产生具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子，来制备所公开的活减毒病毒的方法。在一些形式中，活减毒病毒可通过以下来制备：在野生型病毒的基因组中鉴定在氨基酸水平上保守位点的区域；鉴定不具有禽类病毒的密码子选择偏好的野生型病毒的保守位点中的密码子；和突变不具有禽类病毒的密码子选择偏好的野生型病毒的一个或多个所鉴定的密码子为具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子，以产生具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子。在一些形式中，所述方法可进一步包括通过使宿主细胞与共同形成活减毒病毒的基因组的一个或多个核酸区域接触来产生活减毒病毒，其中至少一个区域包含突变的密码子。在一些形式中，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个区域包含突变的密码子。还公开了包含所公开的活减毒病毒的疫苗组合物。在一些形式中，疫苗组合物可进一步包含载体。在一些形式中，疫苗组合物可进一步包含佐剂。还提供了包括给予有需要的受试者有效剂量的所公开的活减毒病毒的方法。所公开的方法和组合物的另外的优点将部分地在随后的描述中阐述，和部分地从描述中理解，或可通过实施所公开的方法和组合物了解。所公开的方法和组合物的优点将通过在随附权利要求中特别指出的要素和组合得到了解和获得。将理解，前文的一般性描述和随后的详细描述均仅是示例性和说明性的，和不限制要求保护的发明。附图简述附图，其结合到本说明书中并构成本说明书的一部分，举例说明了所公开的方法和组合物的几种形式，并且和详述一起，用于解释所公开的方法和组合物的原理。图1a、1b和1c是显示wt和8-mut病毒在犬mdck细胞(0.001多重性感染(m.o.i.)，图1a)、人a549细胞(0.01m.o.i.，图1b)和胚胎蛋(100噬斑形成单位，图1c)中的生长动力学的图。组织培养物上清液或尿囊液在感染后24、48和72小时收集。病毒效价通过噬斑测定法测定。*表示p-值<0.05。图2a是显示wt-病毒和8-mut病毒-感染的小鼠随时间(感染后天数)的相对重量(%)的变化的图。各组雌性balb/c小鼠(n=5/组)用6.75x105噬斑形成单位(p.f.u.)的wt或8-mut病毒经鼻内感染。监测体重10天，和数据表示均值±sd。图2b是显示在用wt或8-mut病毒感染的小鼠的肺中的病毒效价(tcid50/g)的图。在感染后3天收获来自感染的小鼠的肺，和在mdck细胞上通过标准tcid50测定病毒效价。符号表示来自各个小鼠的数据。*表示p-值<0.05。图3是在用wt或8-mut病毒感染的小鼠的支气管肺泡灌洗液中先天性和适应性免疫细胞类型的数量的图。在感染后第7天收获液体，和用先天性和适应性免疫细胞的抗体混合物染色，和通过流式细胞术进行分析。数据表示总细胞数(均值±sd)。图4a是显示在用模拟物感染的小鼠(●)、或之前8-mut病毒(▲)或pbs(■)接种疫苗的小鼠中在攻击后不同天数的相对重量(%)的变化的图。雌性balb/c小鼠用pbs或6.75x105p.f.u.的8-mut病毒经鼻内接种疫苗。在接种疫苗后第28天，小鼠用4.3x105p.f.u.的ma-wt病毒或模拟物对照攻击。监测6只小鼠的体重14天和数据表示均值±sd。图4b是显示在攻击后3天收获的小鼠肺中病毒效价(tcid50/g)的图。在攻击后3天从3只小鼠收获肺，和在mdck细胞上通过标准tcid50测定病毒效价。符号表示来自各个小鼠的数据。图5a是显示用pbs(■)(模拟物接种疫苗对照)或6.75x105p.f.u.的8-mut病毒(●)经鼻内接种疫苗的小鼠在攻击后不同天数的相对重量(%)的变化的图。在接种疫苗后第28天，小鼠用a/pr/8/34(100ld50;~2.1x104p.f.u.)病毒或模拟物对照攻击。监测6只小鼠的体重14天和数据表示均值±sd。图5b显示通过a/pr/8/34病毒(模拟物,1；8-mut,2；和pbs,3)攻击后的存活率。组1是模拟物对照。小鼠用pbs接种疫苗，和用pbs(模拟物)攻击。组2用8-mut接种疫苗，和用pr8病毒攻击。组3用pbs接种疫苗，和用pr8病毒攻击。图6是显示用pbs(■)(模拟物接种疫苗对照)或6.75x105p.f.u.的8-mut病毒(▲)(亚型h1n1)经鼻内接种疫苗的小鼠在攻击后不同天数的相对重量(%)的变化的图。在接种疫苗后第28天，小鼠用6.71x105pfu的ma20c病毒(小鼠适应性a/hk/68；亚型h3n2)攻击。监测6只小鼠的体重14天。接种疫苗的小鼠具有更少的体重损失和更早的恢复。数据表示均值±sd。*表示p-值<0.05，**表示p-值<0.001。图7a和7b是显示以野生型(wt)或突变的病毒的病毒效价(pfu/ml)作为时间(感染后小时数)的函数测量的生长动力学的图。wt和突变的病毒的生长动力学在mdck细胞(0.001m.o.i.)中表征。在指定的感染后时间点收集组织培养物上清液。在mdck细胞上通过噬斑测定法测定病毒效价。按指示显示了包含1个(图7a)或多个(图7b)突变片段的突变体的病毒复制动力学。图8a是显示在用重组体8-mut+hk68-hn病毒攻击后不同天数的小鼠的相对重量(%)的变化的图。制备含野生型a/hk/1/68病毒(亚型h3n2)的血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)基因片段和8-mut病毒(a/brisbane/57/07病毒，亚型h1n1的8-mut)的所有内部基因片段的重组体病毒(mut+hk68-hn)。在第0天小鼠用pbs和h3n2密码子偏好突变体(1x105p.f.u./剂)处理。在感染后第28天，接种疫苗的小鼠用野生型h3n2病毒或模拟物感染攻击。组1是模拟物感染。小鼠用pbs接种疫苗，和用pbs(模拟物)攻击。组2用mut+hk68-hn接种疫苗，和用野生型h3n2病毒攻击。组3用pbs接种疫苗，和用野生型h3n2病毒攻击。图8b是显示在攻击后3天或7天在小鼠中肺病毒效价(tcid50/g)的图。图9a-9c是显示含源自brisbane/07病毒(亚型h1n1)的内部基因和源自a/pr/8/34病毒(亚型h1n1)的表面糖蛋白ha和na的重组体病毒(wt+pr8-hn,(■))和含源自8-mut的内部基因和源自野生型pr8病毒的表面糖蛋白ha和na的重组体病毒(mut+pr8hn,(▲))的生长动力学的图。生长动力学以病毒效价(pfu/ml)作为时间(感染后小时数)的函数测量。胚胎蛋用100pfu(图9a)感染；a549细胞以0.01m.o.i.感染(图9b)；和在37°c下mdck细胞以0.001m.o.i.感染(图9c)。在感染后24、48和72小时收集蛋的尿囊液或细胞的组织培养物上清液。在mdck细胞上通过噬斑测定法测定病毒效价。数据表示均值±sd。*表示p-值<0.05,**表示p-值<0.001。图10是显示随用wt+pr8-hn(■)、mut+pr8hn(▲)或pbs(●)感染后天数，小鼠的相对重量(%)的变化的图。各组6只5周龄小鼠用1x104pfu/剂的重组体病毒经鼻内感染，和监测体重14天。图11a和11b是显示含源自brisbane/07病毒(亚型h1n1)的内部基因和源自a/hk/1/68病毒(亚型h3n2)的表面糖蛋白ha和na的重组体病毒(wt+hk68-hn,(□))和含源自8-mut的内部基因和源自野生型hk68病毒的表面糖蛋白ha和na的重组体病毒(mut+hk68hn,(∆))的生长动力学的图。生长动力学以病毒效价(pfu/ml)作为时间(感染后小时数)的函数测量。胚胎蛋以100pfu感染(图11a)。人a549细胞在37°c下以0.01m.o.i.感染。在感染后24、48和72小时收集蛋的尿囊液或细胞的组织培养物上清液。在mdck细胞上通过噬斑测定法测定病毒效价。数据表示均值±sd。*表示p-值<0.05。图12是显示作为在蛋中野生型a/pr/8/34(pr8wt,□)和其密码子偏好突变体(pr8mut,(■))随时间(感染后小时数)的病毒效价(pfu/ml)的变化的生长动力学的图。在37°c下在胚胎蛋中以100pfu进行pr8wt和mut病毒的生长动力学。在感染后24、48和72小时收集蛋的尿囊液。在mdck细胞上通过噬斑测定法测定病毒效价。图13a是显示在给予pbs或用pr8wt(□)或pr8mut(■)病毒感染后，随时间(感染后天数)，小鼠的相对重量(%)的变化的图。各组6只5周龄小鼠用100pfu/剂的pr8wt或pr8mut病毒经鼻内感染，或接受pbs。图13b是显示在给予pbs或用pr8wt(□)或pr8mut(■)病毒感染后，随时间(感染后天数)，小鼠的存活率(%)的图。体重数据表示均值±sd。图14a是显示在用100pfu/剂的a/pr/8/34密码子偏好突变体(pr8mut,(■))病毒或pbs(◊)经鼻内接种疫苗后，随时间(感染后天数)，小鼠的相对重量(%)的变化的图。在接种疫苗后第28天，小鼠用10ld50(2100pfu/剂)的野生型a/pr/8/34病毒攻击。体重数据表示均值±sd。图14b是显示用a/pr/8/34密码子偏好突变体(pr8mut,(■))病毒或pbs(◊)接种疫苗，并在接种疫苗后28天用野生型a/pr/8/34病毒攻击的小鼠随时间(攻击后天数)的存活率(%)的图。图15a、15b、15c、15d、15e、15f、15g和15h是野生型和突变的病毒的rna片段(按照惯例，以dna表示)的比对的图表。在每种情况下，每对序列线中的上部序列是a/brisbane/59/2007病毒的序列，和每对序列线中的下部序列是突变的病毒。对于突变的病毒，仅显示突变的核苷酸。所有其它的核苷酸与a/brisbane/59/2007病毒中的相同。图15a显示野生型(seqidno:1)和突变的(seqidno:2)pb2片段的比对。图15b显示野生型(seqidno:3)和突变的(seqidno:4)pb1片段的比对。图15c显示野生型(seqidno:5)和突变的(seqidno:6)pa片段的比对。图15d显示野生型(seqidno:7)和突变的(seqidno:8)ha片段的比对。图15e显示野生型(seqidno:9)和突变的(seqidno:10)np片段的比对。图15f显示野生型(seqidno:11)和突变的(seqidno:12)na片段的比对。图15g显示野生型(seqidno:13)和突变的(seqidno:14)m片段的比对。图15h显示野生型(seqidno:15)和突变的(seqidno:16)ns片段的比对。发明详述参考以下特定形式的详细描述和其中包括的实施例，以及参考附图和它们之前和随后的描述，所公开的方法和组合物可更容易地理解。如本文所用的，术语“稳健的免疫反应”是指抗体-介导的反应、细胞-介导的适应性免疫反应、先天性免疫反应或其组合，其在给予病毒后产生，并且以对用相同病毒的随后攻击提供免疫保护的水平产生。如本文所用的，术语“免疫学反应”、“免疫性反应”或“免疫反应”是指针对抗原发生体液(抗体介导的)反应、细胞(由抗原特异性t细胞或其分泌产物介导的)反应或二者。这样的反应可以是通过给予免疫原诱导的主动反应，或通过给予抗体或引发t-细胞诱导的被动反应。细胞免疫反应通过呈递与i类或ii类mhc分子结合的多肽表位以活化抗原-特异性cd4+t辅助细胞、cd8+细胞毒性t细胞或二者来引发。该反应还可包括活化单核细胞、巨噬细胞、nk细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞或先天性免疫的其它组分。细胞-介导的免疫性反应的存在可通过增殖测定法(cd4+t细胞)或ctl(细胞毒性t淋巴细胞)测定法测定。体液和细胞反应对免疫原的保护或治疗作用的相对贡献可通过从免疫的同系动物单独分离抗体和t-细胞，和在第二个受试者中测量保护或治疗作用来辨别。如本文所用的，术语“免疫保护”是指针对传染剂的一种或多种抗原建立的免疫学反应，该免疫学反应通过预防疾病发展或疾病的一个或多个症状发展，针对被所述传染剂未来攻击保护宿主，在建立免疫性反应后免于被所述传染剂未来攻击达至少1年、至少2年、至少3年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年。被所述传染剂未来攻击可以通过这样的试剂进行，其为例如，与用于建立免疫保护的试剂相同、类似或不同的试剂、试剂亚型、试剂株或试剂颗粒。例如，在传染剂是病毒的情况下，*被病毒未来攻击可以通过这样的病毒进行，其为例如，与用于建立免疫保护的试剂相同、类似或不同的病毒、病毒亚型、病毒株或病毒颗粒。如本文所用的，术语“活减毒病毒”或“减毒病毒”是指以其感染宿主、在宿主内复制、包装、再次感染宿主或其组合的能力被减弱的方式，从原始亲代病毒或野生型病毒改变的病毒。一般而言，这样的减弱可以在病毒的若干或所有宿主中，或仅在病毒的一种或若干宿主中。因此，活减毒病毒的减弱(即是说，其感染宿主、在宿主内复制、包装、再次感染宿主或其组合的能力被减弱)通常与病毒的一种或多种宿主有关，其中在病毒的一种或多种其它宿主中活减毒病毒不显著或可测量地减弱。本文公开的活减毒病毒通常经遗传改变，和可被称为突变的、突变体、经基因工程改造、重组体或组合。如本文所用的，术语“活减毒疫苗”或“减毒疫苗”是指包含活减毒病原体、例如病毒的药物组合物。药物组合物包含至少一种免疫活性组分，其在受试者中针对病毒诱导免疫反应，保护受试者免于由于病毒导致的死亡或可能的死亡，或二者，和任选地可包括一种或多种增强活性组分的免疫活性的另外的组分。疫苗可另外包括对药物组合物典型的其它组分。至少一种免疫活性组分是一种或多种本文所述的活减毒病毒。如本文所用的，术语“同源病毒攻击”是指相同受试者的第二次或后续病毒攻击，其中病毒是在遗传上与第一次病毒攻击使用的基本上相同的病毒、病毒亚型、毒株或感染性病毒颗粒。在同源病毒攻击中—其中相同受试者的第二次或后续病毒攻击用具有与第一次攻击使用的病毒基本上相同或类似的病毒亚型的病毒进行—可获得同源免疫保护。如本文所用的，术语“异源病毒攻击”是指相同受试者的第二次或后续病毒攻击，其中病毒是在遗传上与第一次病毒攻击使用的基本上不同的病毒、病毒亚型、毒株或感染性病毒颗粒。在异源病毒攻击中—其中相同受试者的第二次或后续病毒攻击用具有与第一次攻击使用的病毒基本上不同的病毒亚型的病毒进行—可获得异亚型免疫保护。如本文所用的，术语“在遗传上基本上相同”是指病毒颗粒，其中它们的基因组的核酸序列，或由它们的基因组产生的氨基酸序列，显示至少98%或至少99%序列同源性，如通过核苷酸身份所测量的。如本文所用的，术语“在遗传上基本上不同”是指病毒颗粒，其中它们的基因组的核酸序列，或由它们的基因组产生的氨基酸序列，显示少于至少98%序列同源性，如通过核苷酸身份所测量的。如本文所用的，术语“密码子”是指，如上下文指出的，(a)三个核苷酸的序列，其编码某种氨基酸或发出终止翻译的信号(终止密码子)；或(b)三个连续核苷酸的特定序列，其为遗传密码的一部分，并且规定了在蛋白中的特定氨基酸，或起始或停止蛋白合成—亦称为三联体。如本文所用的，术语“密码子选择”是指编码氨基酸的每个现有密码子(三联体)的使用频率。存在64种不同的密码子(编码氨基酸的61种密码子，加上3种终止密码子)，但仅20种不同的翻译氨基酸。密码子数量过剩允许许多氨基酸被超过一个密码子编码。因为这样的冗余，认为遗传密码是简并的。不同的生物通常显示对于编码相同的氨基酸的数种密码子之一的特别偏好，或密码子选择偏好—即是说，将存在比偶然预期的更大频率的一种密码子。密码子选择偏好可表示为分数、频率或百分比。例如，1的密码子选择表示给定的密码子以100%的次数用于编码给定的氨基酸。密码子选择偏好也可通过相对同义密码子选择值表示(rscu值，其为观察到的密码子数量除以预期的数量，如果对于该氨基酸的所有密码子同等使用的话(sharp等,nucleicacidsresearch,16:8207-8211(1988)，对于其密码子选择和密码子选择偏好的描述和定义，其通过引用并入本文)。在缺少任何密码子选择偏好的情况下，rscu值是1.00。比预期较少频率使用的密码子将具有小于1.00的rscu值，和对于比预期更高频率使用的密码子，反之亦然。测定密码子选择偏好的其它方法包括gc含量、密码子的有效数量(enc)、同义密码子选择次序(scuo)、密码子挥发度、密码子适应指数(cai)和优势比(fancher等,ajmb1:174-182(2011)，对于其密码子选择和密码子选择偏好的描述和定义，其通过引用并入本文)。gc含量测量已显示与基因的密码子选择偏好极强相关。因为其与在整个基因上的选择偏好强相关，gc含量提供一种验证其它密码子选择偏好指数的简单技术。鸟嘌呤—‘g’或胞嘧啶—‘c’核苷酸出现在基因中的密码子的第三个位置的频率是gc3含量。gc含量通常以等式(1)确定，其中g、c、a和t表示鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶在密码子中的特定位置出现的次数。这给出了在整个基因中gc含量的百分比。通过仅计算在每第三个核苷酸处碱基的频率，gc含量也可缩窄至仅第三个核苷酸位置(gc3)。enc测量在基因中密码子选择与同义密码子的同等选择的偏差。enc估计绝对同义密码子选择偏好，其范围从20(此时每个氨基酸仅使用一个密码子)至61(此时以同等频率使用所有同义密码子)。enc用等式(2)测量：　　等式(2)其中f2是对于可能由两个不同的密码子编码的氨基酸，两个随机选择的密码子是相同的概率。同样，f3是对于具有三个同义密码子的氨基酸，三个随机选择的密码子是相同的概率，等等。对于基因内的同义密码子离散，这得到易于理解的表现值。然而，enc仍相当有限，因为它不提供关于密码子选择频率的具体细节。对于第i个氨基酸的第j个密码子的rscu定义为(3)，其中xij是对于第i个氨基酸的第j个密码子的频率和i是对于第i个氨基酸的可选同义密码子的数量。　　等式(3)为了进行scuo，创建密码子表，其包含具有超过一个密码子的所有氨基酸。这允许定位对于第i个氨基酸的第j个同义密码子，其中1≤i≤19和1≤j≤ni和其中ni表示对于第i个氨基酸的同义密码子数。在每个这些情况下，xij表示对于氨基酸i的第j个同义密码子的出现。以下等式顺序描述了scuo计算。首先，氨基酸i的第i个简并密码子的频率通过如下归一化xij来确定：　　　　等式(4)接着用等式(5)计算第i个氨基酸的熵，其中ni表示对于第j个氨基酸的同义密码子数。当每个密码子以同等频率使用时将出现最大熵。　　　等式(5)接着，对于在每个序列中第j个氨基酸，计算在最大熵和观察到的熵之间的归一化差异。该值oi(等式(6))是对于在每个序列中第j个氨基酸的scuo。　　　等式(6)在每个序列中第j个氨基酸的组成比率按fi,(等式(7))计算，其中总和从1-18获得，以说明由超过一个密码子编码的氨基酸。　　　等式(7)最后，对于每个序列的平均scuo表示为等式(8)。　　　等式(8)密码子的挥发度(具有汉明距离度量)vh(c)量化随机核苷酸突变将引起氨基酸取代的程度。假定所有核苷酸具有同等的突变率和可同等交换，密码子的挥发度是点突变邻居与可能的总单点突变的比率。例如，在氨基酸leu中的ttg具有6/8的挥发度，因为其8个非终止密码子邻居中的6个是非同义的。在密码子挥发度中，密码子的挥发度是随机点突变将产生非同义密码子(不编码相同的氨基酸的密码子)的概率。密码子的挥发度以等式(9)计算。　　　等式(9)其中d(x,y)是密码子x和y之间的汉明距离。如果acid(ci)编码与acid(c)相同的氨基酸，则汉明距离被定义为d(acid(ci)),acid(c))=0；否则，如果其编码不同的氨基酸，则汉明距离被定义为1，和发生取代。优势比计算通常用于评价在基因序列中的双核苷酸，核苷酸对。优势比是在序列中观察到双核苷酸的可能性和按(10)计算。　　　等式(10)其中x和y表示形成双核苷酸xy的核苷酸；和fx、fy、fxy分别表示核苷酸x、核苷酸y和双核苷酸xy的频率。已表明，具有在范围[0.78,1.25]的外面的优势比的双核苷酸可被视为比正常更加表现不足或过于表现(karlin等,jvirol.,68:2889-2897(1994);fancher等,ajmb1:174-182(2011))。密码子选择可对于任何一个部分、多个部分或整个核酸分子，或核酸分子的集合(包括一个或多个编码区)进行计算。例如，密码子选择可对于核酸分子的片段、区域、外显子等，基因，结构域，染色体，基因组或生物的种、属、科、目、纲、门或界进行计算。下表1显示禽类流感病毒和a/brisbane/59/2007病毒的密码子选择频率。每个密码子的数字显示在八个流感病毒片段的每一个中该序列的密码子的数量。这些数据例举了人和禽类流感病毒的密码子选择如何比较，以得到本文所述的突变的密码子。表1.禽类流感病毒和a/brisbane/59/2007病毒(br59)的密码子选择频率。禽类病毒的密码子选择偏好可以指在与野生型病毒相同类型的禽类病毒或单个或一组参考禽类病毒的基因、片段或整个编码序列中，对于给定的氨基酸的同义密码子的比率。如本文所用的，术语“随机地和均匀地分布”，在突变的密码子的情况下是指在基因组(或基因或外显子或片段等)中突变的密码子的分布，使得一个突变的密码子可位于紧跟另一个突变的密码子之后，或至少一个密码子远离另一个突变的密码子。换句话说，突变的密码子没有预先计算彼此的距离而定位，和存在于整个基因组(或基因或外显子或片段等)中，即没有在一个基因、片段或区域中簇集。“随机地和均匀地分布”不需要准确或统计学随机或均匀分布，仅仅是缺少簇集。当相同的密码子突变超过一次被引入片段中时，突变在整个片段中被均匀地分布。如本文所用的，术语“复制”是指基因组复制。当提及病毒时，术语“复制”还意指“病毒的复制”，其包括病毒基因组的复制、病毒蛋白的产生、病毒基因组的包装和新病毒颗粒的形成的过程。如本文所用的，术语“无改变复制”、“基本上相同的复制”和“类似复制”在病毒的情况下是指与相同种类的参考病毒的复制相当或基本上相同的病毒复制。例如，当活减毒病毒的复制与活减毒病毒的野生型病毒的复制相当或基本上相同时，这样的复制可被称为无改变或类似复制。复制可通过本领域用于测量病毒的复制的任何技术，例如通过病毒产量或通过病毒复制或生产速率测量。例如，复制可通过噬斑形成单位的数量，通过病毒体的数量，通过病毒颗粒的数量等，本身或每单位时间，或每单位重量的器官，或每单位重量的蛋白或核酸，或每单位长度的核酸测量。例如，“基本上相同的复制速率”是指每单位重量的组织中病毒颗粒数量的变化，其中对于一种病毒的数量的变化与对于另一种病毒的数量的变化基本上相同。如本文所用的，术语“基本上相同”是指相同或类似的值，例如，对于复制的值，或对于病毒数量的变化的值。该值可以相同，或当彼此比较时，可以在±10%的范围内彼此不同。如本文所用的，术语“缓慢复制”和“减弱复制”在病毒的情况下是指病毒的复制慢于或小于相同类型的参考病毒的复制。例如，当活减毒病毒的复制慢于或小于活减毒病毒的野生型病毒的复制时，这样的复制可被称为缓慢或减弱复制。复制可通过本领域用于测量病毒的复制的任何技术，例如通过病毒产量或通过病毒的复制或生产速率测量。例如，复制减少可以是噬斑形成单位的数量、病毒体的数量、病毒颗粒的数量等的任何减少。相对于野生型病毒的噬斑形成单位的数量、病毒体的数量或病毒颗粒的数量，减少的范围可以是例如，10%-90%。如本文所用的，术语“母株”和“母病毒”是指这样的病毒亚型或毒株，其可允许与病毒的另一种毒力亚型或毒株重组以产生杂合病毒。如本文所用的，术语“同义取代”是指在生物的基因组中核苷酸的变化，其在编码区中，但不导致编码的氨基酸序列的变化。如本文所用的，术语“沉默突变”是指在生物的基因组中核苷酸的变化，其不显著改变生物的表型。沉默突变可发生在非编码区(内含子内的基因的外侧)，或它们可发生在外显子内。当它们发生在外显子或编码区内时，它们不导致编码的氨基酸序列的变化(即，同义取代)，或导致插入具有与原始氨基酸类似性质的备选氨基酸，在任一情况下表型不存在显著变化。如本文所用的，术语“哺乳动物宿主”在病毒的情况下是指任何哺乳动物生物，其能够被病毒感染，并繁殖病毒。如本文所用的，术语“禽类宿主”在病毒的情况下是指任何禽类生物，其能够被病毒感染，并繁殖病毒。如本文所用的，术语“8-mut”是指具有片段化的基因组的病毒，其中相对于野生型病毒，8个其片段被突变。如本文所用的，术语“片段化的基因组”是指被分成单独的核酸区域或片段的基因组。如本文所用的，术语“核酸区域”或“基因组区域”是指基因组的任何区域。该区域可以是基因组的片段、一段两个或更多个核苷酸，或整个基因组。如本文所用的，术语“涉及包装或剪接”在病毒的情况下是指编码负责包装或剪接基因组材料的蛋白的基因组区域，或具有定义了包装或剪接的位点、例如剪接供体位点和剪接受体位点的核酸序列的基因组区域。本文使用的术语“核酸分子”是指任何可能构型的任何核酸，例如单链、双链或其组合。核酸包括例如dna分子、rna分子、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的dna或rna的类似物、锁核酸分子(lna)、蛋白核酸分子(pna)和tecto-rna分子(例如，liu,b.等,j.am.chem.soc.,126:4076-4077(2004))。pna分子是其中骨架是拟肽而不是糖的核酸分子。因此，与例如dna或rna相反，pna通常具有电荷中性的骨架。然而，pna能够至少杂交互补和基本上互补的核酸链，例如，dna或rna(pna被视为其结构模拟物)。lna分子具有修饰的rna骨架，在c4′和o2′之间具有亚甲基桥，其锁住呈n-型构型的呋喃糖环，提供具有更高的双链体稳定性和核酸酶抗性的相应分子。不像pna分子，lna分子具有带电荷的骨架。dna或rna可具有基因组或合成来源，和可以是单链或双链的。这样的核酸可以是例如，mrna、crna、vrna、合成rna、基因组dna、cdna、合成dna、dna和rna的共聚物、寡核苷酸、混合聚合物、有义和反义链二者，或可包含非天然或衍生的核苷酸碱基。相应的核酸可以是包含非天然核苷酸类似物的核酸、与亲和标签或标记连接的核酸，或二者。当本文提及时，术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用。如本文所用的，术语“野生型病毒”是指在自然中、在其宿主中、在基因操作或其它类型的有意人工操作之前存在时，呈天然形式的病毒。如本文所用的，术语“亲代病毒”是指在初始或进一步的基因操作或其它类型的有意人工操作之前的病毒。如本文所用的，术语“经基因工程改造”和“遗传修饰”是指在核苷酸、密码子、基因、片段、框架或染色体水平上使用生物技术生物的基因操作。通过首先使用分子克隆方法分离和拷贝目的遗传物质，以产生dna序列，或通过合成dna，然后将该构建体插入宿主生物，新的核苷酸、碱基、碱基对或dna可插入宿主基因组中。核苷酸、密码子、基因、片段、框架或染色体可除去(“敲除”)，添加(“敲入”)，或置换。经基因工程改造的生物也可被称为突变的生物、突变体生物、重组体生物或组合。通常，所有这些术语可互换地应用于经基因工程改造的生物。如本文所用的，术语“在氨基酸水平上的保守位点”是指生物的基因组中的位点，在相同生物的不同品系中或在相同属的不同种中，在该位点处超过90%的次数使用相同的氨基酸。如本文所用的，术语“在氨基酸水平上的半-保守位点”是指生物的基因组的位点，在相同生物的不同品系中或在相同属的不同种中，在该位点处超过80%的次数使用相同的氨基酸。如本文所用的，术语“宿主细胞”是指病毒的遗传物质或重组体表达载体可引入的原核和真核细胞。如本文所用的，术语“转化”和“转染”是指通过本领域已知的许多技术将核酸(例如，载体)引入细胞。如本文所用的，术语“免疫细胞”是指造血来源的细胞，其在免疫反应中起作用。免疫细胞包括淋巴细胞(例如，b细胞和t细胞)、自然杀伤细胞和骨髓细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞)。术语“t细胞”是指cd4+t细胞或cd8+t细胞。术语t细胞包括th1细胞、th2细胞和th17细胞。术语“t细胞细胞毒性”包括由cd8+t细胞激活介导的任何免疫反应。实例性的免疫反应包括细胞因子产生、cd8+t细胞增殖、粒酶或穿孔素产生和传染剂的清除。如本文通常使用的，“药学上可接受的”是指这样的化合物、材料、组合物、剂型或其组合，其在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织、器官、体液或其组合接触使用，而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相配。术语“个体”、“受试者”和“患者”是指任何个体，其是使用所公开的组合物治疗的目标。受试者可以是哺乳动物。因此，受试者可以是人。受试者可以是有症状的或无症状的。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成人和新生受试者，无论是雄性还是雌性，都意欲涵盖。受试者可包括对照受试者或试验受试者。如本文所用的，术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，不管修饰如何(例如，磷酸化或糖基化)。如本文所用的，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以提供对治疗的病症、疾病或病况的治疗，诱导或增强免疫反应或以其它方式提供需要的药理学效果、生理学效果或二者的剂量。准确剂量根据许多因素改变，例如受试者依赖性变量(例如，年龄、免疫系统健康等)，疾病、疾病阶段和实现的治疗。如本文所用的，术语“载体”或“赋形剂”是指在制剂中一种或多种活性成分与其组合的有机或无机成分、天然或合成的惰性成分。如本文所用的，术语“佐剂”是指试剂、药物、免疫剂或其组合，其改变其它试剂的效果。佐剂可添加至疫苗以通过加强它来改变免疫反应，例如得到更多量的抗体和更长的持续保护，因此将注射的外来材料的量最小化。佐剂还可用于通过帮助破坏对免疫系统的特定细胞类型的免疫反应，例如根据疫苗的类型通过激活t细胞而不是抗体-分泌b细胞，提高疫苗的功效。如本文所用的，术语“剂量方案”是指关于制剂、给予途径、疫苗剂量、给药间隔和免疫保护的持续时间的疫苗给予。“有效量”或“治疗有效量”是指组合物、病毒或疫苗的量，其当给予哺乳动物、优选人时，足以在哺乳动物、优选人中实现疾病或病况的治疗，或疾病或病况的预防。构成“治疗有效量”的化合物、病毒或疫苗的量将根据化合物、病毒、或疫苗，病况和其严重性，给予方式和待治疗的哺乳动物的年龄而变化，但可由考虑其自身的知识和本公开内容的本领域普通技术人员常规确定。本文使用的“治疗(treating或treatment)”涵盖在具有目的疾病或病况的哺乳动物、优选人中的目的疾病或病况的治疗，和包括：(i)阻止疾病或病况在哺乳动物中发生，特别是当这样的哺乳动物对所述病况易感，但尚未诊断患有所述病况；(ii)抑制疾病或病况，即，防止其发展；(iii)缓解疾病或病况，即，引起疾病或病况的消退；或(iv)缓解由疾病或病况产生的症状，即，在没有解决根本的疾病或病况的情况下缓解疼痛。如本文所用的，术语“疾病”和“病况”可互换使用，或不同之处可在于，具体的不适或病况可能没有已知的致病因素(使得病因学尚未查明)，因此其尚未被识别为疾病，而是仅作为不合需要的病况或综合征，其中或多或少的一组特定的症状已被临床医生鉴定。应理解，所公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或具体的试剂，除非另外指明，因此可改变。还应理解，本文使用的术语仅为描述具体形式的目的，和不意图限制。a.组合物本文公开的组合物是含基因组的活减毒病毒，所述基因组从具有人密码子选择偏好的野生型病毒的基因组进行基因工程改造，以具有突变的密码子。突变的密码子具有禽类密码子选择偏好，例如禽类病毒的密码子选择偏好。活减毒病毒可从感染哺乳动物的任何病毒产生。通常，活减毒病毒可从感染人的任何病毒产生。1.病毒适合于产生活减毒病毒的病毒的实例包括以下病毒科的病毒：腺病毒科、乳头瘤病毒科、细小病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、肝dna病毒科、多瘤病毒科、细环病毒科、呼肠孤病毒科、小核糖核酸病毒科、杯状病毒科、披膜病毒科、沙粒病毒科、黄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、本扬病毒科、弹状病毒科、纤丝病毒科、冠状病毒科、星状病毒科、博尔纳病毒科、动脉炎病毒科、肝炎病毒科。病毒必须从其基因组产生mrna，以产生蛋白和复制自身，但在各病毒科中使用不同的机制实现此过程。病毒的基因组可以是单链的(ss)或双链的(ds)rna或dna，和可以使用或可以不使用逆转录酶(rt)。此外，ssrna病毒可以是有义的(+)或反义的(−)。这种分类将病毒分成7个组：i:dsdna病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)ii:ssdna病毒(+链或"有义")dna(例如，细小病毒)iii:dsrna病毒(例如，呼肠孤病毒)iv:(+)ssrna病毒(+链或有义)rna(例如，小核糖核酸病毒、披膜病毒)v:(−)ssrna病毒(−链或反义)rna(例如，正粘病毒、弹状病毒)vi:ssrna-rt病毒(+链或有义)rna，在生命周期中具有dna中间体(例如，逆转录病毒)vii:dsdna-rt病毒(例如，肝dna病毒)dna和rna病毒的实例在表2和表3中提供。表2.用于产生活减毒病毒的dna病毒的实例表3.用于产生活减毒病毒的rna病毒的实例具有片段化的基因组的病毒也适合于形成本文公开的活减毒病毒。具有片段化的基因组的病毒包括正粘病毒科、本扬病毒科和沙粒病毒科的病毒。正粘病毒科包括流感a病毒、流感b病毒和流感c病毒。本扬病毒科包括布尼亚病毒、lacrosse病毒、加利福尼亚脑炎病毒、rift-valley-fever病毒和hamtavirus。沙粒病毒科包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、拉沙病毒、juni病毒(阿根廷出血热)。i.具有密码子选择偏好的活减毒病毒本公开内容的活减毒病毒包括具有禽类密码子选择偏好、例如禽类病毒的密码子选择偏好的一个或多个突变的密码子。突变的密码子通常从未减毒的野生型病毒的具有人密码子选择偏好的密码子产生。具有禽类密码子选择偏好的突变的密码子可以任何数量/基因存在，和存在于活减毒病毒的基因组的任何数量的基因中。在一些形式中，具有禽类密码子选择偏好的突变的密码子存在于至少一个基因、至少两个基因、至少三个基因、至少四个基因、至少五个基因、至少六个基因、至少七个基因或至少八个基因中。通常，具有禽类密码子选择偏好的突变的密码子不存在于涉及活减毒病毒的包装或剪接，或重叠编码多个蛋白的读码框的基因组区域。通常，活减毒病毒的具有禽类密码子选择偏好的突变的密码子不改变野生型病毒的氨基酸序列，使得相对于野生型病毒，活减毒病毒不具有任何氨基酸突变。通常，具有禽类密码子选择偏好的突变的密码子不是温度-敏感性突变。通常，活减毒病毒可在上呼吸道和下呼吸道二者中复制，和可在33ºc和37ºc下以基本上相同的速率复制。在一些形式中，具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是同义取代。在一些形式中，所有具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是同义取代。在一些形式中，一些具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是同义取代。在一些形式中，超过90%的具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是同义取代。在一些形式中，超过95%的具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是同义取代。在一些形式中，超过98%的具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是同义取代。在一些形式中，超过99%的具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是同义取代。在一些形式中，具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是沉默突变。在一些形式中，所有具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是沉默突变。在一些形式中，一些具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是沉默突变。在一些形式中，超过90%的具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是沉默突变。在一些形式中，超过95%的具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是沉默突变。在一些形式中，超过98%的具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是沉默突变。在一些形式中，超过99%的具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子是沉默突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒不具有任何氨基酸突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒具有少于2个氨基酸突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒具有少于3个氨基酸突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒具有少于4个氨基酸突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒具有少于5个氨基酸突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒具有少于10个氨基酸突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒具有少于20个氨基酸突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒具有小于1%氨基酸突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒具有小于2%氨基酸突变。在一些形式中，相对于野生型病毒，活减毒病毒具有小于3%氨基酸突变。在一些形式中，具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子随机地但均匀地分布在基因组、染色体、结构域、基因、外显子、区域或片段中。在一些形式中，在基因组、染色体、结构域、基因、外显子、区域或片段中具有禽类病毒的密码子选择偏好的邻近突变的密码子之间的密码子距离的变异系数小于70%。在一些形式中，在基因组、染色体、结构域、基因、外显子、区域或片段中具有禽类病毒的密码子选择偏好的邻近突变的密码子之间的密码子距离的变异系数小于65%。在一些形式中，在基因组、染色体、结构域、基因、外显子、区域或片段中具有禽类病毒的密码子选择偏好的邻近突变的密码子之间的密码子距离的变异系数小于60%。在一些形式中，在基因组、染色体、结构域、基因、外显子、区域或片段中具有禽类病毒的密码子选择偏好的邻近突变的密码子之间的密码子距离的变异系数小于55%。在一些形式中，在基因组、染色体、结构域、基因、外显子、区域或片段中具有禽类病毒的密码子选择偏好的邻近突变的密码子之间的密码子距离的变异系数小于54%。在一些形式中，在基因组、染色体、结构域、基因、外显子、区域或片段中具有禽类病毒的密码子选择偏好的邻近突变的密码子之间的密码子距离的变异系数小于53%。在一些形式中，在基因组、染色体、结构域、基因、外显子、区域或片段中具有禽类病毒的密码子选择偏好的邻近突变的密码子之间的密码子距离的变异系数小于52%。在一些形式中，在基因组、染色体、结构域、基因、外显子、区域或片段中具有禽类病毒的密码子选择偏好的邻近突变的密码子之间的密码子距离的变异系数小于51%。在一些形式中，具有禽类病毒的密码子选择偏好的突变的密码子存在于至少一个基因、至少两个基因、至少三个基因、至少四个基因、至少五个基因、至少六个基因、至少七个基因或至少八个基因中。表4.流感病毒类型和它们的宿主的总体密码子选择(rscu值)表现不足的密码子(rscu<0.6)以灰色突出显示，而最常用的密码子以粗体表示。对于基因中的各氨基酸的密码子选择可表示为分数、百分比、相对同义密码子选择值(rscu值)、gc含量、密码子的有效数量(enc)、同义密码子选择次序(scuo)、密码子挥发度、密码子适应指数(cai)和优势比(fancher等,ajmb1:174-182(2011))。任何这些度量可用于鉴定野生型病毒的每个密码子的密码子选择。通常，显示人密码子选择偏好的野生型病毒的密码子可对禽类宿主进行优化，即，经突变以具有禽类密码子选择偏好。表4显示了在病毒和其宿主(包括人和禽类宿主)中对于每个氨基酸的密码子选择。ii.具有密码子选择偏好的密码子一般而言，适合于测量密码子选择偏好的任何技术可用于鉴定在病毒、例如人或禽类病毒中的密码子选择偏好。rscu值用作测量在病毒中的密码子选择偏好的示例性技术。一般而言，具有人病毒的密码子选择偏好的密码子是在人病毒中具有比在感染另一种生物、例如禽类的病毒中更高的rscu值的密码子。类似地，具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子是在禽类病毒中具有比在感染另一种生物、例如人的病毒中更高的rscu值的密码子。因此，密码子可具有在人和禽类病毒中基本上相同的rscu值。该密码子可被认为在两种病毒之间具有平均选择。此外，密码子可在人病毒中具有大于在禽类病毒中的rscu值的rscu值。该密码子可被认为具有人病毒的密码子选择偏好。类似地，密码子可具有小于在禽类病毒中的rscu值的rscu值。该密码子可被认为具有禽类病毒的密码子选择偏好。因此，在感染一种宿主例如人的一种病毒中具有大于在感染另一种宿主例如禽类的另一种病毒中相同密码子的rscu值的rscu值的密码子，可被认为具有人病毒的密码子选择偏好。类似地，在感染一种宿主例如禽类的一种病毒中具有大于在感染另一种宿主例如人的另一种病毒中相同密码子的rscu值的rscu值的密码子，可被认为具有禽类病毒的密码子选择偏好。因此，在感染两种不同的宿主的两种不同病毒中具有相同的rscu值的密码子可被认为在两种病毒之间具有平均的病毒密码子选择偏好，或没有病毒密码子选择偏好。在病毒之间具有基本上相同的病毒密码子选择偏好的密码子是在用于测量病毒密码子选择偏好的值或度量之间具有约0.1-2%差异的密码子。这样的值可以是例如，在感染不同的宿主的不同病毒中相同密码子的rscu值，其彼此差异0.1-2%。相对于禽类病毒的密码子选择，具有人病毒的密码子选择偏好的密码子是在人和禽类病毒中用于测量病毒密码子选择偏好的值或度量之间具有约2-99.9%差异的密码子。这样的值可以是例如，在不同病毒中相同密码子的rscu值，其彼此差异2-99.9%。相对于人病毒的密码子选择，具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子是在人和禽类病毒中用于测量密码子选择偏好的值或度量之间具有约2-99.9%差异的密码子。这样的值可以是例如，在不同病毒中相同密码子的rscu值，其彼此差异2-99.9%。iii.密码子优化–突变人病毒的密码子为具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子突变人病毒的密码子为具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子包括突变密码子以获得具有或更接近于禽类病毒的密码子选择偏好的密码子。在人和禽类病毒之间密码子选择的差异程度决定了密码子是否具有更高或更低的禽类病毒密码子选择偏好。差异程度可以是低至2%或高至99.9%，和在2%和99.9%之间的任何百分比。作为突变人病毒的密码子为禽类病毒的密码子选择偏好的实例，人流感病毒a/brisbane/59/2007被突变为禽类病毒的密码子选择(表1)。在该实例中，密码子选择显示为频率，例如密码子使用的次数。对于在具体片段中给定的氨基酸，使用密码子的平均频率从禽类病毒的序列计算，并与目标病毒比较以确定需要的突变的数量。在禽类流感病毒的pb2片段中的phe的情况下，在禽类序列中uuu使用了9.3次，和uuc使用了14.7次。对于a/brisbane/59/2007，uuu使用了13次，和uuc使用了11次。为了转变为禽类病毒的密码子选择偏好，4次从uuu至uuc的突变被引入pb2片段。对于所有8个片段，对所有编码氨基酸进行相同的比较。换句话说，在病毒的片段中对于给定的氨基酸的密码子的比率被改变以匹配或更接近在禽类病毒中所述密码子的比率。一般而言，涉及将密码子从人病毒的密码子选择偏好改变为具有禽类病毒的密码子选择偏好的密码子的密码子优化可包括突变并非一个，而是许多个密码子。通常，大部分突变的密码子引入从人病毒的密码子选择偏好至禽类病毒的密码子选择偏好的变化。然而，一些突变的密码子可不引入病毒密码子选择偏好的变化，或引入朝向甚至更高的人病毒的密码子选择偏好的变化。在一些形式中，引入从人病毒的密码子选择偏好至禽类病毒的密码子选择偏好的变化的突变的密码子的数量大于不引入病毒密码子选择偏好的变化或引入朝向甚至更高的人病毒的密码子选择偏好的变化的突变的密码子的数量。每个基因引入从人病毒的密码子选择偏好至禽类病毒的密码子选择偏好的变化的突变的密码子的数量可以是大于1、1000或介于1和1000之间的任何数量。2.疫苗本文公开的一种组合物是疫苗。疫苗可包含核酸、氨基酸或其组合。疫苗(或免疫原性组合物)包括在药学上可接受的赋形剂和任选的佐剂中的免疫原性量(优选地有效量或保护量)的组分，例如外膜蛋白(分离的或纯化的，或存在于外膜囊泡，空壳或死、活或活减毒的全细胞制备物)。在此情况下，免疫原性量可定义为足以在宿主中引发抗体反应的蛋白的量。所公开的组合物之一的免疫原性量可在药学上可接受的赋形剂和任选的佐剂中配制，以预防或治疗传染性疾病。通过给予哺乳动物有效量的疫苗，疫苗可用于在对病原体感染易感的哺乳动物中诱导免疫反应(有效量是在一定程度上能够针对感染保护宿主的量)。通过以有效量给予哺乳动物，疫苗还可预防感染。疫苗能够引发针对各种病毒的交叉保护性免疫反应。本文所述的疫苗通常基于关于病原体的基本信息，例如其如何感染细胞和免疫系统如何对其响应，以及实际考虑，例如将使用疫苗的世界区域产生。本文所述的疫苗可以是例如，活减毒疫苗；灭活疫苗；亚单位疫苗；类毒素疫苗；缀合疫苗；dna疫苗；或重组体载体疫苗。一般而言，本文所述的活减毒病毒可用于活减毒疫苗。示例性的疫苗包括活减毒流感病毒疫苗，通过用单次有效剂量免疫，其可有效地保护宿主免于流感。疫苗可引发体液反应、细胞-介导的免疫反应或其组合。理想地，在被相同或不同亚型或株的未减毒病毒随后攻击时，免疫反应提供保护。本文所述的活减毒病毒，当用作疫苗时，可提供同亚型免疫保护、异亚型免疫保护或二者。i.活减毒疫苗活减毒疫苗包含已在实验室中被减弱，因此不能引起疾病的活病毒版本。因此活减毒疫苗最接近天然感染，这些疫苗是免疫系统的良好“老师”：它们引发强的细胞和抗体反应，和经常仅用一次或两次剂量产生终身免疫。尽管活减毒疫苗的优点，仍存在一些劣势。其本性是活物变化或突变而来，和在活减毒疫苗中使用的生物是没有不同的。存在极小的可能性，即疫苗中的减毒病毒可回复成有毒力形式和导致疾病。然而，这种可能性通过在病毒基因组内引入大量的突变而显著降低(见表6)。此外，并非每个人都可安全地接受活减毒疫苗。对于其自身的保护，已破坏或减弱免疫系统的人—例如，因为它们已经历化疗或具有hiv—不能被给予活疫苗。另一个限制是活减毒疫苗通常需要被冷藏，以保持有效。如果疫苗需要被海外运输和在缺少广泛冷藏的发展中国家被卫生保健工作者贮存，活疫苗可能不是最佳选择。ii.灭活疫苗灭活疫苗通过用化学品、热或辐射杀死引起疾病的病原体生产。这样的疫苗比活疫苗更加稳定和安全：死的病原体不能突变回到其引起疾病的状态。灭活疫苗通常不需要冷藏，和它们可以冻干形式容易地贮存和运输，这使得它们易于达到发展中国家的人群。然而，大多数灭活疫苗刺激比活疫苗更弱的免疫系统反应。因此，其可能需要数个额外的剂量，或加强注射，以保持人的免疫。在人们不能常规获得健康护理和不能按时得到加强注射的地区中，这可能是缺点。iii.亚单位疫苗代替整个病原体，亚单位疫苗仅包括最佳刺激免疫系统的抗原。在一些情况下，这些疫苗使用表位—抗体或t细胞识别和结合的非常特定的抗原部分。因为亚单位疫苗仅包含必需的抗原，和不包含构成微生物的所有其它分子，因此对疫苗不利反应的机会较低。亚单位疫苗可包含1种抗原、20种抗原、1和20之间的任何数量的抗原或超过20种抗原。一旦可最佳刺激免疫系统的抗原被鉴定，它们可以下面两种方式之一被制成亚单位疫苗：1)病原体在实验室中生长，然后使用化学品以分裂它们和聚集重要的抗原；或2)抗原可使用重组dna技术制造。以此方式生产的疫苗被称为“重组体亚单位疫苗”。iv.类毒素疫苗类毒素疫苗可用于分泌毒素的病原体。当病原体的毒素是疾病的主要原因时，使用这些疫苗。毒素通常通过用福尔马林(甲醛和无菌水的溶液)处理它们而被灭活。这样的“去毒”毒素，称为类毒素，对于在疫苗中使用是安全的。当免疫系统收到包含无害的类毒素的疫苗时，其学会如何攻击天然毒素。免疫系统产生锁定和阻断毒素的抗体。针对白喉和破伤风的疫苗是类毒素疫苗的实例。v.缀合疫苗当病原体具有多糖的外壳(如许多有害的细菌一样)时，通常制备缀合疫苗。多糖外壳伪装细菌的抗原，使得婴儿和年幼儿童的不成熟的免疫系统不能识别或响应它们。缀合疫苗，一种特定类型的亚单位疫苗，解决了这一问题。当制备缀合疫苗时，来自婴儿的免疫系统可识别的病原体的抗原或类毒素通常连接至多糖。该连接有助于不成熟的免疫系统与多糖外壳反应，和防御引起疾病的细菌。vi.dna疫苗dna疫苗使用编码免疫原性抗原的病原体基因。已发现，当病原体抗原的基因被引入体内时，一些细胞吸收该dna。然后dna指示这些细胞以产生抗原分子。细胞分泌抗原和将它们展示在其表面上。针对病原体的dna疫苗将对由细胞分泌的自由漂浮的抗原引发强的抗体反应，该疫苗还将针对在细胞表面上展示的微生物抗原刺激强的细胞反应。此外，dna疫苗相对容易和廉价地设计和生产。所谓的裸露dna疫苗由直接给予至体内的dna组成。这些疫苗可用针头和注射器，或用无针装置给予，所述无针装置利用高压气体将被dna涂覆的显微金颗粒直接射入细胞。有时，dna与促进其被细胞吸收的分子混合。vii.重组体载体疫苗重组体载体疫苗类似于dna疫苗，但它们使用减毒病毒或细菌以将细菌dna引入身体的细胞。“载体”是指用作载体的病毒或细菌。载体病毒运送病原体的dna至细胞。重组体载体疫苗精密模拟天然感染，因此刺激免疫系统。减毒细菌也可用作载体。在此情况下，插入的遗传物质使细菌在其表面上展示其它微生物的抗原。在实践中，无害的细菌模拟有害的微生物，引发免疫反应。3.载体药物组合物可以常规方式，使用一种或多种生理学上可接受的载体，包括赋形剂和助剂(其促进加工活性化合物为可在药学上使用的制剂)配制。合适的制剂取决于选择的给予途径。在一种形式中，给予通过上气道或下气道粘膜，通过吸入进行。典型的制剂包括载体，例如无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水。还通常加入粘性调节剂和防腐剂。特别用于肠内、局部和粘膜给予的任选的药学上可接受的赋形剂包括但不限于，稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、稳定剂和表面活性剂。稀释剂，亦称为"填充剂"，通常是增加固体剂型的体积，使得为压制片剂或形成珠和颗粒提供实用大小所必需的。合适的稀释剂包括但不限于，二水合磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预胶化淀粉、二氧化硅、氧化钛、硅酸镁铝和糖粉。粘合剂用于为固体剂量制剂提供粘着性质，因此确保片剂或珠或颗粒在形成剂型后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于，淀粉、预胶化淀粉、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨糖醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶例如阿拉伯胶、西黄蓍胶、藻酸钠、纤维素包括羟基丙基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、乙基纤维素和硅酸镁铝，和合成聚合物例如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。崩解剂用于在给予后促进剂型崩解或"分散"，和一般而言包括但不限于，淀粉、淀粉羟乙酸钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟基丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、褐藻胶、树胶或交联聚合物，例如交联pvp(polyplasdone®xl，来自gafchemicalcorp)。稳定剂用于抑制或阻碍分解反应，其包括例如，氧化反应。表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于，包含羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸钠、钾、铵盐，和烷基芳基磺酸盐，例如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，例如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，例如双-(2-乙基硫氧基(ethylthioxyl))-磺基琥珀酸钠；和烷基硫酸盐例如月桂基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于，季铵化合物例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂酰基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰子胺。非离子表面活性剂的实例包括乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇肉豆蔻酸酯、甘油基单硬脂酸酯、甘油基硬脂酸酯、多聚甘油基-4-油酸酯、酰化山梨聚糖、酰化蔗糖、peg-150月桂酸酯、peg-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、peg-1000鲸蜡基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、poloxamer®401、硬脂酰基单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛脂酰胺。两性表面活性剂的实例包括n-十二烷基-b-丙氨酸钠、n-月桂基-b-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻双乙酸酯、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。如果需要的话，组合物还可包含较少量的无毒辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、染料、ph缓冲剂或防腐剂。4.佐剂在一种形式中，佐剂是合成的糖脂α-半乳糖基神经酰胺(αgalcer)。在cd1d的情况下，呈递抗原的树突细胞可导致由天然杀伤t细胞(nkt细胞)快速先天和长期产生细胞因子例如干扰素和il-4。cd1d是呈递糖脂抗原至nkt细胞子集的主要组织相容性复合物i类-样分子。有利地，αgalcer对人类没有毒性，和已表明作为佐剂起作用，引发抗原-特异性cd4+和cd8+t细胞反应二者。例如，已表明，αgalcer与疟疾疫苗结合可导致针对感染的细胞的细胞毒性反应，对于针对传染性疾病的疫苗，这是一种理想的情况。除了αgalcer之外，还可使用作为佐剂起作用以活化nkt细胞-介导的免疫反应的其它糖脂。在另一种形式中，佐剂可以是但不限于以下一种或多种：油乳剂(例如，弗氏佐剂)；皂苷制剂；病毒颗粒和病毒-样颗粒；细菌和微生物衍生物，包括但不限于碳水化合物例如脂多糖(lps)；免疫刺激寡核苷酸；adp-核糖基化毒素和去毒衍生物；明矾；bcg；含无机物的组合物(例如，无机盐，例如铝盐和钙盐、氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等)；生物粘合剂、粘膜粘合剂或二者；微粒；脂质体；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂；聚磷腈；胞壁酰肽；咪唑并喹诺酮化合物；和表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白和二硝基苯酚)。佐剂还可包括免疫调节剂，例如细胞因子、白细胞介素(例如，il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、干扰素(例如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子；和共刺激分子，例如b7家族的那些。这样的蛋白性佐剂可作为全长多肽或其活性片段，或以dna、例如质粒dna的形式提供。5.活减毒流感病毒在一些形式中，本文所述的活减毒病毒是流感a型或流感b型病毒。本文公开的流感a型或流感b型病毒可根据世界卫生组织的修订的流感病毒命名系统进行分类(bulletinoftheworldhealthorganization,58(4):585-591(1980))。该修订的命名系统类似于1971系统，其中其由两部分组成：(a)类型和毒株名称，和(b)对于流感a病毒，表面抗原(h和n)的抗原特异性的描述。对于流感病毒a、b和c型的毒株名称包含以下信息：1.根据np抗原的抗原特异性，病毒的抗原类型的描述(a、b或c型)。2.来源的宿主。对于从人来源分离的毒株，这未指明，但对于从非-人宿主(例如猪、马(equine)、鸡、火鸡)分离的所有毒株，这被指明。对于来自非-人物种的病毒，使用来源的宿主的拉丁双名法和常用名称二者，例如，anasacuta(针尾鸭)。据此，物种的常用名称用于毒株，例如，a/鸭/ussr/695/76(h2n3)。当病毒从无生命材料分离时，指出材料的性质，例如，a/湖水/wisconsin/1/79。3.地理来源。4.毒株编号。5.分离年份。对于流感a病毒，在括号中的抗原描述在毒株名称之后，和包括以下信息。(a)描述血凝素的抗原身份的标记，即，h1、h2、h3、h4等。亚型的编号是简单的连续系统，其统一适用于来自所有来源的流感病毒。(b)描述神经氨酸酶的抗原身份的标记，即，n1、n2、n3、n4等。与h抗原亚型一样，这是简单的连续编号系统，统一适用于所有流感a病毒。对于从人分离的流感a型病毒的示例性的命名在表5中提供。表5.从人分离的流感a病毒的血凝素和神经氨酸酶抗原的参考株和亚型的实例。h和n亚型参考株hlnla/pr/8/34(h1n1)a/weiss/43(h1n1)a/fm1/47(h1n1)a/england/1/51(h1n1)a/denver/l/57(h1n1)a/newjersey/8/76(h1n1)a/ussr/90/77(h1n1)h2n2a/singapore/1/57(h2n2)a/japan/305/57(h2n2)a/england/12/64(h2n2)a/tokyo/3/67(h2n2)h3n2a/hongkong/1/68(h3n2)a/england/42/72(h3n2)a/portchalmers/1/73(h3n2)a/victoria/3/75(h3n2)a/texas/1/77(h3n2)i.流感a型本文所述的活减毒流感a病毒，包括例如，在药物组合物中的各个病毒，可基于任何流感a病毒，例如禽流感、人流感、猪流感、马流感或犬流感。存在各种不同的流感a病毒亚型，差异在于其表面上的ha和na糖蛋白的性质。流感a病毒因此通常基于存在的血凝素和神经氨酸酶(在病毒被膜的表面上的两种蛋白)的蛋白形式的组合，分类为亚型。已鉴定了18种血凝素形式(h1-h18)和7种神经氨酸酶形式(n1-n11)。合适的病毒株包括但不限于h1n1,h1n2,h1n3,h1n4,h1n5,h1n6,h1n7,h1n8,h1n9,h2n1,h2n2,h2n3,h2n4,h2n5,h2n6,h2n7,h2n8,h2n9,h3n1,h3n2,h3n3,h3n4,h3n5,h3n6,h3n7,h3n8,h3n9,h4n1,h4n2,h4n3,h4n5,h4n6,h4n7,h4n8,h5n1,h5n2,h5n3,h5n4,h5n6,h5n7,h5n8,h5n9,h6n1,h6n2,h6n3,h6n4,h6n5,h6n7,h6n8,h6n9,h7n1,h7n2,h7n3,h7n4,h7n5,h7n6,h7n7,h7n8,h7n9,h8n1,h8n2,h8n3,h8n4,h8n5,h8n6,h8n7,h9n1,h9n2,h9n3,h9n4,h9n5,h9n6,h9n7,h9n8,h9n9,h10n1,h10n2,h10n3,h10n4,h10n5,h10n6,h10n7,h10n8,h10n9,h11n1,h11n2,h11n3,h11n4,h11n5,h11n6,h11n7,h11n8,h11n9,h12n1,h12n2,h12n3,h12n4,h12n5,h12n6,h12n7,h12n8,h12n9,h13n1,h13n2,h13n3,h13n4,h13n5,h13n6,h13n8,h14n3,h14n5,h14n6,h15n8,h15n9,h16n3。在一些形式中，流感病毒是毒株h1n1,h1n2,h2n2,h3n1,h3n2,h5n1和h7n7之一。h1n1毒株的实例是流感a病毒株a/brisbane/59/2007(h1n1)、a/puertorico/8/1934(h1n1)，具有genebank检索号nc002016,nc002017,nc002018,nc002019,nc002020,nc002021,nc002022,nc002023。h1n1毒株的另外的实例是流感a毒株a/brevigmission/1/1918h1n1)(流感a病毒(毒株a/southcarolina/1/1918h1n1)、流感a毒株a/russia:st.petersburg/8/2006h1n1、流感a毒株a/usa:texas/ur06-0195/2007h1n1-毒株a/brevigmission/1/1918h1n1、流感a毒株a/southcarolina/1/1918h1n1、流感a毒株a/猪/lowa/15/1930h1n1、流感a毒株a/wilson-smith/1933h1n1、流感a毒株a/ws/1933h1n1和毒株a/usa:phila/1935h1n1。h1n1毒株的其它实例是流感a病毒株a/newzealand:southcanterbury/35/2000h1n1。h1n2毒株的实例是流感a病毒株a/xianfeng/3/1989h1n2。h1n3毒株的两个是流感a/鸭/nzl/160/1976h1n3和毒株a/鲸/pacificocean/19/1976h1n3。h1n4毒株的实例是流感a病毒株a/野鸭/netherlands/30/2006h1n4。h1n5毒株的实例是流感a病毒株a/针尾鸭/alb/631/1981h1n5。h1n6毒株的实例是流感a病毒株a/海鸠/alaska/305/1976h1n6。h1n7毒株的实例是流感a病毒a/猪/england/191973/92h1n7。h1n8毒株的实例是毒株a/埃及鹅/southafrica/ai1448/2007。h2n1毒株的实例是流感a病毒株a/japan/bellamy/57h2n1。h2n2毒株的实例是流感a病毒株a/korea/426/68h2n2，具有genebank检索号nc007366,nc007367,nc007368,nc007369,nc007370,nc007374,nc007375,nc007376,nc007377,nc007378,nc007380,nc007381和nc007382。h2n2毒株的三个另外的实例是流感a毒株a/japan/305/1957h2n2、a/czechrepublic/1/1966h2n2和毒株a/singapore/1/1957h2n2。h2n3毒株的实例是流感a病毒株a/野鸭/minnesota/sg-00692/2008h2n3。h2n4毒株的实例是a/野鸭/alberta/149/2002h2n4。h2n5毒株的实例是流感a病毒株a/燕鸥/australia/1/04h2n5。h2n6毒株的实例是流感a病毒株a/厚啄海鸠/alaska/44145-199/2006h2n6。h2n7毒株的实例是流感a病毒株a/北方琵嘴鸭/california/hkwf1128/2007h2n7。h2n8毒株的实例是流感a病毒株a/火鸡/ca/1797/2008h2n8。h2n9毒株的实例是流感a病毒株a/鸭/germany/1972h2n9。h3n1毒株的实例是流感a病毒株a/野鸭/alb/26/1976h3n1。h3n2毒株的实例是流感a病毒株a/newyork/392/2004h3n2，具有genebank检索号nc007371,nc007372和nc007373。h3n2毒株的五个另外的实例是流感a病毒株nx-31h3n2、毒株a/hongkong/5/1983h3n2、a/rio/6/69h3n2、a/hongkong/ma/1968h3n2和流感a病毒株a/shanghai/n12/2007h3n2。h3n3毒株的实例是流感a病毒株a/鸭/hongkong/22a/1976h3n3。h3n4毒株的实例是流感a病毒株a/野鸭/alb/1012/1979h3n4。h3n5毒株的实例是流感a病毒株a/北方琵嘴鸭/california/hkwf1046/2007h3n5。h3n6毒株的实例是流感a病毒株a/鸡/nanchang/9-220/2000h3n6。h3n8毒株的实例是流感a毒株a/马/miami/1/1963h3n8和毒株a/鸭/ukraine/1/1963h3n8。h3n9毒株的实例是流感a病毒株a/天鹅/shimane/227/01h3n9。h4n1毒株的实例是流感a病毒株a/鸡/singapore/1992(h4n1)。h4n2毒株的实例是流感a病毒株a/鸭/hongkong/24/1976(h4n2)。h4n3毒株的实例是流感a病毒株a/野鸭/sweden/65/2005(h4n3)。h4n4毒株的实例是流感a病毒株a/灰水鸭/australia/2/1979h4n4。h4n5毒株的实例是流感a病毒株a/鸭/hokkaido/1058/2001(h4n5)。h4n6毒株的两个实例是流感a病毒株a/鸭/czechoslovakia/1956h4n6和流感a病毒株a/鸭/alberta/28/1976h4n6。h4n7毒株的实例是流感a病毒株a/鸭/mongolia/583/02h4n7。h4n8毒株的实例是流感a病毒株a/鸡/alabama/1/1975h4n8。h4n9毒株的实例是流感a病毒株a/wdk/st/988/2000(h4n9)。h5n1毒株的实例是流感a病毒(a/鹅/guangdong/1/96(h5n1))，具有genebank检索号nc007357,nc007358,nc007359,nc007360,nc007362,nc007363和nc007364。h5n1毒株的其它实例是流感a毒株a/鸭/hongkong/2986.1/2000h5n1、流感a毒株a/羽鸡/hongkong/sf189/2001h5n1、流感a毒株a/鸡/hongkongnu562/2001h5n1、流感a毒株a/鸡/hongkong/fy150/2001h5n1、流感a毒株a/鸡/hongkong/715.5/2001h5n1、流感a毒株a/珍珠鸡/hongkong/38/2002h5n1、流感a毒株a/鸡/hongkong/31.2/2002h5n1、流感a毒株a/鸡/hongkong/37.4/2002h5n1、流感a毒株a/羽鸡/hongkongnu100/2002h5n1、流感a毒株a/鸡/hongkong/96.1/2002h5n1、流感a毒株a/鸡/hongkongnu22/2002h5n1、流感a毒株a/水鸭/china/2978.1/2002h5n1、流感a毒株a/hongkong/212/2003h5n1、流感a毒株a/鸡/shantou/4231/2003h5n1和流感a毒株a/鹅/guangxi/345/2005h5n1。h5n2毒株的实例是流感a毒株a/鸡/pennsylvania/1370/1983h5n2。h5n3毒株的实例是流感a毒株a/鸭/malaysia/f119-3/97h5n3。h5n4毒株的实例是流感a毒株a/环境/newyork/200269-18/2002h5n4。h5n5毒株的实例是流感a毒株a/鸭/massachusetts/sg-00440/2005h5n5。h5n6毒株的实例是a/鸭/potsdam/2216-4/1984h5n6。h5n7毒株的实例是a/野鸭/denmark/64650/03h5n7。h5n8毒株的实例是毒株a/鸭/ireland/113/1983h5n8。h5n9毒株的两个实例是流感a毒株a/火鸡/ontario/7732/1966h5n9和毒株a/鸡/italy/22am998h5n9。h6n1毒株的实例是a/鸡/taiwan/pf1/02(h6n1)。h6n2毒株的实例是流感a毒株a/鸡/california/1316/2001(h6n2)。h6n5毒株的实例是流感a毒株a/海鸥类/australia/1972h6n5。h6n8毒株的实例是流感a毒株a/火鸡/minnesota/501/1978h6n8。h7n1毒株的实例是流感a毒株a/禽疫病毒/rostock/8/1934h7n1。h7n2毒株的实例是流感a毒株a/鸭/hongkong/293/1978(h7n2)。h7n3毒株的实例是流感a毒株a/火鸡/oregon/1971h7n3。h7n7毒株的五个实例是流感a毒株a/马/c.detroit/1/1964h7n7、流感a毒株a/马/cambridge/1/1973h7n7和流感a毒株a/马/saopaulo/1/1976h7n7、流感a病毒株a/马/prague/1/1956h7n7和流感a病毒株a/鸡/weybridgeh7n7。h8n2毒株的实例是流感a毒株a/鸭/alaska/702/1991(h8n2)。h8n4毒株的实例是流感a毒株a/火鸡/ontario/6118/1968h8n4。h8n4毒株的实例是流感a毒株a/鸭/tsukuba/255/2005(h8n5)。h8n7毒株的实例是流感a毒株a/鸭/alaska/702/1991(h8n7)。h9n1毒株的实例是流感a病毒a/鸭/shantou/2030/00(h9n1)。h9n2毒株的实例是流感a病毒a/hongkong/1073/99(h9n2)，具有genebank检索号nc004905,nc004906,nc004907,nc004908,nc004909,nc004910,nc004911和nc004912。h9n3毒株的实例是流感a病毒a/鸭/vietnam/340/2001h9n3。h9n4毒株的实例是流感a病毒a/滨鸟/de/231/2003h9n4。h9n5毒株的实例是流感a病毒a/鸭/hongkong/702/79h9n5。h9n7毒株的实例是a/火鸡/scotland/70(h9n7)。h9n8毒株的实例是a/鸡/korea/04164/2004(h9n8)。h9n9毒株的实例是a/火鸡/france/03295/2003h9n9。h10n1毒株的实例是流感a病毒a/鸭/hongkong/938/80h10n1。h10n2毒株的实例是流感a病毒a/鸭/alaska/658/1991h10n2。h10n5毒株的实例是流感a病毒a/鸭/hongkong/15/1976h10n5。h10n7毒株的实例是流感a毒株a/鸡/germany/n/1949h10n7、毒株a/鸭/germany/1949h10n7和毒株a/鸭/manitoba/1/1953h10n7。h10n7毒株的实例是流感a病毒株a/鸭/germany/1949h10n7。h11n1毒株的实例是流感a病毒株a/鸭/miyagi/47/1977h11n1。h11n2毒株的实例是a/鸭/yangzhou/906/2002h11n2。h11n3毒株的实例是a/鸭/thailand/cu5388/2009h11n3。h11n6毒株的实例是流感a病毒株a/鸭/england/1/1956h11n6。h11n8毒株的实例是毒株a/鸭/ukraine/2/1960h11n8。h11n9毒株的两个实例是流感a毒株a/鸭/ukraine/1/1960h11n9和流感a毒株a/燕鸥/australia/g70c/1975h11n9。h12n1毒株的实例是a/野鸭/alberta/342/1983(h12n1)。h12n2毒株的实例是a/鸭/primorie/3691/02h12n2。h12n3毒株的实例是a/大天鹅/mongolia/232/2005h12n3。h12n5毒株的实例是流感a病毒株a/鸭/alberta/60/1976h12n5。h12n6毒株的实例是a/野鸭/alberta/221/2006h12n6。h12n7毒株的实例是a/鸭/victoria/30a/1981h12n7。h12n8毒株的实例是a/野鸭/netherlands/20/2005h12n8。h12n9毒株的实例是a/红颈滨鹬/australia/5745/1981h12n9。h13n1毒株的实例是a/鸟粪/illinois/185997-30/2007h13n1。h13n2毒株的实例是流感a病毒株a/鲸/maine/328/1984h13n2。h13n3毒株的实例是a/滨鸟/nj/840/1986h13n3。h13n6毒株的两个实例是流感a病毒株a/海鸥/maryland/704/1977h13n6和毒株a/海鸥/minnesota/945/1980h13n6。h13n8毒株的实例是a/黑头海鸥/sweden/1/2005h13n8。h14n3毒株的实例是a/野鸭/gur/263/82h14n3。h14n5毒株的三个实例是a/野鸭/gurjev/263/1982h14n5、a/野鸭/astrakhan/266/1982h14n5和a/银鸥/astrakhan/267/1982h14n5。h14n6毒株的实例是毒株a/野鸭/gurjev/244/1982h14n6。h15n8毒株的实例是a/鸭/australia/341/1983h15n8。h15n9毒株的实例是a/海鸥类/westaustralia/2576/79h15n9。h16n3毒株的实例是a/黑头海鸥/sweden/2/99h16n3。这样的病毒亚型在血清学上是可区分的，这意味着对一个亚型是特异性的抗体不以相当的高亲和力结合另一个亚型。尽管如此，根据本发明表征流感a病毒的基因的核酸位置适用于任何流感a病毒株。ii.流感b型本文所述的活减毒病毒还可以是流感b型病毒。活减毒流感b型病毒，包括在药物组合物中的活减毒流感b型病毒，可基于任何流感b病毒株。合适的病毒株包括但不限于流感b病毒株b/maryland/1959、毒株b/yamagata/1/1973、毒株b/victoria/3/1985、毒株b/ussr/100/1983、毒株b/tokyo/942/1996、毒株b/texas/4/1990、毒株b/singapore/222/1979、毒株b/southdakota/5/1989、毒株b/paris/329/1990、毒株b/leningrad/179/1986、毒株b/hongkong/8/1973、毒株b/fukuoka/80/1981、毒株b/bangkok/163/1990、毒株b/beijing/1/1987、毒株b/switzerland/9359/99、毒株b/wisconsin/6/2006、毒株b/westvirginia/01/2009、毒株b/washington/08/2009、毒株b/uruguay/ng/02、毒株b/texas/18/2001、毒株b/taiwan/s117/2005、毒株b/taiwan/3799/2006、毒株b/spain/wv45/2002、毒株b/seoul/232/2004、毒株b/riograndedosul/57/2008、毒株b/quebec/517/98、毒株b/philippines/5072/2001、毒株b/oslo/1871/2002、毒株b/osaka/983/1997、毒株b/milan/05/2006、毒株b/johannesburg/116/01或毒株b/arizona/12/2003。iii.变化为禽类密码子选择偏好的密码子在一个形式中，本文所述的活减毒病毒包括这样的流感病毒，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个基因组片段已被突变，使得每个片段中具有人密码子选择偏好的至少一个密码子已被变化为具有禽类密码子选择偏好、例如禽类病毒密码子选择偏好的密码子。每个片段中从人变化为禽类密码子选择偏好的密码子的数量可以不同。每个片段中多至100个密码子或更多可被变化。通常，每个片段中从人变化至禽类病毒的密码子选择偏好的密码子的数量是3、100或介于3和100之间的任何数量，或15、80或介于15和80之间的任何数量。特定的密码子变化在表6-8中示出，和在seqidnos:1-16中提供。例如，当与seqidno:1(野生型)相比(按常规，以dna表示)，病毒的rna片段pb2接受总共62个密码子取代，如seqidno:2所示的(禽类-偏好的密码子)。b.制备方法1.产生活减毒病毒为了产生活减毒病毒，筛选未减毒的野生型病毒的基因组以鉴定密码子选择频率和具有人密码子选择偏好的密码子(表6)。然后鉴定具有人密码子选择偏好的密码子的突变。一个或多个所鉴定的密码子经突变以将密码子从具有人密码子选择偏好改变为具有禽类密码子选择偏好。为了避免影响对病毒复制必需的关键病毒rna信号，将突变引入以下区域：(1)不参与vrnp包装，(2)不参与剪接，和(3)不编码多个病毒蛋白。除了本文所述的关键区域之外，突变被随机地，但均匀地分布在目标病毒基因组中。特别地，这些突变被引入在氨基酸水平上(>99%)，但不在核苷酸水平上高度保守的位点。i.产生具有禽类密码子选择偏好的病毒的基因组对从具有人密码子选择偏好至禽类密码子选择偏好的突变鉴定的密码子通常使用任何合适的分子生物学技术产生。合适的分子生物学技术的实例包括核酸的靶向诱变例如病毒基因组的定点诱变，基因组区域的dna合成或rna合成，和其它合适的方法。参见shortprotocolsinmolecularbiology.chapter8,johnwiley&sons,由ausubel等编辑，第5版.2002。ii.包装基因组至病毒颗粒用片段化或单一基因组制备重组体病毒的方法是本领域通常已知的。这些包括用在分子生物学中的标准回复遗传技术和基因组操纵的方法(hoffmann等,proc.natl.acad.sci.usa,97(11):6108-6113(2000);zhou等,j.virol.,72(4):3241-3247(1998))。通常将所有合成的基因亚克隆至表达构建体。然后，构建体用于在体外接触，即感染相同的宿主细胞。宿主细胞然后产生包含操纵的基因组的包装的病毒。然后收获包装的病毒和它们的效价使用标准病毒学技术测定，和用于进一步表征。在其它形式中，制备本公开内容的活减毒病毒的方法包括用野生型病毒和包含突变的密码子的活减毒病毒基因组区域、包含突变的密码子的活减毒病毒的整个基因组或包含突变的密码子的活减毒病毒接触相同的宿主细胞，其中活减毒病毒具有与野生型病毒相同或不同的亚型、毒株或种类。通常，宿主细胞与野生型病毒和与野生型病毒相同亚型、毒株或种类的活减毒病毒接触。在一些形式中，宿主细胞与野生型病毒和与野生型病毒不同亚型、毒株或种类的活减毒病毒接触。iii.定量病毒颗粒定量病毒颗粒的方法是本领域众所周知的。实例包括用于在感染性剂量方面测定病毒浓度的基于噬斑的测定法。病毒的噬斑测定法测定在病毒样品中噬斑形成单位(pfu)的数量，其是病毒数量的一种度量。焦点形成测定法(ffa)是噬斑测定法的变型，但不是依赖于细胞溶解以检测噬斑形成，ffa采用免疫染色技术，使用荧光标记的对病毒抗原特异性的抗体以在形成实际噬斑之前检测感染的宿主细胞和感染性病毒颗粒。ffa可特别用于定量不溶解细胞膜的病毒类型，因为这些病毒不适合于噬斑测定法。另一种测定法是终点稀释测定法(50%组织培养物感染剂量(tcid50))。tcid50是感染性病毒效价的度量。这种终点稀释测定法定量测定杀死50%的感染宿主或在50%的接种组织培养物细胞中产生细胞病变作用所需的病毒的量。c.试剂盒还提供了用于用本文所述的活减毒病毒免疫受试者的一种或多种试剂盒。试剂盒包含活减毒病毒、药学上可接受的载体、佐剂、施用器和其使用说明材料。在进一步的形式中，活减毒病毒可以是一种或多种脊髓灰质炎病毒、一种或多种鼻病毒、一种或多种流感病毒等。当需要针对特定病毒的许多不同的分离株免疫宿主时，超过一种病毒可能是优选的。说明书可提供用于指导给予活减毒病毒的任何信息。d.使用方法1.作为药物组合物的用途本文提供的活减毒病毒可用于预防性治疗病毒感染，治疗性治疗病毒感染，或二者；即是说，其可用于治疗病毒感染，预防病毒感染，或二者。活减毒病毒可作为药物组合物，通过本领域已知的任何途径给予。通常，药物组合物可，例如静脉内、皮下、肌内或鼻内给予。为这样的目的，药物组合物的病毒可以合适的注射或吸入形式提供。在一些形式中，本公开内容的活减毒病毒可包括在用于以吸入或注射形式施用病毒至受试者的装置中。包括本文公开内容的活减毒病毒的药物组合物可以本身已知的方式制造，例如，通过常规混合、溶解、粒化、制锭、磨细、乳化、包封、内陷或冻干过程。组合物可以是免疫原性组合物，例如疫苗。形成本公开内容的疫苗组合物的主要组分的相应疫苗可包括单一抗原、抗原组合、单一病毒或病毒组合—例如，相同类型的至少两种或三种病毒，包括一种或多种重配株。任何本发明的免疫和治疗方法的某些形式进一步包括给予受试者至少一种佐剂。适合用于基于蛋白和核酸的疫苗二者的许多佐剂，包括微粒佐剂，和混合佐剂与抗原的方法，是本领域技术人员众所周知的。用于基于核酸的疫苗的合适的佐剂包括但不限于，quila、咪喹莫特、瑞喹莫德和白细胞介素-12，以纯化的蛋白或核酸形式递送。适合用于蛋白免疫的佐剂包括但不限于，明矾、弗氏不完全佐剂(fia)、皂苷、quila和qs-21。本公开内容的药物组合物的示例性的给予途径包括口服、经皮和胃肠外递送。合适的给予途径可例如包括贮库、口服、直肠、经粘膜或肠内给予；胃肠外递送，包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。作为说明性的实例，对于注射，根据本公开内容的药物组合物可配制为水性溶液，例如在生理学相容的缓冲液例如汉克斯溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液中。对于口服给予，相应的药物组合物可通过混合病毒与本领域众所周知的药学上可接受的载体，容易地配制。这样的载体能够使本发明的病毒作为片剂、丸剂、锭剂、糖锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等配制，用于由待治疗的患者口服摄取。口服施用的药物制剂可通过以下来获得：加入固体赋形剂，任选地研磨得到的混合物，和加工颗粒混合物，如果需要的话，加入合适的辅料后，得到片剂或锭剂核心。具体而言，合适的赋形剂是填充剂例如糖，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；淀粉和其衍生物，例如玉米淀粉、糊精和小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、羟基丙基淀粉、小麦淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)或其组合；纤维素制剂，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟基丙基纤维素；无机化合物，例如氯化钠、硼酸、硫酸钙、磷酸钙和沉淀碳酸钙。如果需要，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸，或其盐例如藻酸钠。锭剂核心用合适的包衣提供。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛或其组合；漆溶液；和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可加入片剂或锭剂包衣，用于识别或表征不同的病毒剂量组合。合适的流化剂包括但不限于，氧化镁、合成硅酸铝、偏硅酸(metasilicicacid)、氧化镁铝、含水硅酸、无水硅酸、滑石粉、硬脂酸镁和高岭土。合适的粘合剂包括但不限于，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、阿拉伯胶、西黄蓍胶、藻酸钠、明胶和谷蛋白。合适的稳定剂包括但不限于，蛋白例如白蛋白、鱼精蛋白、明胶和球蛋白；和氨基酸和其盐。合适的增稠剂包括但不限于，蔗糖、甘油、甲基纤维素和羧甲基纤维素。合适的ph调节剂包括但不限于，盐酸、氢氧化钠、磷酸盐、柠檬酸盐和碳酸盐。可口服使用的药物组合物包括但不限于，由明胶制成的推配式胶囊，以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推配式胶囊可包含活减毒病毒与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉、润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)或二者，和任选稳定剂的混合物。在软胶囊中，病毒可溶于或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可加入稳定剂。口服给予的所有制剂应为适合于这样的给予的剂量。对于含服给予，相应的药物组合物可呈以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。对于通过吸入给予，根据本公开内容使用的药物组合物可以喷雾剂呈递的形式从加压包或喷雾器方便地递送，其使用合适的抛射剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。可配制用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，其包含病毒和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。可配制用于通过注射(例如，通过推注或连续输注)胃肠外给予的相应的药物组合物。用于注射的制剂可以单位剂型，例如，在安瓿或多剂量容器(添加有防腐剂)中提供。组合物可呈这样的形式，例如在油性或水性媒介中的混悬剂、溶液剂或乳剂，和可包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂、分散剂或其组合。用于胃肠外给予的药物制剂包括水溶性形式的病毒的水性溶液。另外，病毒混悬剂可作为合适的油性注射混悬剂制备。合适的亲脂溶剂或媒介包括脂肪油，例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬剂可包含增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。在一些形式中，活性成分，例如本文所述的病毒，可为粉末形式，其在使用前用合适的媒介例如，无菌无热原(spf)水溶解。合适的哺乳动物的实例包括但不限于，小鼠、大鼠、牛、山羊、绵羊、猪、狗、猫、马、豚鼠、犬科动物、仓鼠、水貂、海豹、鲸、骆驼、猩猩、猕猴和人。2.剂量本公开内容的减毒病毒的剂量和需要的浓度可根据预期的特定用途而改变。合适的剂量或给予途径的确定在普通医师的技能范围内。对于确定人预防和治疗用途的有效剂量，动物实验提供可靠的指导。有效剂量的物种间缩放可根据mordenti,j.和chappell,w."theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics"intoxicokineticsandnewdrugdevelopment,yacobi等编辑,pergamonpress,newyork1989,pp.42-96设定的原则进行。给予的物质的量或剂量应该足以在合理的时间范围内在受试者中实现治疗或预防反应。例如，物质的剂量应该足以预防由未减毒的野生型病毒导致的有症状感染。剂量应该足以刺激免疫反应，以治疗或预防野生型病毒感染，或二者。用于确定给予的剂量的许多测定法是本领域已知的。为本发明的方法的目的，可进行这样的测定法，其包括比较在对给予一组哺乳动物的数个不同剂量的减毒病毒的反应中存在的抗病毒抗体和免疫细胞类型。所述剂量也可通过可能伴随给予的任何不良副作用的存在、性质和程度确定。当确定剂量时可考虑各种因素，例如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、给予的物质、给予途径和治疗的病况的严重性。对于受试者例如哺乳动物成年生物体的活减毒病毒疫苗的剂量可以是约102至约1015，例如，约103至约1012、约103至约1010、约103至约108、约105至约108、约103至约106、约104至约108、约104至约107、约104至约106或约104至约105噬斑形成单位(pfu)/kg，或其中的任何范围或值。然而，该剂量应该是安全和有效的量，如使用现有疫苗作为起始点，通过常规方法测定的。根据本公开内容使用的药物组合物可以常规方式，使用一种或多种药学上可接受的载体配制，所述载体包括赋形剂和辅料，其促进加工病毒为可在药学上使用的制剂。合适的制剂取决于选择的给予途径。组合物，包括其组分，如果其给予可被接受的受试者耐受，则被认为是“药学上可接受的”。如果给予的量是生理学上有意义的，则这样的试剂被认为以“治疗有效量”给予。如果其存在导致在接受的受试者的生理学中可检测的变化，例如，提高针对感染性病毒的至少一种毒株的至少一种主要体液或第二种体液或细胞免疫反应，则本公开内容的组合物是生理学上有意义的。在一些形式中，本文所述的活减毒病毒和药物组合物的有效剂量可通常包括每次给予每剂量约102p.f.u.、103p.f.u.、104p.f.u.、105p.f.u.、106p.f.u.、107p.f.u.、108p.f.u.、109p.f.u.或更多。给予速度可改变。通常，给予速度可以是例如，一个月一次、每三个月一次、每六个月一次、一年一次或按需要加强接种疫苗。实施例实施例1.合成的病毒基因和重组体病毒的产生材料和方法流感a/brisbane/59/2007(h1n1)在本研究中用作原型病毒。在我们之前的研究中已建立了来自具有人或禽类来源的病毒的各病毒片段的数据集(wong等,bmcevolutionarybiology,10:253(2010))。比较从各片段特异性的数据集观察到的密码子选择偏好与相应的对应物(例如，人pb2对比禽类pb2)。为了产生在具有禽类-样病毒密码子选择偏好的各病毒片段中具有最大开放读码框(orf)的重组体a/brisbane/59/2007病毒，比较野生型a/brisbane/59/2007的片段特异性密码子选择频率与从禽类流感序列推论的那些。该分析允许确定引入原型病毒以将其密码子偏好从人-样改变为禽类-样所需要的突变数量(表6和7和seqidnos:1-16)。为了避免影响对于病毒复制必需的关键病毒rna信号，将突变引入不涉及1)vrnp包装和2)剪接和3)编码多个病毒蛋白的区域(gog等,nucleicacidsresearch35(6):1897-1907(2007);moss等,rna,17:991-1011(2011))。除了本文所述的关键区域之外，突变随机地，但均匀地分布在目标病毒rna片段(seqidnos:1-16)中。特别地，这些突变被引入在氨基酸水平(>99%)，而非在核苷酸水平上高度保守的位点。使用标准回复遗传技术(hoffmann等,proc.natl.acad.sci.usa,97(11):6108-6113(2000))，产生重组体流感病毒。所有合成的基因被亚克隆至双重病毒rnn蛋白表达构建体(phw2000)(hoffmann等,proc.natl.acad.sci.usa,97(11):6108-6113(2000))。结果总共合成了2组a/brisbane/59/2007病毒基因组，对于野生型病毒序列的一组和具有禽类-样密码子选择偏好的一组。商业合成了突变的病毒序列。野生型和突变体病毒的rna序列以seqidnos:1-16提供(按常规以dna表示)。总共373个核苷酸突变，对应于351种密码子突变，被引入a/brisbane/59/07(h1n1)基因组(表7)，和所有这些核苷酸变化是沉默突变。在引入这些突变至病毒基因组后，得到的a/brisbane/59/2007突变体具有编码野生型a/brisbane/59/2007病毒蛋白的病毒基因组，但具有禽类-样病毒密码子选择偏好的各片段具有最大orf。还研究了突变的orf的核苷酸频率、二核苷酸频率和自由能。总体上，发现突变的序列更类似于从禽类序列观察到的那些。产生了野生型病毒、具有8个突变片段的突变体(后文称为8-mut)和具有1-4个突变片段的突变体(表8)。将拯救的病毒在胚胎蛋中扩增和通过测序证实这些病毒的身份。表6.具有禽类密码子选择偏好的a/brisbane/59/07(h1n1)流感病毒的构建。a百分比通过核苷酸突变的数量除以相应片段的全长计算。b百分比通过密码子突变的数量除以相应的蛋白的氨基酸数量计算。对于pb1、m和ns片段，次要蛋白产物pb1-f2、m2和ns2蛋白在计算中排除，因为没有突变被引入这些区域。表7.被引入a/brisbane/59/2007的orf的突变数量表8.在本研究中产生的密码子偏好突变体。awt：野生型片段；m：突变的片段相对于a/brisbane/59/07病毒的野生型基因组序列，在8-mut病毒中每个突变的核苷酸的位置和核苷酸变化在表9、10和11中提供。野生型a/brisbane/59/07病毒基因组和相应的8-mut病毒基因组的每个片段的完整序列以seqidnos:1-16提供。相对于a/puertorico/8/34(a/pr/8/34或pr/8)病毒的野生型基因组序列，在8-mut病毒中每个突变的核苷酸的位置和核苷酸变化在表12、13和14中提供。野生型a/puertorico/8/34病毒基因组和相应的8-mut病毒基因组的每个片段的完整序列以seqidnos:17-32提供。表9.相对于野生型a/brisbane/59/07(wt)病毒基因组序列的相同位置的核苷酸，对于片段pb2、pb1和pa，在8-mut(mut)病毒中核苷酸变化和它们的位置的列表。ntd=核苷酸。表10.相对于野生型a/brisbane/59/07(wt)病毒基因组序列的相同位置的核苷酸，对于片段ha、np和na，在8-mut(mut)病毒中核苷酸变化和它们的位置的列表。ntd=核苷酸。表11.相对于野生型a/brisbane/59/07(wt)病毒基因组序列的相同位置的核苷酸，对于片段m和ns，在8-mut(mut)病毒中核苷酸变化和它们的位置的列表。ntd=核苷酸。实施例2.8-mut病毒在哺乳动物细胞中和在小鼠中被减弱材料和方法在哺乳动物细胞(mdck和a549细胞)和胚胎蛋中测定wt和8-mut病毒的病毒复制动力学。为了评价该病毒在小鼠中是否被减弱，各组5只雌性balb/c小鼠经鼻内感染6.75x105p.f.u.的wt或8-mut病毒。为了确定8-mut病毒是否仍能够体内诱导中和抗体，在感染后28天通过微量中和测定法检查来自感染的小鼠的血清样品。各组雌性balb/c小鼠(n=3)经鼻内感染6.75x105p.f.u.的wt或8-mut病毒。在感染后28天收集血清用于针对wt和8-mut病毒的微量中和测定法。在同一组中来自各小鼠的相等体积的血清被合并用于分析。血清经热灭活和从1:10至1:1280连续2-倍稀释。加入血清以中和100tcid50/35µl的病毒，以阻止它们感染mdck细胞。在中和2小时后，将混合物加入mdck细胞，3天后观察细胞病变作用。获得中和至少50%的病毒感染性的血清的最高稀释度的倒数，作为效价。对于tcid50测定法，病毒用0.5log连续稀释进行稀释，和用于接种4孔mdck细胞。3天后，通过观察对mdck细胞的细胞病变作用判断各孔中感染性病毒的存在。病毒效价使用reed和muench方法测定。1tcid50代表病毒的量将在50%的接种细胞培养物中产生细胞病变作用。此外，在感染后第7天从免疫的小鼠收集支气管肺泡灌洗(bal)液，用于免疫细胞分析。还研究了在感染的人a549细胞中病毒蛋白的表达。细胞经模拟物-感染(模拟物)或用野生型(wt)或8-muta/brisbane/59/2007病毒以5多重性感染(m.o.i.)感染，和在感染后8小时收获。总细胞裂解物通过蛋白质印迹，使用所示的病毒蛋白-特异性抗体分析。β-肌动蛋白用作蛋白上样对照。结果发现在mdck细胞中8-mut病毒的复制被减弱(图1a,>1log)。在a549细胞中8-mut甚至更被减弱(图1b)和其病毒效价为小于野生型至少2log。相比之下，野生型和8-mut病毒在蛋中具有相当的效价(图1c)。此外，发现在mdck细胞中8-mut病毒的噬斑尺寸小于野生型。野生型和突变基因的表达在感染的人a549人细胞中证实。所有突变的基因翻译成蛋白，如通过蛋白质印迹证实的，表明突变的基因全部是有功能的。被wt病毒感染的小鼠显示短暂的重量损失，而被8-mut病毒感染的那些不显示任何重量损失或生病(图2a)。为了检查它们在小鼠中的复制，在感染后第3天和第7天收获的肺组织中的病毒效价通过tcid50测定法来滴定。在被8-mut感染的小鼠中的病毒效价是从wt-感染的小鼠观察到的那些的约1/40(图2b)，表明8-mut在小鼠中被减弱。在感染后第7天在被wt或8-mut病毒感染的小鼠中未检出感染性病毒(数据未显示)。发现被wt或8-mut感染的小鼠具有针对wt和8-mut二者的类似中和效价(抗体效价：1:640至1:1280)(表15)。如图3所示的，在小鼠中wt和8-mut病毒感染二者可诱导高度类似的免疫细胞特征。总体上，这些结果表明，在各种哺乳动物模型中8-mut被减弱。但其在蛋中的复制不受影响。感染8-mut的小鼠没有明显的临床迹象，和产生稳健的抗体-介导的和细胞-介导的反应。表15.来自微量中和测定法的数据。实施例3.8-mut病毒保护小鼠免于病毒攻击。材料和方法为了确定8-mut是否可在小鼠中诱导免疫保护，感染的小鼠随后进行同源或异源攻击。各组6只balb/c小鼠经鼻内接种6.75x105p.f.u.的8-mut病毒，或用pbs经模拟物-接种。在接种后第28天，接种或模拟物接种的小鼠用4.3x105p.f.u.的小鼠适应性a/brisbane/59/07病毒(ma-wt)病毒攻击。在攻击后第3和7天收获来自处理的小鼠的肺组织，用于病毒滴定和免疫组织化学染色。结果因为wt病毒仅可在小鼠中引起轻度重量损失(图2a)，更具病原性的小鼠适应性a/brisbane/59/07病毒(ma-wt)(xu等,plosone,6(12):e28901(2011))用于攻击。pbs-接种的小鼠显示中度卷毛和轻度体态隆起，并具有显著的重量损失(图4a)。相比之下，接种的小鼠显示未显示症状，和没有重量损失。在感染后第3天，在pbs-处理的小鼠中，而非在接种的小鼠中检出高水平的病毒复制(图4b)。此外，在攻击后第3天，仅在模拟物-接种的小鼠中检出表达流感np蛋白的细胞。在攻击后第7天在两个组中未检出流感病毒-阳性细胞。然而，在模拟物-接种的小鼠中，而非在用8-mut病毒接种的小鼠中观察到肺的实变。在接种的小鼠中还进行异源攻击(即，感染不同遗传背景的病毒)。小鼠按上所述接种。小鼠用高度致死的病毒株(a/pr/8/1934;h1n1)以极度高的致死剂量(100ld50)攻击。所有模拟物-接种的对照小鼠达到人道实验终点(>25%重量损失)和安乐死。相比之下，6只接种的小鼠中仅1只死于攻击(图5a和5b)。8-mut能够诱导针对由异源病毒引起的感染的保护作用。因此，8-mut病毒能够在宿主中产生异亚型免疫保护。在接种的小鼠中还进行用不同病毒亚型的病毒的异源攻击。小鼠用8-mut病毒按上所述接种(亚型h1n1，见实施例1)。然后在接种后28天，小鼠用6.71x105pfu的ma20c病毒(小鼠适应性a/hk/68;亚型h3n2)攻击。监测6只小鼠的体重14天。接种的小鼠具有更少的重量损失和更早的恢复(图6)。数据表示均值±sd。*表示p-值<0.05,**表示p-值<0.001。用8-mut接种的小鼠被保护免于h3n2感染(图6)，表明密码子偏好突变体可诱导异亚型保护。这些结果表明，8-mut病毒可诱导针对同源/异源病毒攻击的保护作用。这些广泛反应性疫苗-诱导的反应证实，公开的策略和方法可用于产生能够产生广泛保护性免疫的疫苗。实施例4.可操纵病毒减弱的水平。为了排除上述病毒减弱仅由突变的病毒片段之一引起的可能性，具有不同的野生型和突变片段组合(表8)的病毒被拯救，和研究它们在mdck细胞中的复制动力学。在wt病毒和具有1个突变片段的病毒的生长之间没有显著不同(图7a)。发现带有几个突变片段(例如，ha/na/m和m/ns)的病毒具有中等生长减弱，但它们的复制速度仍显著高于8-mut(图7b)。此外，发现具有1-4个突变的病毒片段的变体全部具有类似于wt病毒的噬斑尺寸。总之，这些结果表明，8-mut在哺乳动物细胞中的减弱通过引入多个突变的病毒片段引起。更重要的是，这些结果进一步表明，病毒减弱的水平可通过在病毒基因组中引入不同数量的突变片段来操纵。实施例5.8-mut病毒作为母病毒用于疫苗生产。材料和方法为了在蛋中实现高病毒产量，野生型季节性流感病毒通常用母株重配，以产生疫苗毒株用于商业化疫苗生产(即，源自季节性毒株的ha和na片段和源自母株的pb2、pb1、pa、np、m和ns片段)。为了确定8-mut病毒是否具有用作制备疫苗毒株的母株的潜力，其ha和na片段源自其它流感a病毒(h1n1:a/pr/8/1934;h3n2:a/hk/1/1968)和所有其它片段来自8-mut病毒(即，pb2,pb1,pa,np,m和ns片段)的重组体病毒按实施例1所述产生。结果两种得到的重组体病毒可在蛋中实现良好的病毒产量，和在感染后48小时，它们的产量与它们的相应对照相当(表16)。更重要的是，发现所有这些重组体突变体在哺乳动物细胞中被减弱。然而，在对照中未观察到在哺乳动物细胞中这样的减弱。接种mut+hk68-hn病毒的小鼠受到完全保护免于被小鼠适应性a/hk/1/1968病毒攻击(图8a和8b)。这些结果表明，我们的策略能够产生用于疫苗生产的母病毒株。表16.用编码来自相同病毒亚型(mut+pr8-hn)或不同病毒亚型(mut+hk68-hn)的基因的重组体病毒感染的mdck细胞和蛋的病毒效价*病毒效价在感染后48小时测定。mut+pr8hn突变体的生长速度在哺乳动物系统中被减弱(图9b和9c)。病毒在人a549细胞中被显著减弱(图9b)，和在mdck(犬肾)细胞中略微减弱(图9c)。相比之下，该突变体在蛋中不减弱(图9a)。mut+pr8hn突变体在小鼠中也显著减弱(图10)。在人a549细胞和蛋中测试mut+hk68hn的生长速度。该突变体在哺乳动物细胞中明显减弱(图11a和11b)。实施例6.具有禽类密码子选择偏好的8-muta/pr/8/34流感病毒的构建。材料和方法使用实施例1中描述的方法，产生a/pr/8/34病毒的密码子偏好突变体(表12-14和17)。结果该病毒是众所周知的用于疫苗生产的母株。发现该突变体在蛋中的产量与野生型水平相同(图12)。此外，突变体经证实在小鼠中被减弱(图13a)。测试了野生型a/pr/8/34(pr8wt)病毒和其密码子偏好突变体(pr8mut)的病原性。被100pfu/剂的pr8mut感染的小鼠从感染中恢复，而被相同剂量的a/pr/8/34野生型病毒感染的那些则未恢复(图13b)。表17.具有禽类密码子选择偏好的a/pr/8/34流感病毒的构建。a百分比通过核苷酸突变的数量除以相应片段的全长计算。b百分比通过密码子突变的数量除以相应的蛋白的氨基酸数量计算。对于m和ns片段，m2和ns2蛋白在计算中排除，因为没有突变被引入这些区域。图14a和14b证实了用野生型a/pr/8/34病毒的禽类密码子选择偏好突变体(pr8mut)接种的小鼠受到保护免于10x致死剂量的野生型a/pr/8/34病毒。这些结果证实，(1)使用禽类密码子选择偏好以产生具有不同的遗传背景的减毒病毒的可行性，和(2)a/pr/8/34突变体作为用于疫苗生产的母株的用途。实施例7.具有禽类密码子选择偏好的突变的a/pr/8/34流感病毒可形成用于接种疫苗的母株。材料和方法该方法按实施例1和5所述进行。结果重组体病毒通过使用具有禽类密码子选择偏好的突变的a/pr/8/34流感病毒的所有内部基因(pb2,pb1,pa,np,m和ns)和高度病原性a/indonesia/5/2005(h5n1)的表面糖蛋白基因(ha和na)产生。病毒被成功拯救。该重组体病毒可用作母株以针对高度病原性病毒亚型进行接种。总之，实施例表明，当病毒用作疫苗时，至少两种不同的8-mut病毒的产生能够产生同亚型和异亚型免疫保护二者。这些结果概述于下表18。这些结果，连同来自a/brisbane/59/2007的密码子偏好突变体的那些，证实了本文所述的方法产生活减毒病毒株和用于疫苗生产的母株的特征和有用性。表18.产生的突变病毒和当病毒用作疫苗时在小鼠中观察到的免疫保护作用。应理解，所公开的方法和组合物不限于描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可改变。还应理解，本文使用的术语仅为描述具体形式的目的，和不意图限制本发明的范围，其仅由随附的权利要求书限定。必须注意，本文和随附权利要求书中使用的单数形式"a"、"an"和"the"包括复数指代物，除非上下文另外清楚指明。因此，例如提及"密码子"包括多个这样的密码子，提及"活减毒"是指提及一种或多种活减毒病毒和本领域技术人员已知的其等同物，等等。在本说明书的描述和权利要求全文中，词语“包含(comprise)”和该词语的变型，例如“comprising”和“comprises”意指“包括但不限于”和不意图排除例如，其它添加物、组分、整数或步骤。“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、环境或材料可以发生或存在，或者可以不发生或存在，和该描述包括其中所述事件、环境或材料发生或存在的情况，和其中所述事件、环境或材料不发生或不存在的情况。在文本中，范围应表述为从"约"一个具体值至"约"另一个具体值，或二者。当表述这样的范围时，还特别意图和考虑公开了从一个具体值至另一个具体值的范围，或二者，除非上下文明确另外指明。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解该具体值形成另一个特别预期的形式，其应视为被公开，除非上下文另外明确指明。还应理解，每个范围的端值，相对于另一个端值，和独立于另一个端值，均是有效的，除非上下文明确另外指明。应理解，在明确公开的范围内包含的所有单个值和值的子范围也被明确考虑，和应视为被公开，除非上下文明确另外指明。最后，应理解，所有范围是指叙述的范围作为一个范围和作为从第一个端值至第二个端值(包括第一个端值和第二个端值)的各个数字的合集。在后一情况下，应理解，任何单个值可选择作为范围所指的数量、值或特征的一种形式。以此方式，范围描述了从第一个端值至第二个端值(包括第一个端值和第二个端值)的一组数字或值，可从其中选择该组的单个成员(即，单个数字)作为范围所指的数量、值或特征。不管在具体的情况下一些或所有这些形式是否被明确公开，前述内容均适用。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管类似或等同于本文描述的那些的任何方法和材料可用于实施或测试本发明的方法和组合物，但描述了特别使用的方法、装置和材料。本文引用的出版物，和它们所引用的材料，通过引用明确结合到本文中。本文不应解释为承认由于在先发明，本发明没有资格早于这样的公开内容。不承认任何参考资料构成现有技术。参考资料的论述说明了它们的作者的断言，和本申请人保留质疑引用的文献的准确性和相关性的权利。清楚理解的是，尽管本文引用了许多出版物，但这样的参考资料不构成承认任何这些文献形成本领域的公知常识的一部分。尽管材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可包括许多选项和替代方案，但这不应解释为，和不承认，这样的选项和替代方案彼此等同，或者特别是明显的替代方案。因此，例如，不同的突变密码子的列表不表示所列的突变密码子彼此是显而易见的，也不承认等同性或明显性。本领域技术人员使用不超过常规实验，将认识到或能够确认对本文所述的方法和组合物的特定形式的许多等同方案。这样的等同方案意图包括在随附权利要求书中。seqidno:1agcaaaagcaggtcaattatattcaatatggaaagaataaaagagctaaggaatttgatgtcacaatctcgcactcgcgagatacttaccaaaactactgtagaccacatggccataatcaagaaatacacatcaggaagacaggagaaaaacccatcacttaggatgaaatggatgatggcaatgaaatacccaattacagctgataaaaggataacggaaatgattcctgaaagaaatgagcatggacagacattatggagtaaggtgaatgatgccggatcagaccgagtgatggtatcacccctggctgtgacatggtggaacagaaatggaccagtggcaagtactattcactatccaaaaatctacaaaacttactttgaaaaggttgaaaggttaaaacaaggaacctttggccctgtacactttagaaaccaagtcaaaatacgccgaagagtcgacataaatcctggtcatgcagacctcagcgccaaggaggcacaggatgtaattatggaagttgttttccctaatgaagtaggagccagaatactaacatcagaatcgcaattaacgataaccaaggagaaaaaagaagaactccagaattgcaaaatttcccctttgatggttgcatacatgttagagagggaacttgtccgcaaaacaagatttctcccggttgcaggtggaacaagcagtgtgtacattgaagttttgcatttaacacaggggacatgctgggagcagatgtacactccaggtggggaggtgaggaatgatgatgttgatcaaagcctaattattgctgctaggaacatagtgagaagagctgcagtatcagcagatccactagcatctttattagaaatgtgccatagcacacagattggtggaacaaggatggtggatattctcaggcaaaatccaacagaagaacaagctgtggatatatgcaaggcagcaatggggctgagaatcagctcatccttcagttttggcggattcacatttaagagaacaagtggatcatcagtcaaaagggaggaagaagtgctcacgggcaatctgcaaacattgaaactaaccgtgcatgagggatatgaagagttcacaatggttgggaaaagggcaacagctatactcagaaaagcaaccaggagattgattcaactaatagtgagtggaagagacgaacaatcaatagtcgaagcaatagttgtagcaatggtattctcacaagaagattgcatggtaaaagcagttagaggtgatctgaatttcgttaatagagcgaatcagcggttgaatcccatgcatcaactattgagacattttcagaaggatgctaaagtacttttcttaaattggggagttgaacctattgacaatgtgatgggaatgattgggatattacctgatatgactccaagtaccgagatgtcaatgagaggagtgagagtcagcaaaatgggtgtagatgaatactccaatgctgaaagggtagtggtaagcattgaccgttttttgagagtccgggaccaaagaggaaatgtactactgtctccagaggaagtaagtgaaacacaagggacagagaaactgacaataacttactcttcatcaatgatgtgggagattaatggccctgagtcagtcttgatcaatacctatcagtggatcatcagaaactgggagactgttaaaattcagtggtctcagaatcctacgatgctgtacaataaaatggaatttgaaccatttcagtctctagtccccaaggccattagaggccaatacagtgggtttgttagaactctattccaacaaatgagggatgtgcttgggacttttgacacaactcagataataaaacttcttccctttgcagccgctcctccaaagcaaagcagaatgcaattctcgtcattaactgtgaatgtgaggggatcaggaatgagaatacttgtgaggggtaattctc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