本发明涉及二苯乙炔化合物。本发明还涉及用二苯乙炔化合物修饰而成的肽核酸。本发明还涉及包含肽核酸的试剂盒。
背景技术：
：为了检测被认为为基因诊断、定制疗法、特制疗法等提供有用的信息的单核苷酸多态性(snp)，认为碱基对匹配时(在形成完全互补链时)获得的tm值与碱基对错配时(在形成不完全互补链时)获得的tm值之间的差值(以下称为“δtm值”)越大则越优选。特别是，当δtm值大于10℃时，已知可以提供一种优异的诊断方法，其中进行基于单核苷酸多态性的基因诊断时的误诊率低于1％。近年来，从稳定性高的角度出发，已知作为一种核酸类似物的肽核酸受到人们的关注。用这种肽核酸检测单核苷酸多态性的技术的开发也得到了推进(非专利文献1和2)。对于涉及用肽核酸检测单核苷酸多态性的技术，非专利文献2中描述的这种肽核酸没有显示出足以检测单核苷酸多态性的δtm值。具体而言，当目标dna链中位于从n-末端开始第二个位置的碱基存在错配时，其δtm值为约6.4℃或更小。现有技术文献非专利文献非专利文献1：分子药剂学(molecularpharmaceutics)(2012)9,685-693非专利文献2：g.l.igloi,proc.natl.acad.sci.usa(1998),95,8562-8567技术实现要素：本发明要解决的技术问题本发明的目的在于提供有效检测单核苷酸多态性的肽核酸，特别是能够进一步提高在碱基对匹配时获得的tm值的肽核酸。本发明的另一个目的在于提供对该肽核酸的制备而言有用的中间体(生产原料)。解决技术问题的技术手段本发明的发明人为了实现上述技术问题而进行了深入研究，结果发现，通过将特定的二苯乙炔化合物键合到n-末端而制备的肽核酸在检测单核苷酸多态性方面是有用的。基于这样的发现完成了本发明，并且本发明包括以下方面。i.二苯乙炔化合物(i-1)一种下式(1)表示的二苯乙炔化合物：[化学式1]式中，r1代表苯基或萘基；该苯基可具有1-5个彼此相同或不同的取代基；该萘基可具有1-7个彼此相同或不同的取代基。(i-2)根据项(i-1)所述的二苯乙炔化合物，其中所述取代基为吸电子基团。(i-3)根据项(i-2)所述的二苯乙炔化合物，其中所述吸电子基团为选自以下中的至少一种：氰基、硝基、酰基、卤素、甲苯磺酰基、甲磺酰基和苯基。ii.制备二苯乙炔化合物(i)的方法(ii-1)一种制备项(i-1)所述的二苯乙炔化合物(i)的方法，该方法包括使下式(2)表示的化合物(2)与脱保护剂相互反应的步骤：[化学式2]式中，r1与项(i-1)所述相同，并且r2代表羧基的保护基团。(ii-2)根据项(ii-1)所述的制备方法，其中所述项(i-1)中所述的式(1)中的r1所具有的取代基为吸电子基团。(ii-3)根据项(ii-2)所述的制备方法，其中所述吸电子基团为选自以下中的至少一种：氰基、硝基、酰基、卤素、甲苯磺酰基、甲磺酰基和苯基。iii.肽核酸(iii-1)下式(3)表示的二苯乙炔修饰的肽核酸：[化学式3]式中，r1如项(i-1)中所述，并且r3代表肽核酸残基。(iii-2)根据项(iii-1)所述的肽核酸，其中所述肽核酸残基是下式(4)表示的残基：[化学式4]式中，碱基彼此相同或不同，并且各自代表腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；和n为6-25的整数。(iii-3)根据项(iii-1)或(iii-2)所述的肽核酸，其中所述项(i-1)中所述的式(1)中的r1所具有的取代基为吸电子基团。(iii-4)根据项(iii-3)所述的肽核酸，其中所述吸电子基团为选自以下中的至少一种：氰基、硝基、酰基、卤素、甲苯磺酰基、甲磺酰基和苯基。(iii-5)根据项(iii-1)-(iii-4)中任一项所述的肽核酸，其中所述肽核酸残基含有氨基酸残基和/或间隔基(spacer)。(iii-6)根据项(iii-1)-(iii-5)中任一项所述的肽核酸，其经化学修饰而成。(iii-7)根据项(iii-6)所述的肽核酸，其中化学修饰为选自以下中的至少一种：乙酰化、甲酰化、肉豆蔻酰化、焦谷氨酸化、烷基化、糖基化、酰胺化、酰化、羟基化、脱氨基、异戊烯化、棕榈酰化、磷酸化、生物素化和琥珀酰亚胺化。iv.试剂盒(iv-1)一种试剂盒，其包含项(iii-1)-(iii-7)中任一项所述的肽核酸(3)。(iv-2)根据项(iv-1)所述的试剂盒，其中，试剂盒用于检测选自以下中的至少一种：耐药性细菌、耐药性病毒和耐药性支原体。(iv-3)根据项(iv-2)所述的试剂盒，其中所述耐药性病毒为流感病毒。(iv-4)根据项(iv-3)所述的试剂盒，其中所述流感病毒是耐奥司他韦的。本发明的有益效果肽核酸(3)在检测单核苷酸多态性的错配方面是有用的。包括肽核酸(3)的试剂盒在基于单核苷酸多态性的错配的检测的基因诊断或定制治疗(特制治疗)等方面是有用的。二苯乙炔化合物(1)作为用于制备肽核酸(3)的原料(中间体)是有用的。附图说明图1为显示直接比较肽核酸(对照；ctrl)与肽核酸5(pna5)的序列选择性(δtm值)的图(实验例2)。图2为根据实验例3中描述的免疫色谱法，用于检测耐奥司他韦型流感病毒的实验的示意图。图3为显示根据实验例3中描述的免疫色谱法，用于检测耐奥司他韦型流感病毒的实验结果的摄影图像。具体实施方式i.二苯乙炔化合物二苯乙炔化合物(i)为下式(1)表示的化合物。[化学式5]式(1)中的r1代表苯基或萘基。所述苯基可具有彼此相同或不同的1、2、3、4或5个取代基。所述萘基可具有彼此相同或不同的1、2、3、4、5、6或7个取代基。设置所述取代基的位置没有特别限制。例如，当所述r1表示苯基时，取代基可以相对于键合到二苯乙炔结构上的苯基设置在邻位、间位和/或对位。此外，当r1表示萘基时，取代基可以相对于键合到二苯乙炔结构的萘基设置在1-位、2-位、3-位、4-位、5-位、6-位和/或7-位。在设置这些取代基的位置之中，从后述的实施例中本发明的二苯乙炔修饰的肽核酸的有用性的角度出发，当所述r1表示苯基时，优选设置在对位，当所述r1表示萘基时，优选设置在4-位。所述取代基没有特别限制。例如可列举出吸电子基团。可以给出选自以下的至少一种作为吸电子基团的具体实例：氰基、硝基、酰基、卤素、甲苯磺酰基、甲磺酰基和苯基。当所述r1表示苯基时，从避免与相邻碱基的空间位阻以及改善堆积效应的角度出发，优选为氰基或直链炔基，更优选为氰基。当所述r1表示萘基时，从避免与相邻碱基的空间位阻以及改善堆积效应的角度出发，优选为氰基或直链炔基，更优选为氰基。ii.制备二苯乙炔化合物(1)的方法二苯乙炔化合物(1)的制备方法如下：二苯乙炔化合物(1)可以通过使下式(2)表示的化合物(2)与脱保护剂相互反应来制备。[化学式6]如上所述，式(2)中的r1表示可具有1-5个取代基的苯基或可具有1-7个取代基的萘基。式(2)中的r2表示羧基的保护基团。羧基的保护基团没有特别限制。作为这样的基团，例如可列举出烷基、苄基、烯丙基和甲硅烷基等。在这些保护基团中，从酯的稳定性的角度出发，优选烷基或烯丙基，更优选烷基。在烷基中，最优选甲基。脱保护剂没有特别限制。通常可以采用已知的用于去除上述羧基的保护基团的脱保护剂。作为具体的脱保护剂，例如可列举出氢氧化锂(lioh)、三氟乙酸、钯(h2/pd-c)、四(三苯基膦)钯和乙酸等。在这些脱保护剂中，优选氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钠，更优选氢氧化锂。脱保护剂的使用量没有特别限制。相对于化合物(2)的使用量(1摩尔)，使用量通常可以为例如约1摩尔当量至约5摩尔当量，优选为约1.5摩尔当量至约4摩尔当量，更优选为约2摩尔当量至约3摩尔当量。上述的脱保护反应的条件没有特别限制。例如，可以适当地采用用于去除羧基的保护基团的条件。作为这样的条件通常可列举出以下条件：将化合物(2)和脱保护剂在溶剂(例如thf)中适当地冷却或加热至约0℃至约40℃。另外，为了获得高纯度的目标产物化合物，可以在上述的反应完成后，适当地组合并采用常用的分离步骤和/或常用的纯化步骤。作为这种分离或纯化步骤，例如可列举出色谱法、重结晶、萃取和蒸馏等。上述的化合物(2)是根据已知方法由已知化合物容易地制备的化合物。例如，可以通过适当地改进并采用已知交叉偶联反应中被称为薗头偶联反应(sonogashiracouplingreaction)的交叉偶联反，以下式(5)表示的化合物作为起始原料来制备化合物(2)。更具体而言，可列举出通过以下方法制备化合物(2)的方法：使下式(5)表示的化合物(5)，[化学式7]与下式(6)表示的化合物(6)或下述式(7)表示的化合物(7)，在钯催化剂、铜(i)化合物和碱的存在下相互反应。[化学式8]式(5)中的x表示卤素原子。由x表示的卤素原子没有特别限制。例如可列举出氯原子、溴原子、氟原子或碘原子。如上所述，式(5)中的r2表示羧基的保护基团。式(6)和式(7)中的r4彼此相同或不同，并且各自表示取代基。这样的取代基没有特别限制。例如可列举出吸电子基团。可以给出选自以下的至少一种作为吸电子基团的具体实例：三氟基、氰基、硝基、酰基、卤素、甲苯磺酰基、甲磺酰基和苯基。从避免与相邻碱基对的空间位阻的角度出发，式(6)中的吸电子基团优选为氰基、卤素或三氟基，更优选为氰基。从避免与相邻碱基对的空间位阻的角度出发，式(7)中的吸电子基团优选为氰基、卤素或三氟基，更优选为氰基。式(6)中的取代基的数量(m)可以设定为1、2、3、4或5个。此外，相对于键合到二苯乙炔结构上的苯基，设置这种取代基的位置可以设定为邻位、间位和/或对位。式(7)中的取代基的数量(p)可以设定为1、2、3、4、5、6或7个。此外，相对于键合到二苯乙炔结构上的萘基，设置这种取代基的位置可以设定为1-位、2-位、3-位、4-位、5-位、6-位和/或7-位。关于设置上述取代基的位置，如上所述，在式(6)的情况下，取代基优选设置在对位，并且在式(7)的情况下，取代基优选设置在4-位。钯催化剂没有特别限制。例如可列举出四氯钯(ii)酸钠、四(三苯基膦)钯(0)、二(三苯基膦)氯化钯(ii)和乙酸钯(ii)等。这些钯催化剂中，从反应性的角度出发，优选四氯钯(ii)酸钠、四(三苯基膦)钯(0)，更优选四氯钯(ii)酸钠。钯催化剂的使用量没有特别限制。相对于化合物(5)的使用量(1摩尔)，使用量通常可以为例如约0.001摩尔当量至约0.5摩尔当量，优选为约0.005摩尔当量至约0.05摩尔当量。铜(i)化合物也用作催化剂，且没有特别限制。例如可列举出卤化铜，如氯化铜、溴化铜和碘化铜等。在这些铜(i)催化剂中，从反应性的角度出发，优选碘化铜或溴化铜，更优选碘化铜。铜(i)化合物的使用量没有特别限制。相对于化合物(5)的使用量(1摩尔)，使用量通常可以为例如约0.001摩尔当量至约0.5摩尔当量，优选为约0.005摩尔当量至约0.05摩尔当量。碱没有特别的限制。例如可列举出碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、三乙胺、二乙胺、四甲基乙二胺(tmeda)和氢化钠等。在这些碱中，从反应性的角度出发，优选三乙胺，二乙胺等，更优选三乙胺。碱的使用量没有特别限制。相对于化合物(5)的使用量(1摩尔)，使用量通常可以为例如约1摩尔当量至约10摩尔当量，优选为约2摩尔当量至约4摩尔当量。化合物(6)的使用量和化合物(7)的使用量也没有特别限制。化合物(6)或化合物(7)可以，相对于化合物(5)的1摩尔使用量，以例如以下比例使用：任何这类化合物的使用量通常为约0.8摩尔当量至约5摩尔当量，优选为约1摩尔当量至约1.5摩尔当量。另外，制备上述的化合物(2)的反应的效率可以通过使用铜(i)化合物和钯催化剂之外的诸如2-(二叔丁基膦基)-1-苯基吲哚(pintb)等的其他催化剂，在四甲基乙二胺(tmeda)中与作为碱的其他催化剂进行反应来提高。这种其他催化剂的使用量没有特别限制。相对于化合物(5)的使用量(1摩尔)，使用量通常可以为例如约0.01摩尔当量至约0.5摩尔当量，优选为约0.1摩尔当量至约0.5摩尔当量。上述的交叉偶联反应的条件没有特别限制。例如，可以适当地采用该类反应中使用的条件。作为这种条件，通常可列举出以下条件：将化合物(5)与化合物(6)或(7)在氩气氛下在溶剂中适当地冷却或加热至约30℃至约80℃，溶剂为例如水-丙酮混合溶剂、水-1,4-二恶烷混合溶剂、水-四氢呋喃混合溶剂、水-二甲氧基乙烷混合溶剂、水-乙腈混合溶剂、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或水-四甲基乙二胺等。另外，为了获得高纯度的目标产物化合物(2)，可以在上述反应完成后适当地组合并采用常用的分离步骤和/或常用的纯化步骤。作为具体的分离或纯化步骤，例如可列举出色谱法、重结晶、萃取和蒸馏等。上述的化合物(5)、化合物(6)和化合物(7)各自为根据已知方法由已知化合物容易地制备的化合物。例如，化合物(5)可以通过适当地改进并采用已知的交叉偶联反应，以下述所示的化合物(8)作为起始原料来制备。具体而言，上述的化合物(5)可以通过以下方法制备，该方法包括使下式(8)表示的化合物(8)[化学式9]与下式(9)表示的化合物(9)，在碱的存在下相互反应。[化学式10]式(8)中的x与式(5)中所示的x相同。式(9)中的y表示卤素原子。由y表示的卤素原子没有特别限制。例如可列举出，氯原子、溴原子、氟原子或碘原子。另外，卤素原子(x)和卤素原子(y)可以是相同的原子，也可以是不同的原子。碱没有特别限制。例如可列举出碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、三乙胺、四甲基乙二胺(tmeda)和氢化钠等。在这些碱中，从反应性的角度出发，优选三乙胺，二乙胺等，更优选三乙胺。碱的使用量没有特别的限制。相对于化合物(8)的使用量(1摩尔)，使用量通常可以为例如约1摩尔当量至约5摩尔当量，优选为约1.5摩尔当量至约3摩尔当量。上述的交叉偶联反应的条件没有特别限制。例如，可以适当地采用该类反应中经常使用的条件。作为这种条件，通常可列举出以下条件：将化合物(8)和化合物(9)在诸如四氢呋喃的溶剂中适当地冷却或加热至等于或低于该溶剂的沸点的温度，例如约30℃至约66℃。另外，为了获得高纯度的目标产物化合物，可以在上述反应完成后适当地组合并采用常用的分离步骤和/或常用的纯化步骤。作为具体的分离或纯化步骤，例如可列举出色谱法、重结晶、萃取和蒸馏等。iii.肽核酸肽核酸(3)为下式(3)表示的二苯乙炔修饰的肽核酸。[化学式11]如上所述，式(3)中的r1表示可具有1-5个取代基的苯基或可具有1-7个取代基的萘基。r3代表肽核酸残基。肽核酸残基可以为从肽核酸n-末端的酰胺基中去除氢原子而得到的残基，并且没有特别限定。肽核酸是聚合物。构成聚合物的单体为具有以腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶等为代表的碱基作为其各自侧链的氨基酸。这样的氨基酸可以设定为具有氨基和羧基的化合物(广义上的氨基酸)。此外，通过这些单体的肽键合获得的聚合物为肽核酸。这种肽核酸的聚合数没有特别限制。例如，聚合数可以设定为6-25的任意整数。聚合数优选为8-23的整数，更优选为10-21的整数。所述单体所包含的碱基可以彼此相同或不同。因此，肽核酸中的碱基序列没有特别限制。具体而言，氨基酸进行肽键合的部分有时被称为“主链”。这种肽核酸为具有以下性质的化合物:该肽核酸与核酸例如dna或rna、或任何其它肽核酸，通过彼此的碱基而形成互补链。肽核酸优选为具有在形成双螺旋结构的同时形成互补链的性质的化合物。作为这种肽核酸残基，例如可列举出下式(4)表示的肽核酸残基。[化学式12]式(4)中的碱基彼此相同或不同，各自代表腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。式(4)中的n为6-25的整数。n优选为8-23的整数，并且更优选为10-20的整数。当式(4)中的碱基表示腺嘌呤时，键合由下式表示的基团，[化学式13]当式(4)中的碱基表示胸腺嘧啶时，键合由下式表示的基团，[化学式14]当式(4)中的碱基表示鸟嘌呤时，键合由下式表示的基团，[化学式15]当式(4)中的碱基表示胞嘧啶时，键合由下式表示的基团，[化学式16]当式(4)中的碱基表示尿嘧啶时，键合由下式表示的基团，[化学式17]上述的肽核酸残基可以包括氨基酸残基和/或间隔基。即，任意的氨基酸残基和/或任意的间隔基可以键合至上述的肽核酸残基上。在此，术语“键”是指肽键。与肽核酸残基键合的具体氨基酸残基没有特别限制。例如可列举出在侧链具有氨基的赖氨酸残基、组氨酸残基或精氨酸残基等。其中，优选设置赖氨酸残基。与肽核酸残基键合的氨基酸残基的数量没有特别限制。数量通常可以设定为约1至约10，并且优选设定为约1至约5。与上述的肽核酸残基键合的间隔基没有特别限制。例如可列举出具有羧基和酰胺基的化合物(所谓的广义上的氨基酸)。作为具体的间隔基，例如可列举出下式(10)表示的化合物(10)。[化学式18]此外，将上述的化合物作为单体的低聚物或聚合物可以作为上述的间隔基。作为上述的间隔基而列举的低聚物或聚合物的聚合数没有特别限制。聚合数可以设定为例如约2至约100，并且优选为约2至约50，更优选为约2至约10，还更优选为约2至约5，最优选为2。与上述的肽核酸残基键合的氨基酸残基或间隔基的位置没有特别限制。氨基酸残基或间隔基通常可以设置在肽核酸残基中或在其c-末端。氨基酸残基或间隔基优选设置在肽核酸残基的c-末端。与上述的肽核酸残基键合的氨基酸残基和/或间隔基可以分别通过肽键，以聚合的形式键合于肽核酸(iii)，或者可以单独键合于肽核酸(iii)。其中，优选进行聚合(即，以低聚物形式或聚合物形式)而键合至肽核酸残基，并且最优选低聚物或聚合物通过肽键以夹在氨基酸残基之间的状态键合至肽核酸残基。上述的肽核酸(3)可以包含经过化学修饰的肽核酸。作为具体的化学修饰，可列举出乙酰化、甲酰化、肉豆蔻酰化、焦谷氨酸化、烷基化、糖基化、酰胺化、酰化、羟基化、脱氨基、异戊烯化、棕榈酰化、磷酸化、生物素化和琥珀酰亚胺化等。对这些肽核酸(3)进行的化学修饰的种类不限于1种，也可以对其进行2种以上的化学修饰。在上述的化学修饰中，优选乙酰化、烷基化、糖基化、生物素化等，最优选生物素化。此外，在组合2种以上的化学修饰的情况下，优选至少包含生物素化。进行上述的化学修饰的位置没有特别限制。例如，化学修饰优选在设置于如上所述的肽核酸残基中的氨基酸残基上进行。(制备方法)制备肽核酸(3)的方法没有特别限制。例如，通过fmoc固相合成法，以构成肽核酸的下式表示的各种碱为原料，合成肽核酸残基(pna低聚物)。接着，以下述的制备例1中制备的各二苯乙炔化合物1-6为原料，将原料化合物通过固相合成法以经由肽键脱水缩合的方式引入合成的肽核酸残基的n-末端或c-末端。由此，可以制备肽核酸(3)。在后述的制备例2中描述了详细的制备方法。[化学式19]如后述的实施例所示，本发明的肽核酸(3)抑制对单碱基错配序列没有特异性的双链的形成，并且对感兴趣的目标碱基序列具有更高的序列特异性。因此，肽核酸可以用作在基因序列诊断中有用的分子，该分子能够严格区分彼此相邻的一对碱基的匹配或错配。换句话说，根据本发明的肽核酸(3)，可以更严格地执行单碱基突变检测(snp检测)，并且通过利用这种方法可以提供具有更高精度的测量方法或诊断方法。vi.试剂盒试剂盒包含上述的肽核酸(3)。在肽核酸(3)中，优选在其c-末端具有赖氨酸残基、且生物素与该赖氨酸残基的ε-氨基键合的生物素化肽核酸。试剂盒所包含的除肽核酸(3)以外的组成部分没有特别限制。例如可列举出，设置有在制备基于免疫色谱(ica)法的试剂盒时所需要的各种部件的测试条等。作为这样的部件，通常可列举出样品滴落部分(也称为“样品垫”)、含有标记抗体的部分(也称为“结合垫”)、检测部分(也称为“判定部分”)、控制部分和吸收部分等。本领域中常用的材料如硝化纤维素和胶乳等可以作为设置在测试条中的上述各个部件。此外，可以基于本领域中常用的技术来确定上述各个部件的布置。此外，各个部件应含有的物质也可以基于本领域常用的技术来确定。例如，优选在检测部分中设置用于捕获包含待检测物质和本发明肽核酸(3)作为组成部分的复合物的物质。具体而言，当使用生物素化肽核酸时，优选将已知与生物素有效地结合的抗生物素抗体或抗生物素蛋白化合物设置在检测部分中以有效地捕获所述的复合物。该试剂盒的应用没有特别的限制。例如，该试剂盒可以适用于检测是否存在耐药性细菌、耐药性病毒、耐药性原生动物、耐药性支原体等的应用。耐药性细菌没有特别限制。例如可列举出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(mrsa)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vrsa)、万古霉素中度耐药金黄色葡萄球菌(visa)、多重耐药性金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌(enterococcus)(vre)、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、多重耐药性铜绿假单胞菌(mdrp)、多重耐药性结核杆菌(tuberclebacillus)(mdr-tb)、广泛耐药性结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)(xdr-tb)、耐青霉素肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)(prsp)、耐碳青霉烯肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、多重耐药性肺炎克雷伯氏菌、多重耐药性不动杆菌(acinetobacter)(mdra)、耐碳青霉烯大肠杆菌(escherichiacoli)、耐头孢菌素大肠杆菌、产ndm-1的多重耐药性细菌、耐碳青霉烯肠杆菌(cre)、耐头孢菌素肠杆菌、产β-内酰胺酶的耐氨苄西林流感嗜血杆菌(hemophilusinfluenzae)(blpar)、不产β-内酰胺酶的耐氨苄西林流感嗜血杆菌(blnar)和产青霉素酶的淋球菌(neisseriagonorrhoeae)(ppng)等。耐药性病毒没有特别限制。例如可列举出耐金刚烷胺流感病毒、耐奥司他韦流感病毒和耐药性人免疫缺陷病毒等。耐药性原生动物没有特别限制。例如可列举出耐氯喹疟疾等。耐药性支原体没有特别限制。例如可列举出耐大环内酯支原体。另外，上述的耐药性细菌、耐药性病毒、耐药性原生动物和耐药性支原体各自的耐药程度没有特别限制。此外，为了能够检测到多重耐药性，只要根据希望检测到的各种耐药性来适当选择即可。在作为本发明试剂盒的应用而列举的对是否存在上述的耐药性细菌、耐药性病毒和耐药性支原体的检测中，优选检测耐药性病毒。在这样的检测中，更优选检测耐药性流感病毒，最优选检测耐奥司他韦流感病毒。病毒等的检测可以基于从活体收集的样品(例如，拭子等的粘膜组织或血液等)中所包含的dna或rna与本发明的肽核酸(3)是否形成互补链来判断。这种互补链的形成可以在参考基于互补链序列中的cg含量而计算的tm值的温度条件下进行。因此，当如上所述地形成互补链后，通过将其用作除上述肽核酸(3)之外的试剂盒的组成部分(例如测试条)，可以进行作为试剂盒的一种使用方式的耐药性细菌、耐药性病毒、耐药性原生动物、耐药性支原体等是否存在的检测。然而，优选不将形成互补链之后的样品快速冷却。在这种是否存在的检测中，当在检测部分中能够观察到标记抗体的信号时，可以判断存在耐药性细菌、耐药性病毒、耐药性原生动物、耐药性支原体等。实施例以下，示出用于更详细地说明本发明的实施例。另外，本发明不限于以下所示的实施例是毋庸置疑的。制备例<制备例1：二苯乙炔化合物>以下的制备例1中，除非另有说明，则直接使用市售化合物而不进行纯化。此外，除非另有说明，则将市售的脱水溶剂用作反应溶剂。除非另有说明，将由关东化学株式会社(kantochemicalco.,inc.)制备的60n(球形，中性)40-50μm用作用于纯化化合物的柱色谱法用硅胶。将由merck制备的硅胶(60f254)用作tlc板。以下装置用于产物的分析。·核磁共振谱：jeolltd.jml-la-400(h1:400mhz；c13:100mhz)jeolltd.jml-la-600(h1:600mhz；c13:150mhz)·质谱：jeolltd.jms-t100lc(esi-tof-hrms)将四甲基硅烷(0.00ppm)、氯仿(7.24ppm)和二甲基亚砜(2.50ppm)作为内标来测定h1-nmr的化学位移。此外，将四甲基硅烷(0.00ppm)、氯仿(77.0ppm)和二甲基亚砜(39.7ppm)作为内标来测定c13-nmr的化学位移。制备例1-1：二苯乙炔化合物1：3-(4-(苯基乙炔基)苯基)丙酸制备由下式表示的二苯乙炔化合物1。详细的制备方法如下所述。[化学式20]化合物[1]3-(4-溴苯基)丙酸甲酯[化学式21]按照上述反应方案制备化合物[1]。有关该方案的详情如下。将40ml的甲醇加入反应容器中，并在ar气氛下冷却至0℃。向容器中滴加3.8ml的乙酰氯(41.9mmol)，将混合物在0℃下搅拌10分钟。接着，将4.0g的3-(4-溴苯基)丙酸(52.4mmol)加入到混合物中，然后将全部物质在室温下搅拌2小时。将反应溶液用碳酸钾中和，然后减压蒸发溶剂。接着，将残余物在乙酸乙酯和水之间分配，并用食盐水洗涤有机层之后，加入硫酸镁以干燥有机层，然后减压蒸发溶剂。由此获得4.35g的作为目标产物的3-(4-溴苯基)丙酸甲酯(产率：100％)。所得化合物[1]用于下一步骤。化合物[1]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.42-7.39(m,2h),7.09-7.06(m,2h),3.66(s,3h),2.90(t,2h),2.61(t,2h)化合物[2]3-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)丙酸甲酯[化学式22]按照上述反应方案制备化合物[2]。有关该方案的详情如下。将1.0g的上述3-(4-溴苯基)丙酸甲酯(4.11mmol)加入反应容器中，并溶解于7ml的dmf中。将156mg的碘化铜(0.82mmol)、1.2ml的三乙胺(8.23mmol)、475mg的四(三苯基膦)钯(0)(pd(pph3)4：0.41mmol)和0.74ml的tmsa(5.35mmol)按所述顺序加入到溶液中，然后在80℃下在ar气氛下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，用硅藻土过滤反应溶液。将比例为10:1的乙酸乙酯和己烷的混合溶剂加入到滤液中，并将混合物用氯化铵水溶液洗涤两次并用食盐水洗涤一次。接着，将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂，由此得到740mg的作为目标产物的3-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)丙酸甲酯。所得化合物[2]用于下一步骤。化合物[3]：3-(4-乙炔基苯基)丙酸甲酯[化学式23]按照上述反应方案制备化合物[3]。有关该方案的详情如下。将740mg的上述3-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)丙酸甲酯、10ml的甲醇和780mg的碳酸钾加入反应容器中，并在室温下搅拌。利用tlc确认到原料消失后，向反应液中加水，并用乙酸乙酯萃取三次。合并有机层并用食盐水洗涤。将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过柱色谱法(己烷:acoet＝5:1(v/v))纯化残余物，由此得到243mg的作为目标产物的3-(4-乙炔基苯基)丙酸甲酯(两步产率：31％)。所得化合物[3]用于下一步骤。化合物[3]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.40(d,2h),7.14(d,2h),3.64(s,3h),3.06(s,1h),2.90(t,2h),2.61(t,2h)化合物[4]：3-(4-(苯基乙炔基)苯基)丙酸甲酯[化学式24]按照上述反应方案制备化合物[4]。有关该方案的详情如下。将243mg的上述3-(4-乙炔基苯基)丙酸甲酯(1.29mmol)加入反应容器中，并溶解于7ml的dmf中。将156mg的碘化铜(0.82mmol)、1.2ml的tea(8.23mmol)、475mg的四(三苯基膦)钯(0)(pd(pph3)4：0.41mmol)和0.74ml的tmsa(5.35mmol)按所述顺序加入到溶液中，然后在80℃下在ar气氛下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，用硅藻土过滤反应溶液。将比例为10:1的乙酸乙酯和己烷的混合溶剂加入到滤液中，并将混合物用氯化铵水溶液洗涤两次并用食盐水洗涤一次。将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，然后减压蒸发溶剂，由此得到308mg的作为目标产物的3-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)丙酸甲酯(产率：90％)。所得化合物[4]用于下一步骤。化合物[4]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.51-7.49(m,2h),7.43(d,2h),7.30-7.26(m,3h),7.12(d,2h),3.60(s,3h),2.89(t,2h),2.56(t,2h)二苯乙炔化合物1：3-(4-(苯基乙炔基)苯基)丙酸[化学式25]按照上述反应方案制备二苯乙炔化合物1。有关该方案的详情如下。将308mg的上述3-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)丙酸甲酯(1.17mol)和5ml的thf加入反应容器中并搅拌。向反应溶液中加入溶解于3ml的纯化水中的98mg的单水氢氧化锂(2.33mmol)，并在室温下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应溶液中加入水，并加入3％的盐酸水溶液以将反应液的ph调整到小于1。将反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用食盐水洗涤。将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，由此得到248mg的作为最终目标产物的3-(4-(苯基乙炔基)苯基)丙酸(二苯乙炔化合物1)(产率：85％)。二苯乙炔化合物1的物性值如下。h1-nmr(400mhz,dmso-d6):7.53-7.50(m,2h),7.55(d,2h),7.35-7.30(m,3h),7.18(d,2h),2.95(t,2h),2.68(t,2h)esihrmsm/z[m+na]+计算值273.0891，实测值273.0889制备例1-2二苯乙炔化合物2：4-(4-(苯基乙炔基)苯基)丁酸制备由下式表示的二苯乙炔化合物2。详细的制备方法如下所述。[化学式26]化合物[5]4-(4-溴苯基)丁酸甲酯[化学式27]按照上述反应方案制备化合物[5]。有关该方案的详情如下。将30ml的甲醇加入反应容器中，并在ar气氛下冷却至0℃。向容器中滴加1.8ml的乙酰氯(24.7mmol)，将混合物在0℃下搅拌10分钟。接着，将2.0g的4-(4-溴苯基)丁酸(8.23mmol)加入到混合物中，然后将全部物质在室温下搅拌2小时。将反应溶液用碳酸钾中和，然后减压蒸发溶剂。接着，将残余物在乙酸乙酯和水之间分配，并用食盐水洗涤有机层之后，加入硫酸镁以干燥有机层，然后减压蒸发溶剂。由此获得2.12g的作为目标产物的4-(4-溴苯基)丁酸甲酯(产率：100％)。所得化合物[5]用于下一步骤。化合物[5]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.41(d,2h),7.05(d,2h),3.67(s,3h),2.60(t,2h),2.32(t,2h),1.93(q,2h)化合物[6]4-(4-(苯基乙炔基)苯基)丁酸甲酯[化学式28]按照上述反应方案制备化合物[6]。有关该方案的详情如下。将1.0g的上述4-(4-溴苯基)丁酸甲酯(3.89mmol)加入反应容器中，并溶解于含有6ml的tmeda和1ml的纯化水的混合溶剂中。将10mg的na2pdcl4(0.04mmol)、14mg的碘化铜(0.07mmol)、28mg的2-(二叔丁基膦基)-n-苯基吲哚(pintb；0.07mmol)和苯乙炔(3.53mmol)按所述顺序加入到溶液中，然后在80℃的ar气氛下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应溶液中加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取三次。合并有机层，将所得物用饱和氯化铵水溶液洗涤两次，并用食盐水洗涤之后，将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。接着，通过柱色谱法(己烷:acoet＝4:1(v/v))纯化残余物，由此得到745mg的作为目标产物的4-(4-(苯基乙炔基)苯基)丁酸甲酯(产率：71％)。所得化合物[6]用于下一步骤。化合物[6]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.51-7.49(m,2h),7.43(d,2h),7.27-7.24(m,3h),7.08(d,2h),3.58(s,3h),2.56(t,2h),2.24(t,2h),1.87(q,2h)二苯乙炔化合物2：4-(4-(苯基乙炔基)苯基)丁酸[化学式29]按照上述反应方案制备二苯乙炔化合物2。有关该方案的详情如下。将745mg的上述4-(4-(苯基乙炔基)苯基)丁酸甲酯(2.68mmol)和13ml的thf加入反应容器中并搅拌。向反应溶液中加入溶解于5ml的纯化水中的225mg的单水氢氧化锂，并在室温下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应溶液中加入水，并加入3％的盐酸水溶液以将反应液的ph调整至小于1。将反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用食盐水洗涤。将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，由此得到700mg的作为最终目标产物的(4-(4-(苯基乙炔基)苯基)丁酸(二苯乙炔化合物2)(产率：99％)。二苯乙炔化合物2的物性值如下。h1-nmr(400mhz,dmso-d6):7.56-7.54(m,2h),7.48(d,2h),7.44-7.41(m,3h),7.26(d,2h),2.63(t,2h),2.23(t,2h),1.81(q,2h)esihrmsm/z[m+na]+计算值287.1043，实测值287.1040制备例1-3二苯乙炔化合物3：5-(4-(苯基乙炔基)苯基)戊酸制备由下式表示的二苯乙炔化合物3。[化学式30]化合物[7]5-(4-碘苯基)戊酸[化学式31]按照上述反应方案制备化合物[7]。有关该方案的详情如下。将1.0g的5-苯基戊酸(5.61mmol)、260mg的h5io6(1.12mmol)、280mg的碘(2.24mmol)、0.2ml的硫酸(10m)、6ml的冰醋酸和1.2ml的纯化水加入反应容器中，并在75℃下在ar气氛下搅拌18小时。将反应溶液冷却至室温后，向反应液中加入纯化水，并将混合物用氯仿萃取三次。合并有机层，并用硫代硫酸钠水溶液洗涤两次并用食盐水洗涤一次。将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。将残余物溶解于微量的氯仿中，并向溶液中加入己烷以进行重结晶。由此得到405mg的作为目标产物的5-(4-碘苯基)戊酸(产率：24％)。所得化合物[7]用于下一步骤。化合物[7]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.59(d,2h),6.93(d,2h),2.59(t,2h),2.38(t,2h),1.65(q,4h).化合物[8]5-(4-碘苯基)戊酸甲酯[化学式32]按照上述反应方案制备化合物[8]。有关该方案的详情如下。将5ml的甲醇加入反应容器中，并在ar气氛下冷却至0℃。向容器中滴加乙酰氯(0.3ml，4.00mmol)，并将混合物在0℃下搅拌10分钟。将405mg的上述5-(4-碘苯基)戊酸(1.33mmol)加入到混合物中，然后将混合物在室温下搅拌2小时。接着，将反应溶液用碳酸钾中和，然后减压蒸发溶剂。残余物在乙酸乙酯和水之间分配，并用食盐水洗涤有机层之后，加入硫酸镁以干燥有机层，并减压蒸发溶剂，由此得到445mg的作为目标产物的5-(4-碘苯基)戊酸甲酯(产率：100％)。所得化合物[8]用于下一步骤。化合物[8]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.55(d,2h),6.89(d,2h),3.63(s,3h),2.54(t,2h),2.30(t,2h),1.62(m,4h)化合物[9]5-(4-(苯基乙炔基)苯基)戊酸甲酯[化学式33]按照上述反应方案制备化合物[9]。有关该方案的详情如下。将445mg的上述5-(4-碘苯基)戊酸甲酯(1.40mmol)加入到反应容器中，并溶解于含有2.5ml的tmeda和0.3ml的纯化水的混合溶剂中。将3.7mg的四氯钯酸钠(na2pdcl4：0.01mmol)、5.0mg的cui(0.2mmol)、10mg的2-(二叔丁基膦基)-n-苯基吲哚(pintb；0.02mmol)和0.14ml的苯乙炔(1.30mmol)按所述顺序加入到溶液中，然后在80℃的ar气氛下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应溶液中加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取三次。合并有机层，将所得物用饱和氯化铵水溶液洗涤两次，并用食盐水洗涤之后，将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。通过柱色谱法(己烷:acoet＝4:1(v/v))纯化残余物，由此得到395mg的作为目标产物的5-(4-(苯基乙炔基)苯基)戊酸甲酯(产率：97％)。所得化合物[9]用于下一步骤。化合物[9]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.51-7.49(m,2h),7.43(d,2h),7.31-7.27(m,3h),7.10(d,2h),3.61(s,3h),2.57(t,2h),2.28(t,2h),1.61(q,4h)二苯乙炔化合物3：5-(4-(苯基乙炔基)苯基)戊酸[化学式34]按照上述反应方案制备二苯乙炔化合物3。有关该方案的详情如下。将395mg的上述5-(4-(苯基乙炔基)苯基)戊酸甲酯(1.35mmol)和7ml的thf加入到反应容器中并搅拌。向反应溶液中加入溶解于3ml的纯化水中的113mg的单水氢氧化锂(2.70mmol)，并在室温下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应溶液中加入水，并加入3％的盐酸水溶液以将反应液的ph调整到小于1。将反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用食盐水洗涤。将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，然后减压蒸发溶剂，由此得到306mg的作为最终目标产物的(5-(4-(苯基乙炔基)苯基)戊酸(二苯乙炔化合物3)(产率：81％)。二苯乙炔化合物3的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.53-7.51(m,2h),7.45(d,2h),7.35-7.32(m,3h),7.15(d,2h),2.64(t,2h),2.38(t,2h),1.69(q,4h)esihrmsm/z[m+na]+计算值301.1199，实测值301.1198制备例1-4二苯乙炔化合物4：2-(4-(苯基乙炔基)苯乙氧基)乙酸制备由下式表示的二苯乙炔化合物4。[化学式35]化合物[10]2-(4-溴苯乙氧基)乙酸乙酯[化学式36]按照上述反应方案制备化合物[10]。有关该方案的详情如下。将220mg的nah(在60％矿物油中；5.47mmol)加入反应容器中，并在冰冷却下悬浮于15ml的thf中。向该悬浮液中逐渐加入1.0g的2-(4-溴苯基)乙-1-醇(4.97mmol)，并将该混合物搅拌30分钟。向该混合物中滴加0.5ml的2-溴乙酸乙酯(4.48mmol)，并将反应液的温度恢复至室温，然后搅拌2小时。此外，将20ml的水加入到反应液中，并将该混合物用乙酸乙酯分配之后，将水层用乙酸乙酯萃取三次。合并有机层并用食盐水洗涤，将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过柱色谱法(己烷:etoac＝10:1(v/v))纯化残余物，由此得到785mg的作为目标产物的2-(4-溴苯乙氧基)乙酸乙酯(产率：55％)。所得化合物[10]用于下一步骤。化合物[10]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.35(d,2h),7.09(d,2h),4.15(t,2h),4.02(s,2h),3.69(t,2h),2.84(t,2h),1.22(t,3h)化合物[11]2-(4-(苯基乙炔基)苯乙氧基)乙酸乙酯[化学式37]按照上述反应方案制备化合物[11]。有关该方案的详情如下。将785mg的上述2-(4-溴苯乙氧基)乙酸乙酯(2.73mmol)加入反应容器中，并将其溶解于含有5ml的tmeda和0.5ml的纯化水的混合溶剂中。将7.3mg的四氯钯酸钠(na2pdcl4：0.02mmol)、9.5mg的cui(0.05mmol)、20mg的2-(二叔丁基膦基)-n-苯基吲哚(pintb：0.05mmol)和0.27ml的苯乙炔(2.49mmol)按所述顺序加入到溶液中，然后在80℃的ar气氛下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应溶液中加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取三次。接着，合并有机层，并将所得物用饱和氯化铵水溶液洗涤两次，并用食盐水洗涤之后，将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。通过柱色谱法(己烷:acoet＝4:1(v/v))纯化残余物，由此得到676mg的作为目标产物的2-(4-(苯基乙炔基)苯乙氧基)乙酸乙酯)(产率：80％)。所得化合物[11]用于下一步骤。化合物[11]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.52-7.45(m,4h),7.30-7.18(m,5h),4.15(q,2h),4.02(s,2h),3.69(t,2h),2.84(t,2h),1.22(t,3h)二苯乙炔化合物4：2-(4-(苯基乙炔基)苯乙氧基)乙酸[化学式38]按照上述反应方案制备二苯乙炔化合物4。有关该方案的详情如下。将676mg的上述2-(4-(苯基乙炔基)苯乙氧基)乙酸乙酯(2.19mmol)和8ml的thf加入反应容器中并搅拌。将溶解于4ml的纯化水中的185mg的单水氢氧化锂(4.38mmol)加入到反应溶液中，并在室温下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应容器中加入水，并向反应容器中加入3％的盐酸水溶液以将反应液的ph调整到小于1。将反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用食盐水洗涤。将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，由此得到583mg的作为最终目标产物的(2-(4-(苯基乙炔基)苯乙氧基)乙酸(二苯乙炔化合物4)(产率：95％)。二苯乙炔化合物4的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.53-7.50(m,2h),7.46(d,2h),7.35-7.31(m,3h),7.21(d,2h),4.12(s,2h),3.77(t,2h),2.95(t,2h)esihrmsm/z[m+na]+计算值289.0835，实测值289.0827制备例1-5二苯乙炔化合物5：2-(4-(萘-2-基乙炔基)苯乙氧基)乙酸制备由下式表示的二苯乙炔化合物5。[化学式39]化合物[12]2-(4-(萘-2-基乙炔基)苯乙氧基)乙酸乙酯[化学式40]按照上述反应方案制备化合物[12]。有关该方案的详情如下。将110mg的上述2-(4-溴苯乙氧基)乙酸乙酯(0.38mmol)加入反应容器中，并将其溶解于含有1ml的tmeda和0.1ml的纯化水的混合溶剂中。将1.1mg的四氯钯酸钠(na2pdcl4：3.48μmol)、1.5mg的cui(7.88μmol)、3.0mg的2-(二叔丁基膦基)-n-苯基吲哚(pintb：6.97μmol)和53mg的2-乙炔基萘(0.35mmol)按所述顺序加入到溶液中，然后在80℃的ar气氛下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应溶液中加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取三次。接着，合并有机层，并将所得物用饱和氯化铵水溶液洗涤两次，并用食盐水洗涤之后，将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。通过柱色谱(己烷:acoet＝8:1(v/v))纯化残余物，由此得到72mg的作为目标产物的(2-(4-(萘-2-基乙炔基)苯乙氧基)乙酸乙酯(产率：58％)。所得化合物[12]用于下一步骤。化合物[12]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):8.05(s,1h),7.83-7.80(m,3h),7.59-7.49(m,5h),7.24(d,2h),4.23(q,2h),4.12(s,2h),3.83(t,2h),2.99(t,2h),1.22(t,3h)二苯乙炔化合物5：2-(4-(萘-2-基乙炔基)苯乙氧基)乙酸[化学式41]按照上述反应方案制备二苯乙炔化合物5。有关该方案的详情如下。将72mg的2-(4-(萘-2-基乙炔基)苯乙氧基)乙酸乙酯(0.20mmol)和1.5ml的thf加入反应容器中并搅拌。将溶解于0.5ml的纯化水中的单水氢氧化锂(0.40mmol)加入到反应溶液中，并在室温下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应容器中加入水，向反应容器中加入3％的盐酸水溶液以将反应液的ph调整到小于1。将反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用食盐水洗涤。将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，然后减压蒸发溶剂，由此得到62mg的作为最终目标产物的(2-(4-(萘-2-基乙炔基)苯乙氧基)乙酸(二苯乙炔化合物5)(产率：93％)。二苯乙炔化合物5的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):8.05(s,1h),7.83-7.80(m,3h),7.59-7.49(m,5h),7.24(d,2h),4.12(s,2h),3.83(t,2h),2.99(t,2h)esihrmsm/z[m+na]+计算值353.1148，实测值353.1143制备例1-6二苯乙炔化合物6：2-(4-((4-氰基苯基)乙炔基)苯乙氧基)乙酸制备由下式表示的二苯乙炔化合物6。[化学式42]化合物[13]2-(4-((4-氰基苯基)乙炔基)苯乙氧基)乙酸乙酯[化学式43]按照前述反应方案制备化合物[13]。有关该方案的详情如下。将112mg的上述2-(4-溴苯乙氧基)乙酸乙酯(390μmol)加入反应容器中，并将其溶解于含有1ml的tmeda和0.1ml的纯化水的混合溶剂中。将1.1mg的四氯钯酸钠(na2pdcl4：3.48μmol)、1.5mg的cui(7.88μmol)、3.1mg的2-(二叔丁基膦基)-n-苯基吲哚(pintb：7.88μmol)和140mg的4-乙炔基苯甲腈(172μmol)按所述顺序加入到溶液中，然后在80℃的ar气氛下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应溶液中加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取三次。合并有机层，将所得物用饱和氯化铵水溶液洗涤两次，并用食盐水洗涤之后，将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。通过柱色谱法(己烷:acoet＝8:1(v/v))纯化残余物，由此得到37mg的作为目标产物的2-(4-((4-氰基苯基)乙炔基)苯乙氧基)乙酸乙酯(收率29％)。所得化合物[13]用于下一步骤。化合物[13]的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.64-7.58(m,4h),7.47(d,2h),7.27(d,2h),4.21(q,2h),4.07(s,2h),3.78(t,2h),2.98(t,2h),1.28(t,3h)二苯乙炔化合物6：2-(4-((4-氰基苯基)乙炔基)苯乙氧基)乙酸[化学式44]按照上述反应方案制备二苯乙炔化合物6。有关该方案的详情如下。将35mg的2-(4-((4-氰基苯基)乙炔基)苯乙氧基)乙酸乙酯(105μmol)和1.8ml的thf加入反应容器中并搅拌。将溶解于0.5ml的纯化水中的但水氢氧化锂(214μmol)加入到反应溶液中，并在室温下搅拌该混合物。利用tlc确认到原料消失后，向反应容器中加入水，向反应容器中加入3％的盐酸水溶液以将反应液的ph调整到小于1。将反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用食盐水洗涤。将洗涤后的产物用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，由此得到得18mg的作为最终目标产物的2-(4-((4-氰基苯基)乙炔基)苯乙氧基)乙酸(二苯乙炔化合物6)(产率：56％)。二苯乙炔化合物6的物性值如下。h1-nmr(400mhz,cdcl3):7.65-7.60(m,4h),7.49(d,2h),7.24(d,2h),4.11(s,2h),3.82(t,2h),2.98(t,2h)<制备例2：肽核酸>合成n-末端用二苯乙炔化合物(二苯乙炔化合物1-6)修饰的肽核酸。具体而言，通过固相合成而将在上述制备例1中制得的二苯乙炔化合物1-6引入至通过fmoc固相合成法而合成的pna低聚物[k...(atctcctccctt：seqidno:1)]的n-末端，从而合成具有表1所示序列的肽核酸1-6。另外，在fmoc固相合成法中使用novasyn(商标)tgr树脂(0.24mmole/g)，用80％的tfa/间甲酚溶液从树脂中切出合成的各pna低聚物。使用hplc(inertsilods-3：4.6×150mm，含0.1％tfa的乙腈/水，乙腈在80分钟内从10％至50％)纯化目标产物，并且使用maldi-tof-ms装置(ultraflextreme，brukerdaltonics)对目标产物的质量进行定量。[表1]表1所示的每个pna的碱基序列(seqidno:1)使其从左侧的c-末端开始，以右侧的n-末端结束。另外，表1所示的符号“k”表示赖氨酸残基，意味着其n-末端和具有腺嘌呤(a)的肽核酸的c-末端进行肽键合(在表中用符号“...”表示)。此外，表中的符号“-”表示二苯乙炔化合物1-6中的羧基和肽核酸n-末端处的胸腺嘧啶(t)进行肽键合。(1)合成树脂-k延伸树脂(0.24mmol/g)的三分之一(0.08mmol)。1)偶联过程在6ml的一次性注射器中称量400mg的树脂。将3ml的dmf加入注射器中，通过搅拌混合物15分钟使树脂溶胀，然后去除dmf。接着，将fmoc-lys(生物素)-oh(15.6mg:0.03mmol)、fmoc-lys(cbz)-oh(25.4mg:0.06mmol)、hbtu(40.5mg:0.30mmol)和hobt(113.8mg:0.30mmol)溶解于1.2ml的偶联溶液(nmm/吡啶(1/44；v/v)/dmf(3/2；v/v))中之后，将该溶液加入到树脂中，并将混合物搅拌40分钟。之后，去除反应溶液，并将树脂用dmf洗涤5次。2)带帽过程将2ml的带帽溶液(乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/dmf(5/6/89；v/v/v))加入到树脂中，并将混合物搅拌10分钟之后，去除溶液，并将树脂用dmf洗涤10次。3)脱保护过程将2ml的脱保护溶液(哌啶/dmf(4/6；v/v))加入到树脂中，并将混合物搅拌5分钟之后，将脱保护溶液收集在eppendorf管中，并将树脂用dmf洗涤10次。将脱保护溶液稀释至40倍，通过测定在300nm处的吸光度确认延伸反应。(2)合成树脂-k...atctcctccctt1)偶联过程将具有待延伸的各个碱基的单体(0.10mmol)、hbtu(40.5mg：0.30mmol)和hobt(113.8mg：0.30mmol)溶解于1.2ml的偶联溶液中。之后，将该溶液加入到树脂中并将混合物搅拌30分钟。之后，去除反应溶液，并将树脂用dmf洗涤5次。2)加帽过程将2ml的加帽溶液加入到树脂中，并将该混合物搅拌10分钟。之后，去除反应溶液，并将树脂用dmf洗涤10次。3)脱保护过程将2ml的脱保护溶液加入到树脂中，并将混合物搅拌5分钟。之后，去除反应溶液，并将树脂用dmf洗涤10次。以与上述相同的方式确认每个延伸反应。(3)树脂-k...atctcctccctt之后的合成首先，将400mg的目前合成的树脂以各自约50mg的分量分配到6ml的一次性注射器中。1)偶联过程将要修饰pna的n-末端的化合物(12.5μmol)、hbtu(5.1mg：37.5μmol)和hobt(14.2mg：37.5μmol)溶解于200μl的偶联溶液中。之后，将该溶液加入到树脂中并将混合物搅拌30分钟。之后，去除反应溶液，并将树脂用dmf洗涤5次。2)加帽过程将1ml的加帽溶液加入到树脂中，并将该混合物搅拌10分钟。之后，去除反应溶液，并将树脂用dmf洗涤10次。(4)从树脂上切下将完成延伸反应后的树脂用ch2cl2洗涤10次，然后用meoh洗涤5次，然后真空干燥。加入树脂去除溶液(tfa/间甲酚(4/1；v/v))直至树脂浸入其中，并将该溶液搅拌1小时。将2ml的et2o加入15ml的falcon管中，并从管上方加入树脂去除溶液以沉淀产物。树脂用et2o洗涤并回收产物。之后，在-80℃下冷却10分钟以使产物析出，并且以4,400rpm进行离心分离4分钟以沉淀产物，接着除去et2o。再执行所述操作两次，然后将产物在真空中干燥。(5)纯化使用hplc(inertsilods-3；4.6×150mm，含0.1％tfa的乙腈/水，乙腈在80分钟内从10％至50％)进行纯化从而得到各目标产物。使用maldi-tof-ms装置(ultraflextreme，brukerdaltonics)鉴定目标产物后，使用hplc(inertsilods-3；1.5×150mm，含0.1％tfa的乙腈/水，乙腈在30分钟内从0％至50％，uv265nm)检测核碱基的吸光度来鉴定其纯度。实验例1二苯乙炔衍生物修饰的pna对互补dna和非互补dna中的每一种的缔合行为的分析通过熔解温度测定定量地评估制备例2中制备的肽核酸1-6对每种dna(即，互补dna和互补dna中的每一种)的缔合行为(双链的热力学稳定性)。测定各肽核酸1-6和各dna(互补dna和非互补dna中的每一种)的双链的tm值将具有互补序列的dna或具有非互补序列的dna(参见表2)与各肽核酸1-6之间的“dna:肽核酸”比例调整为1:1。此时各核酸的分子浓度设定为4μmol/l(20mm磷酸缓冲溶液；ph:7.4)。使用包含8个连续的室的紫外-可见吸收光谱测量装置，通过以每分钟0.5℃的增量在5℃-95℃的范围内改变温度来测量所得双链在260nm处吸光度随温度的变化，以获得熔解曲线。通过使用中线法从所得熔解曲线计算双链的tm值。[表2]表2所示的每个dna的碱基序列，使其从左侧的5’-末端开始，以右侧的3’-末端结束。此外，表2所示的各pna的碱基序列的记载，使其从左侧的c-末端开始，以右侧的n-末端结束。表2的符号“|”表示dna序列和pna序列彼此互补。表中的符号“:”表示当dna序列中的碱基由“a”表示时，该序列和各pna序列彼此互补，并且表示当dna序列中的碱基由“c”表示时，该序列和各pna序列彼此不互补。tm值按如上所述至少测量三次，并测定tm值的平均值±标准偏差。各肽核酸1-6和每种dna(互补dna和非互补dna中的每一种)的双链的tm值[℃]以及互补双链的tm值与非互补双链的tm值之间的差值(δtm值[℃])的计算结果示于表3中。[表3]从图3所示的结果可以看出，肽核酸1至肽核酸5按δtm值逐渐增加的顺序排列。更详细地，揭示了对于非互补序列，各pna的tm值约为49℃-50℃，但在基于互补序列的tm值的情况下，二苯乙炔修饰的各种pna显示出的值比仅使用pna时的显示出的值大，其结果，肽核酸5最大程度地提高了互补双链的稳定性和序列选择性。此外，从肽核酸4与肽核酸6的比较可知，通过在位于肽核酸二苯乙炔化合物4的末端的苯环的对位设置氰基而得到的肽核酸6显示出较高的δtm值。因此，实验例2：基于错配的碱基对及其位置评估缔合特征在实施例2中，通过将在实验例1中观察到互补双链的稳定性和序列选择性有最大改进的肽核酸5用作肽核酸，来对错配碱基及其位置彼此不同的dna序列(见表4)的辨别力(缔合特征)进行评估。[表4]表4中的各dna和pna的碱基序列的记载，使其从左侧的c-末端开始，以右侧的n-末端结束。另外，表中的b代表胞嘧啶(c)、甘氨酸(g)或胸腺嘧啶(t)。表中的h代表丙氨酸(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)。如表4所示，将形成双链的在其3’-末端具有错配(b)的dna序列定义为dnamm-1，将从3’-末端开始的第二个碱基处具有错配(b)的dna序列定义为dnamm-2，并且将从3’-末端开始的第三个碱基处具有错配(h)的dna序列定义为dnamm-3。按照实验例1的方法使用这些序列进行tm值测定。具体而言，通过tm值测定定量地评估肽核酸5对表4所示的各种dna序列的缔合特性。首先，制备肽核酸5与dna以1:1的浓度比混合而成的样品，并测量其在5℃-95℃范围内在260nm处的吸光度变化，得到熔解曲线。通过使用中线法从所得熔解曲线计算样品的tm值。tm值至少测量三次，测定所得tm值的平均值和标准偏差。此外，计算δtm值[℃]，其为互补双链的tm值与各非互补双链(mm-1、mm-2和mm-3)的tm值之间的差值。使用上述肽核酸(对照)作为对照(ctrl)。这些结果示于表5中。[表5]如表5所示，通过使用肽核酸5而展现出的对非互补dna序列的非特异性稳定化效果为+0.3℃至+2.6℃。在使用任何其它芳族化合物(例如芘或偶氮苯)修饰的情况下，对非互补序列的非特异性稳定化效果为+4℃至+6℃，因此揭示了肽核酸5对错配序列表现出相对较小的非特异性稳定化效果，尽管该效果的程度根据错配的碱基对和错配存在的位置而变化。此外，从图1可以看出，肽核酸5的使用提供了以下结果：大大改善了在所有序列(包括甚至不能用未经任何二苯乙炔化合物修饰的肽核酸(对照)区分的序列)中的序列选择性(5℃-8℃)。从前文可以看出，通过使用本发明的肽核酸(尤其是肽核酸5)而表现出的序列选择性改善效果在不依赖于目的dna序列的情况下显示出来。实验例3使用pna的耐奥司他韦型基因组检测试剂盒的装配及其确认如上所述，发现经二苯乙炔化合物修饰的肽核酸能够很好地检测单核苷酸多态性(单碱基错配)，因此研究了肽核酸是否适用于耐奥司他韦型流感病毒的检测试剂盒。(1)使用dna和pna的tm值测量首先，制备具有序列“c-末端>gagtattatttt>n-末端”(seqidno:8)的pna(对照pna-1)，该序列作为与“5’-末端>ctcataataaaa>3’-末端”(seqidno:7)互补的碱基序列，“5-末端>ctcataataaaa>3-末端”(seqidno:7)则作为耐奥司他韦型流感病毒的特征性dna(最初，流感病毒将rna作为遗传物质，但进行使用dna的实验作为初步实验)碱基序列的一部分。使用的pna和dna示于表6中。此外，制备具有与前述相同的碱基序列的pna(pna5-1)，使用二苯乙炔化合物5通过肽键对pna进行修饰。更详细地说，使具有存在于上述的对照pna-1的n-末端的t的肽核酸残基的酰胺基和二苯乙炔化合物的羧基进行肽键合(位置的描述用表6的符号“-”表示)。pna5-1的制备方法与例如上述pna1～5的制备方法相同。以与pna5-1相同的方式制备具有与上述dna序列互补的碱基序列的pna(pna6-1)，通过使用二苯乙炔化合物6代替二苯乙炔化合物5以与上述相同的方式经由肽键对所述pna(pna6-1)进行修饰；以及具有与上述dna序列互补的碱基序列的pna(pnaacr)，通过使用具有羧基的吖啶化合物(n-(2-羧甲基)-9-吖啶胺；由sigma-aldrich生产；l135763)以与上述相同的方式通过肽键对所述pna(pnaacr)进行修饰。由kook形成的赖氨酸残基和间隔基设置在具有上述的各pna的(g)的肽核酸残基的c-末端。更详细地说，使上述的c-末端的羧基和赖氨酸残基主链的酰胺基进行肽键合(位置的描述用表中的符号“...”表示)。此外，由下式表示的基团与上述的赖氨酸残基主链的羧基进行酰胺键合(式中的波浪线部分与上述的赖氨酸残基进行肽键合)。因此，上述表6中所示的各pna的c-末端为由下式表示的基团中所示的赖氨酸残基。[化学式45][表6]表6所示的各dna的碱基序列，使其从左侧的5’-末端开始，以右侧的3’-末端结束。此外，各pna的碱基序列的记载，使其从左侧的c-末端开始，以右侧的n-末端结束。另外，各pna的c-末端的羧基被酰胺化。表中的符号“|”表示dna序列和pna序列彼此互补。表中的符号“:”表示dna序列和pna序列彼此不互补。用质谱仪(由brukerdaltonics制造的ulttaflexiii)获得结果示于下表7中，所述结果用于证实如上所述制备的各种pna的存在。[表7]计算值实测值对照pna-14062.354063.275pna5-14374.4540374.435pna6-14349.684351.774pnaacr4311.6684311.792为了调查上述的表6所示的各种pna与具有耐奥司他韦流感病毒的特征性碱基序列(seqidno:7)的dna和具有耐奥司他韦流感病毒的特征性碱基序列(seqidno:9)的dna之间的缔合特征，通过与实验例1中记载的方法相同的方法计算出tm值。此外，计算使用seqidno:7时得到的tm值与使用seqidno:9时得到的tm值之间的差值作为δtm值，用于评估单碱基错配的区别程度。结果示于表8中。[表8]从表8所示的结果可以明显看出，使用pna5-1能够最有效地区分单碱基错配，因为其δtm值高达11.7。(2)使用rna和pna的tm值测量如上所述，流感病毒具有rna作为遗传物质，因此通过使用具有由5’-末端>cucauaauaaaa>3’-末端(seqidno:10)形成的序列的rna代替具有上述的耐奥司他韦流感病毒的特征性碱基序列的dna(seqidno:7)，并使用具有由5’-末端>cucauaaugaaa>3’-末端(seqidno:11)形成的序列的rna代替具有耐奥司他韦流感病毒的特征性碱基序列(seqidno:9)的dna，以与上述的(1)中相同的方式计算tm值和δtm值。结果示于表9中。[表9]从表9所示的结果可以看出，即使使用rna代替dna时，使用pna5-1时的优越性仍然是令人满意的，并且当使用rna时它的程度更加显著。因此，制备使用这种pna的试剂盒，并测试该试剂盒是否可以检测到流感耐药性细菌。(3)耐奥司他韦流感判定试剂盒将在以下的实验中使用的试剂盒和涉及使用该试剂盒的实验的示意图示于图2中。·用于捕获抗体的稀释液的制备将源自山羊的抗生物素抗体(由bethyllaboratories,inc.制备：a150-111a)和源自小鼠的抗流感a单克隆抗体(由abcamplc制备：ab66191)各自用含有5％蔗糖的无菌水稀释至0.5mg/ml的终浓度。·在色谱介质上的判定部分的制备使用涂布器(由nippnengineeringco.,ltd.制备)，将在上述(1)中制备的200μl的抗体以1mm的宽度涂布于30cm×2.5cm的硝化纤维素膜(由merckmillipore制备：hf180mc100)上，并在55℃下干燥5分钟之后，将所得物用含有0.5％酪蛋白的5mm的磷酸盐缓冲液(ph:7.4)浸润5分钟。接着，将经浸润的产品用含有0.01％sds的5mm的磷酸盐缓冲液(ph:7.4)浸润15分钟。之后，将经浸润的产品涂布于在色谱介质上的判定部分，并将所得物在室温下干燥过夜。·胶体金标记抗体溶液的制备将0.7ml的硼酸盐缓冲液(2mm；ph9.2)加入到0.1ml的胶体金悬浮液(由wineredchemicalcorporation制备：wrgh-2，平均粒径：40nm)中以稀释悬浮液。用2mm的硼酸盐缓冲液(ph9.0)将源自小鼠的抗流感a单克隆抗体(由abcamplc制备：ab110661)稀释至0.1mg/ml。将150μl的抗体溶液加入到1ml的胶体金悬浮液中，并将混合物在37℃下静置10分钟。接着，将0.15ml的含有10％bsa的2mm的硼酸盐缓冲液(ph:9.0)加入到混合物中，并将全部混合物在室温下静置10分钟。之后，对所得物施加超声波30秒，并将所得物以8.000×g离心分离20分钟。去除上清液后，将1ml的含有1.0％bsa和5％海藻糖的2mm的磷酸盐缓冲液(ph:7.4)加入到残余物中。·基于免疫色谱法的检测试剂盒的制备将40μl的在上述制备的胶体金标记抗体溶液加入到5mm×15mm的玻璃纤维垫(由merckmillipore制备)中之后，将所得物在真空干燥器中干燥过夜以制备结合垫。接着，将上述制备的色谱介质、待添加样品的样品垫(由merckmillipore制备：cfsp203000)和吸收样品的吸收垫(由merckmillipore制备)贴至由包装片材形成的基底上，并且将所得物切割成具有5mm的宽度。此外，将上述制备的结合垫贴至切割的产品上。由此制备免疫色谱测定试剂盒。·显影液的制备使用包含表面活性剂(np40)、bsa、fbs和磷酸盐类缓冲剂的溶液(ph:7.4)作为显影液。·样品制备和测量将具有与上述的奥司他韦敏感的流感病毒的rna互补的序列的上述的pna5-1用超纯水稀释至0.1μg/μl的浓度。将5μl的由此制备的pna溶液分别与10μl的1.0×106pfu/ml的耐奥司他韦型流感病毒溶液(flu/a/yokohma/77/h1n1)和10μl的奥司他韦敏感型的流感病毒溶液(flu/a/yokohma/10/h1n1)在105μl的显影液的存在下在55℃下静置5分钟。之后，在室温下，将总量、即120μl的所得rna溶液显影到在上述制备的免疫色谱测定试剂盒的样品垫上，而不进行快速冷却。10分钟后，视觉判断测试线。使用上述的对照pna-1代替pna5-1的实验也以相同的方式进行。结果示于图3中。从图3(a)所示的结果可以看出，当使用pna5-1时，能够在测试线上目测观察到显示pna5-1对耐奥司他韦流感病毒呈阳性的条带。同时，当使用对照pna-1时，获得以下结果：条带出现在测试线和对照线两者上。因此，揭示了对照pna-1不能用作用于耐奥司他韦性流感病毒的判定试剂盒。序列表自由文本seqidno:1表示肽核酸(pna低聚物)(对照)(ctrl)的碱基序列。另外，由seqidno:1～6表示的各种肽核酸在碱基序列的5’-末端(肽核酸的c-末端)各自具有赖氨酸残基。seqidno:2表示碱基序列，该碱基序列与由上述seqidno:1所示的碱基序列形成的肽核酸形成互补链，seqidno:3～6各自代表碱基序列，该碱基序列与由上述seqidno:1表示的碱基序列形成的肽核酸的碱基序列错配。由seqidno:7表示的碱基序列是通过用耐奥司他韦流感病毒的特征性碱基序列取代dna的碱基序列而得到的。seqidno:8表示与由seqidno:7表示的碱基序列具有同源性的pna的碱基序列。由seqidno:9表示的碱基序列是通过用奥司他韦敏感型的流感病毒的特征性碱基序列取代dna的碱基序列而得到的。由seqidno:10表示的氨基酸序列为耐奥司他韦流感病毒的特征性rna的碱基序列。由seqidno:11表示的碱基序列为奥司他韦敏感型的流感病毒的特征性rna的碱基序列。序列表<110>国立大学法人大阪大学<120>二苯乙炔化合物<130>p16-115wo<150>丂jp2015-184545<151>丂2015-09-17<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>12<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pna低聚物(对照)<400>1atctcctccctt12<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>互补dna<400>2atgtcctagaggagggaataa21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>非互补dna<400>3atgtcctagaggagggcataa21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>非互补dna<400>4atgtcctagaggagggabtaa21<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>非互补dna<400>5atgtcctagaggagggbataa21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>非互补dna<400>6atgtcctagaggagghaataa21<210>7<211>12<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>耐奥司他韦流感病毒的部分序列<400>7ctcataataaaa12<210>8<211>12<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>用于耐奥司他韦流感病毒的检测的pna<400>8gagtattatttt12<210>9<211>12<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>奥司他韦敏感的流感病毒的部分序列<400>7ctcataatcaaa12<210>10<211>12<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>耐奥司他韦流感病毒的部分序列<400>7cucauaauaaaa12<210>11<211>12<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>奥司他韦敏感的流感病毒的部分序列<400>11cucauaaucaaa12当前第1页12