通过遗传编程的多谱系造血前体细胞产生的制作方法

发明背景1.发明领域本发明一般涉及分子生物学、干细胞和分化细胞领域。更具体地，涉及将多能干细胞(psc)编程为特定细胞谱系，特别是造血细胞和造血细胞前体。2.相关技术的描述造血干细胞(hsc)是唯一具有自我生命更新、分化成所有血细胞类型和在移植后重建整个造血系统的能力的细胞。这些细胞以及它们的终末分化的衍生细胞类型如红细胞、血小板、粒细胞和淋巴样细胞在治疗各种血液疾病和最近治疗癌症方面具有完善的治疗应用。然而，来自hla匹配的活体供体的hsc的有限的可用性对其在诊所广泛使用提出了很大限制。因此，已经做出相当大的努力来从替代细胞类型衍生hsc。从替代细胞类型衍生hsc的一种方法是将非hsc体细胞类型转分化为hsc。已经使用各种转基因组合将小鼠成纤维细胞转分化为非可植入的造血祖细胞(pereira等，2013；batta等，2014)。然而，由于起始原代细胞的数量以及低转分化效率，这种方法受到限制。因此，缺乏提供具有长期植入潜能的造血前体细胞的无限供应的方法。人胚胎干细胞(esc)和诱导的多能干细胞(ipsc)能够在体外无限增殖，同时保留分化成所有体细胞类型的潜能。因此，人esc和ipsc可潜在地为体外和体内应用提供无限量的患者特异性hsc和功能性血细胞供应。人psc向造血谱系细胞的体外分化概括了正常的体内发育，包括中胚层诱导的阶段和多能造血前体的特化。因此，已经开发出许多方法来通过正向编程将人psc分化为造血谱系。然而，目前还没有任何方法可以从psc强有力地生成能够实现高效的髓样和淋巴样分化以及长期植入的hsc，这主要是由于造血个体发育的复杂性质。在一种方法中，过表达转基因如hoxb4和lhx2用于小鼠psc的造血分化已显示产生可植入的hsc样细胞(kyba等，2002；kitajima等，2011)。然而，这些转基因未能从人psc产生hsc。在另一种方法中，doulatov等人报道在人psc中erg、hoxa9、rora、sox4和myb转基因的组合能够产生能够进行髓样和红细胞分化的造血祖细胞(doulatov等，2013)。然而，该方法仅产生能够依赖于持续转基因表达的短期植入的细胞。因此，虽然遗传编程被证明是一种非常有前景的方法，但缺乏允许从人psc在体外强有力地生成能够实现淋巴样和髓样潜能以及长期植入的造血前体细胞的方法。发明概述本公开内容的实施方案提供了将人多能干细胞有效编程为多谱系造血祖细胞的方法。在第一个实施方案中，提供了用于从多能干细胞产生造血前体细胞(hpc)的体外方法，其包括提供包含至少一种编码造血前体编程基因的表达构建体的多能干细胞(psc)，其中造血前体编程基因包括ets/erg基因、gata2和hoxa9，并且在表达造血前体编程基因的条件下培养多能干细胞，由此产生造血前体细胞。在某些方面，hpc能够分化成髓样和淋巴样谱系。在一些方面，多能干细胞是胚胎干细胞(esc)或诱导的多能干细胞(ipsc)。在某些方面，多能干细胞是人的多能干细胞。在某些方面，表达构建体是基于转座子或游离体的表达构建体。在一些方面，造血前体编程基因处于单个启动子的控制下。在特定方面，单个启动子是诱导型启动子。在具体方面，诱导型启动子是四环素诱导型启动子。在进一步的方面中，用于产生造血前体细胞的方法还包括在使得造血前体编程基因不被表达的条件下培养hpc。在某些方面，hpc在没有基质细胞的情况下培养。在一些方面，hpc在无血清或确定的培养基中培养。在某些方面，可将hpc分化成选自以下的两种或更多种细胞类型：浆细胞，天然杀伤细胞，巨噬细胞，肥大细胞，巨核细胞，红细胞，粒细胞，淋巴细胞，单核细胞，白细胞和血小板。在某些方面，淋巴细胞是b淋巴细胞和/或t淋巴细胞。在一些方面，在使得造血前体编程基因表达的条件下培养多能干细胞约四天至约十天。在某些方面，hpc表达一种或多种造血前体标记。在一些方面，造血前体标记选自cd43，cd33，cd34，cd45，cd235a和cd41a。在特定方面，一种或多种造血前体标记选自cd43，cd45和cd34。在一些方面，hpc是未成熟的hpc。在某些方面，未成熟的hpc表达cd34和cd43。在一些方面，至少50％的hpc是未成熟的hpc，例如至少55,60,65,70,75,80,90,95,96,97,98或99％的hpc。在进一步的方面，至少70％的hpc是未成熟的hpc。在进一步的方面，至少90％的hpc是未成熟的hpc。在某些方面，ets/erg基因是erg(v-ets成红细胞增多症病毒e26癌基因同源物)，etv2(ets变体2)，fli-1(friend白血病病毒整合1)，elk3(含ets结构域的蛋白)，ets1(c-ets-1)或ets2(c-ets-2)。在特定方面，ets/erg基因是erg或etv2。在一些方面，造血前体编程基因包括erg、gata2和hoxa9。在其它方面，造血前体编程基因包括etv2、gata2和hoxa9。在某些方面，造血前体编程基因与靶向序列融合。例如，靶向序列是nup98或其同源域。在某些方面，造血前体编程基因包括erg，gata2，hoxa9，nup98-hoxa9和nup98-hoxa10。在其他方面，造血前体编程基因包括etv2，gata2，hoxa9，nup98-hoxa9和nup98-hoxa10。在进一步的方面，包含至少一种编码造血前体编程基因的表达构建体的psc还包含至少一种编码一种或多种造血干细胞编程基因的额外表达构建体。在进一步的方面，用于从多能干细胞产生造血前体细胞的体外方法进一步包括在表达一种或多种造血干细胞编程基因的条件下培养hpc，由此产生能够长期植入哺乳动物的造血干细胞(hsc)。在某些方面，哺乳动物是人。在一些方面，所述一种或多种造血干细胞编程基因选自bcl2,bend4,bmi1,ciita,egr3,etv6,ezh1,ezh2,foxl1,hif3a,hlf,hmga2,hoxa9,hoxa10,hoxa3,hoxa4,hoxa5,hoxa6,hoxa7,hoxb3,hoxb6,hsf5,klf2,klf4,mecom,meis1,mir29a,mir29b1,msi2,myb,mycn,nkx2-3,nr4a2,peg3,prdm12,prdm16,rbak,runx1,runx3,setbp1,sox17,sox8,tfec,zbtb14,zbtb20,zmat1,znf131,znf134,znf136,znf256,znf26,znf300,znf337,znf350,znf414,znf662,znf667和znf682。在某些方面，所述一种或多种造血干细胞编程基因选自hmga2，mycn，nr4a2，sox17，tfec，meis1，hoxa4，znf414，klf4，znf131，bcl2，etv6，znf350，rbak，hoxa6，hoxb6，hoxa7，znf300，znf682和msi2。在具体的方面，一种或多种造血干细胞编程基因选自hmga2，mycn，nr4a2，sox17，tfec，meis1，hoxa4，znf414，klf4，znf131，bcl2，etv6，znf350和rbak。在一些方面，一种或多种造血干细胞编程基因的表达在hpc中是组成型的。在某些方面，一种或多种造血干细胞编程基因的表达在多能干细胞中基本上被沉默。在某些方面，造血干细胞编程基因与靶向序列融合。在特定方面，靶向序列是nup98或其同源域。在另一个实施方案中，提供了用于从多能干细胞产生造血前体细胞的体外方法，其包括提供包含编码在单个启动子的控制下的erg、gata2和hoxa9的表达构建体的多能干细胞(psc)并且在表达erg、gata2和hoxa9的条件下培养多能干细胞，从而产生造血前体细胞(hpc)。在又一个实施方案中，提供了用于从多能干细胞产生造血干细胞(hsc)的体外方法，所述方法包括提供包含编码在单个启动子的控制下的erg、gata2和hoxa9的表达构建体以及编码一种或多种造血干细胞编程基因的至少第二表达构建体的多能干细胞(psc)，在表达erg、gata2，hoxa9和一种或多种造血干细胞编程基因的条件下培养多能干细胞，从而产生能够长期植入哺乳动物的hsc。在进一步的实施方案中，提供了编码造血前体编程基因的表达构建体，其中编程基因包括ets/erg基因、gata2和hoxa9。在一些方面，构建体是基于转座子或游离体的表达构建体。在某些方面，造血前体编程基因处于单个启动子的控制下。在一些方面，单个启动子是诱导型启动子。在特定方面，诱导型启动子是四环素诱导型启动子。在一些方面，ets/erg基因是erg(v-ets成红细胞增多症病毒e26癌基因同源物)，etv2(变体2)，fli-1(friend白血病病毒整合1)，elk3(含ets结构域的蛋白)，ets1(c-ets-1)或ets2(c-ets-2)。在具体方面，ets/erg基因是erg或etv2。在一些方面，造血前体编程基因包括erg、gata2和hoxa9。在其它方面，造血前体编程基因包括etv2、gata2和hoxa9。在某些方面，造血前体编程基因与靶序列融合。在特定方面，靶向序列是nup98或其同源域。在一些方面，造血前体编程基因包括erg，gata2，hoxa9，nup98-hoxa9和nup98-hoxa10。在其他方面，造血前体编程基因包括etv2，gata2，hoxa9，nup98-hoxa9和nup98-hoxa10。在另一个实施方案中，提供了包含编码造血前体编程基因的表达构建体的细胞，其中编程基因包括ets/erg基因、gata2和hoxa9。在又一个实施方案中，提供了编码一种或多种造血干细胞编程基因的表达构建体。在具体方面，所述一种或多种造血干细胞编程基因选自bcl2,bend4,bmi1,ciita,egr3,etv6,ezh1,ezh2,foxl1,hif3a,hlf,hmga2,hoxa9,hoxa10,hoxa3,hoxa4,hoxa5,hoxa6,hoxa7,hoxb3,hoxb6,hsf5,klf2,klf4,mecom,meis1,mir29a,mir29b1,msi2,myb,mycn,nkx2-3,nr4a2,peg3,prdm12,prdm16,rbak,runx1,runx3,setbp1,sox17,sox8,tfec,zbtb14,zbtb20,zmat1,znf131,znf134,znf136,znf256,znf26,znf300,znf337,znf350,znf414,znf662,znf667和znf682。在某些方面，所述一种或多种造血干细胞编程基因选自hmga2，mycn，nr4a2，sox17，tfec，meis1，hoxa4，znf414，klf4，znf131，bcl2，etv6，znf350，rbak，hoxa6，hoxb6，hoxa7，znf300，znf682和msi2。在具体的方面，一种或多种造血干细胞编程基因选自hmga2，mycn，nr4a2，sox17，tfec，meis1，hoxa4，znf414，klf4，znf131，bcl2，etv6，znf350和rbak。在某些方面，一种或多种造血干细胞编程基因处于巨细胞病毒(cmv)启动子的控制下。在一些方面，造血干细胞编程基因与靶向序列融合。在一个具体方面，靶向序列是nup98或其同源域。在另一个实施方案中，提供了包含编码一种或多种造血干细胞编程基因的表达构建体的细胞。在又一个实施方案中，提供了从人多能干细胞体外分化的造血干细胞，其能够在哺乳动物的骨髓中移植并产生分化的人血细胞。根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应该理解的是，尽管指出了本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体实施例仅仅是以示例的方式给出的，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改根据该详细描述对于本领域技术人员将变得明显。附图的简要说明以下附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图并结合在本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。图1a-1f。etv2/erg、gata2和hoxa9的连锁共表达有效地将人psc编程为未成熟cd34+造血祖细胞。(a)显示了编程基因etv2/erg、gata2和hoxa9的测试配置。(b)使用经改造以组成性表达rttet蛋白质的人psc就多西环素(dox)诱导性基因表达测试e+g、eg和egh诱导基因配置。(c)在基于etv2和erg的基因配置中第8天诱导的培养物中的绝对细胞计数。(d)显示了与ms5基质细胞共培养的第8天dox诱导的细胞的扩增和分化潜能。(e)与ms5基质细胞共培养2周后总cd43+和未成熟cd43+cd34+细胞的绝对计数。(f)在与ms5基质共培养2周后，在egh诱导的细胞中检测到多谱系集落形成潜能。图2：使用cmv启动子(pcmv)的诱导后转基因表达。使用piggybac表达载体将pcmv-egfp和ptight-eg构建体导入表达rttet的人psc。在dox诱导的造血编程之后显示cd43+细胞中的egfp表达。图3a-3c：筛选egh互补转基因，其改善扩增并赋予原始造血祖细胞的cd133表达。(a)在与ms5基质共培养2周后，具有组成性hoxa10表达(pcmv)的egh诱导细胞显示与最原始干细胞样细胞相关的cd43+cd34+cd133+细胞的较小群体。(b)设计用于就改善的原始cd43+cd34+和cd43+cd34+cd133+细胞产量检测egh-互补基因的筛选模型的示意图。(c)显示了对egh诱导的原始祖细胞扩增具有积极作用的基因的筛选结果。分数＝p34×p133×(p34/p45)，其中各个子集的p-产量计算为内部egh对照、34-cd43+cd34+、133-cd43+cd34+cd133+、45-cd43/45+cd34-细胞的分数。图4a-4b：egh诱导的细胞的淋巴样分化潜能。(a)设计用于检测改善egh诱导的细胞的淋巴样细胞发育的基因的筛选模型的示意图。(b)4周t/nk和b细胞分化培养物的流式细胞术分析。图5a-5c：egh诱导的细胞的植入潜能。(a)设计为检测能够在免疫受损小鼠中进行造血移植的egh-互补基因的筛选模型的示意图。(b)显示注射后12周在nbsgw小鼠的外周血和骨髓中的人造血cd45+细胞检测。(c)显示注射后12周在nbsgw小鼠的外周血和骨髓中的人造血cd43/45+细胞检测。图6：显示植入细胞与注射细胞中转基因表达的比率的图。相应的植入/注射表达比率显示细胞移植后转基因的富集(正值)或消耗(负值)。说明性实施方案的描述本公开内容通过提供用于从多能干细胞(psc)产生多谱系造血前体细胞的方法和组合物克服了现有技术的几个主要问题。特别地，多谱系造血前体细胞可以被编程为能够长期植入的造血干细胞。发明人发现实现多谱系造血前体细胞的一种方式是用一种或多种表达载体转染psc，所述表达载体实现至少三种特定基因的表达，所述特定基因的表达调节psc的“正向编程”为多谱系造血前体细胞。值得注意的是，本公开内容的方法适用于任何类型的多能干细胞，包括例如胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。特别是，多谱系造血前体具有有效分化成髓样和淋巴样谱系细胞的潜力。优选地，造血编程基因是etv2或erg、gata2和hoxa9。在特定方面，造血编程基因处于单个启动子(例如诱导型启动子)的控制下。通常，造血编程基因仅表达足以将psc正向编程为造血前体细胞的时间。在形成了未成熟的多谱系造血前体后，发明人已发现为了使造血干细胞能够长期植入，优选采取另外的一个或多个步骤。在一种方法中，用一种或多种另外的表达构建体转染psc，所述表达构建体编码一种或多种造血干细胞编程基因，其表达使得多谱系造血前体能够在体内稳定植入。在某些方面，用于长期植入的造血干细胞编程基因在未成熟的造血前体细胞中表达，但在psc中不表达。因此，本公开内容的方法提供了无限数量的多谱系造血前体和造血干细胞以用于广泛的应用，例如体内造血前体的稳定移植，体外筛选化合物，以及阐明血液疾病和损伤的机制。i.定义如本文所用，就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法检测不到特定组分的量的组合物。如在此说明书中使用的，“一个”或“一种”可以表示一个或多个/一种或多种。如权利要求中所使用的，当与单词“包括”一起使用时，单词“一个”或“一种”可以表示一个或多于一个/一种或多于一种。在权利要求中术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅涉及替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。贯穿本申请，术语“约”用于指示值包括用于确定该值的方法、装置的误差的固有变化，或者存在于研究受试者之间的变化。当与细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸一起使用时，术语“外源的”是指已通过人工或天然的手段被导入细胞或生物体的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸；或相对于细胞而言，该术语是指分离并随后通过人工或天然手段引入其他细胞或生物体的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者它可以是在生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或多个另外的拷贝。外源细胞可能来自不同的生物体，或者也可能来自同一生物体。作为非限制性实例，外源核酸是处于与它在天然细胞中的位置不同的染色体位置的核酸，或者另外地其侧翼是与天然界中发现的核酸序列不同的核酸序列。“表达构建体”或“表达盒”是指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括指导一种或多种所需细胞类型、组织或器官中的基因表达的一种或多种转录调控元件(例如启动子，增强子或与其功能等同的结构)。还可以包括附加元件，例如转录终止信号。“载体”或“构建体”(有时称为基因递送系统或基因转移“媒介物”)是指包含待体外或体内递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子的复合物。“质粒”是常见类型的载体，其是与染色体dna分离的染色体外dna分子，其能够独立于染色体dna而复制。在某些情况下，它是环状和双链的。“复制的起点”(“ori”)或“复制起点”是当存在于细胞中的质粒中时能够维持质粒中的连锁序列的dna序列(例如在嗜淋巴疱疹病毒中的)和/或dna合成启动处或附近的位点。例如，ebv的ori包括fr序列(30bp重复序列的20个不完全拷贝)，优选ds序列；然而，ebv中的其他位点结合ebna-1，例如，rep*序列可以替代ds作为复制起点(kirshmaier和sugden，1998)。因此，ebv的复制起点包括fr、ds或rep*序列或通过核酸修饰的任何功能等同的序列或由其衍生的合成组合。例如，如lindner等，2008中具体描述的，本方法还可以使用ebv的基因工程复制起点，诸如通过个体元件的插入或突变。“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是当置于适当的调控序列的控制下时在体外或体内转录并且任选还翻译成基因产物例如多肽的核酸分子。编码区可以以cdna、基因组dna或rna形式存在。当以dna形式存在时，核酸分子可以是单链的(即有义链)或双链的。编码区的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。基因可以包括但不限于来自原核或真核mrna的cdna，来自原核或真核dna的基因组dna序列和合成的dna序列。转录终止序列通常位于基因序列的3'端。术语“控制元件”统指共同提供编码序列在受体细胞中的复制、转录、转录后加工和翻译的启动子区域、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(ires)、增强子、剪接点等。只要选定的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和翻译，并非所有这些控制元件都需要存在。术语“启动子”在本文中以其普通含义使用，指包含dna调控序列的核苷酸区域，其中调控序列源自能够结合rna聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列转录的基因。它可以含有调节性蛋白和分子(例如rna聚合酶和其他转录因子)可能结合的遗传元件，以启动核酸序列的特异性转录。短语“可操作定位”，“可操作连接”，“在控制下”和“在转录控制下”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或取向以控制转录起始和/或该序列的表达。“增强子”是指当位于启动子附近时，启动子产生的转录活性相对于缺乏增强子结构域时赋予增加的转录活性的核酸序列。关于核酸分子的“可操作地连接”或“共表达”是指两个或更多个核酸分子(例如待转录的核酸分子，启动子和增强子元件)以允许核酸分子转录的方式连接。关于肽和/或多肽分子的“可操作地连接”或“共表达”是指两个或更多个肽和/或多肽分子以产生单一多肽链即融合多肽的方式连接，具有融合物的每种肽和/或多肽组分的至少一种性质。融合多肽优选是嵌合的，即由异源分子组成。“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽之间的同一性百分比。一个序列与另一个序列之间的对应关系可以通过本领域已知的技术来确定。例如，通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序，通过两个多肽分子之间的序列信息的直接比较可以确定同源性。或者，通过在促进同源区域之间稳定双链体形成的条件下，通过多核苷酸杂交，随后用单链特异性核酸酶消化和消化片段的大小确定来确定同源性。如使用上述方法测定的，当至少大约80％，优选至少大约90％，和最优选至少大约95％的核苷酸或氨基酸分别在分子的确定的长度上匹配时，两个dna序列或两个多肽序列彼此“基本上同源”。术语“细胞”在本文中以其最广泛的含义使用，并且指作为多细胞生物体的组织结构单元的活体，其被将其与外部隔离的膜结构包围，具有自我复制的能力，并具有遗传信息和表达它的机制。本文使用的细胞可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如融合细胞，遗传修饰的细胞等)。术语“干细胞”在本文中指细胞，其在合适的条件下能够分化成多种范围的特化细胞类型，而在其他合适的条件下能够自我更新并保持基本上未分化的多能状态。术语“干细胞”还包括多能细胞，多潜能细胞，前体细胞和祖细胞。示例性的人干细胞可以从获自骨髓组织的造血或间充质干细胞，获自胚胎组织的胚胎干细胞或获自胎儿的生殖器组织的胚胎生殖细胞获得。示例性多能干细胞还可以通过体细胞通过与多能性相关的某些转录因子的表达将其重编程为多能状态来产生；这些细胞被称为“诱导的多能干细胞”或“ipsc”。“胚胎干(es)细胞”是未分化的多能细胞，其在早期从胚胎(例如胚泡阶段的内细胞团)获得，或通过人工方式(例如核转移)产生并且可以在胚胎或成人中产生任何分化的细胞类型，包括生殖细胞(例如精子和卵子)。“诱导的多能干细胞(ipsc)”是通过表达或诱导表达因子组合(本文中称为重编程因子)重编程体细胞而产生的细胞。可以使用胎儿、出生后、新生儿、幼年或成人体细胞产生ipsc。在某些实施方案中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括例如oct4(有时称为oct3/4)，sox2，c-myc，klf4，nanog和lin28。在一些实施方案中，体细胞通过表达至少两种重编程因子，至少三种重编程因子，至少四种重编程因子或至少五种重编程因子将体细胞重编程为多能干细胞而重新编程。“多能干细胞”是指具有分化成构成一个或多个组织或器官或者优选三种胚层中的任何一种的所有细胞的潜能的干细胞，该三种胚层是：内胚层(内胃衬，胃肠道，肺)，中胚层(肌肉，骨骼，血液，泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。如本文所用，术语“体细胞”是指不是生殖细胞(例如卵，精子等)的任何细胞，其不直接将其dna转移到下一代。通常，体细胞具有有限的或无多能性。此处使用的体细胞可以是天然存在的或遗传修饰的。“编程”是改变细胞可产生的后代类型的过程。例如，当细胞已经被改变从而与在无编程的相同条件下能够形成的细胞相比，其可以在培养物或体内形成至少一种新细胞类型的后代时，已经对细胞进行了编程。这意味着在充分增殖后，观察到具有新细胞类型表型特征的可测量比率的后代，如果在编程之前基本上不能形成这样的后代；或者，与编程之前相比，具有新细胞类型特征的比率可测量地更多。这个过程包括分化、去分化和转分化。“分化”是较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。“去分化”是细胞过程，其中部分或终末分化的细胞回复到早期发育阶段，如多能性或多能性。“转分化”是将一种分化细胞类型转化为另一种分化细胞类型的过程。典型地，通过编程发生转分化而细胞不经过中间多能性阶段-即，细胞直接从一种分化细胞类型编程为另一种分化细胞类型。在某些条件下，具有新细胞类型特征的子代的比率可以按照增加的优先顺序为至少约1％，5％，25％或更多。术语“正向编程”是指通过向多潜能或多能细胞提供一种或多种特定谱系决定基因或基因产物而编程多潜能或多能细胞，与不具有多能性的分化的体细胞相反。例如，正向编程可描述将esc或ipsc编程为造血前体细胞或其他前体细胞，或造血细胞或其他分化的体细胞的过程。术语“造血前体编程基因”是当单独表达或与另一编程基因组合表达时能够将多能干细胞正向编程为能够产生淋巴样和髓样谱系细胞的造血前体细胞的基因。术语“造血干细胞编程基因”是当单独表达或与另一编程基因组合表达时能够与造血前体编程基因组合地编程能够长期植入的造血干细胞的基因。如本文所用，“2a序列”是指允许从单个载体共表达多种蛋白质的短肽。这些小肽可作为两种蛋白之间的接头引入，从而允许多蛋白的自主核糖体内自我加工(参见例如defelipe.geneticvaccinesandther.2：13(2004)；defelipe等人，traffic5：616-626(2004))。现有技术中已知有许多2a元件。可以在本文公开的方法和系统中使用的2a序列的实例包括但不限于来自口蹄疫病毒(f2a)，马鼻炎a病毒(e2a)，thoseaasigna病毒(t2a)，和美国专利公开号20070116690中描述的猪捷申病毒-1(p2a)的2a序列，其通过引用并入本文。如本文所用，术语“受试者”或“有需要的受试者”是指任何年龄的需要细胞或组织移植的雄性或雌性哺乳动物，优选人。通常，受试者需要细胞或组织移植(在本文中也称为受体)，这是由于适合经由细胞或组织移植治疗的病症或病理或不期望的病症、状态或综合征或身体、形态学或生理学异常。“多谱系构建体”在本文中用于指编码包括ets基因、同源盒基因和造血发育基因的至少三种造血编程基因的构建体。一个示例性构建体编码etv2或erg、gata2和hoxa9。如本文所用，关于造血干细胞或造血前体细胞的术语“植入”是指被引入受体的细胞位于受体的骨髓中，并且可以提供髓样和淋巴样细胞谱系在该受体中的长期重建。“长期植入”在本文中定义为细胞例如由本文方法提供的造血前体细胞在受体中的稳定移植，使得移植细胞在宿主血液和/或骨髓中持续存在超过10周，优选超过20周。另外，长期植入可以通过连续移植小鼠中移植细胞的持久性来表征。ii.参与造血细胞编程的细胞在某些实施方案中，公开了用于从多能干细胞提供多谱系造血前体细胞的方法和组合物。多能干细胞可以是干细胞，包括但不限于诱导性多能干细胞和胚胎干细胞。用于产生造血前体细胞的本发明方法中使用的多能干细胞的特征在于通过有丝细胞分裂而自我更新的能力和分化成多种特化细胞类型的能力。这两种广泛类型的哺乳动物干细胞是：在胚泡中发现的胚胎干细胞和在成人组织中发现的成体干细胞。在发育中的胚胎中，干细胞可以分化成所有的特化胚胎组织。在成人生物体中，干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充特化细胞，并维持再生器官(如血液，皮肤或肠组织)的正常周转。在具体方面，本文使用的多能干细胞是能够在体外长期增殖同时保留分化成身体所有细胞类型(包括本公开内容的造血前体细胞)的潜能的人胚胎干细胞(esc)或诱导的多能干细胞(ipsc)。因此，这些细胞可能为药物开发和治疗用途提供无限量的患者特异性的功能性造血细胞供应。本公开内容的某些方面通过对来自人psc例如esc和ipsc的正向编程，通过表达对造血细胞分化/功能具有重要意义的编程基因的组合来提供多谱系造血前体细胞。a.胚胎干细胞在某些方面，多能干细胞作为胚胎干细胞(esc)。胚胎干细胞来源于胚泡内细胞团，具有较高的体外分化能力。可以通过除去发育胚胎的外滋养层，然后在非生长细胞的饲养层上培养内细胞团来分离es细胞。重新铺板的细胞可以继续增殖并产生新的es细胞集落，其可以被移除、解离、再次重新铺板并允许生长。这种“传代”未分化es细胞的过程可以重复多次以产生含有未分化es细胞的细胞系(美国专利号5,843,780；6,200,806；7,029,913)。es细胞具有增殖潜能，同时维持其多能性。例如，es细胞可用于研究细胞和控制细胞分化的基因。es细胞的多潜能性结合遗传操作和选择可以用于通过产生转基因、嵌合和敲除小鼠来进行体内基因分析研究。用于产生小鼠es细胞的方法是众所周知的。在一种方法中，用小鼠抗血清处理来自小鼠129品系的植入前胚泡以去除滋养外胚层，并将内细胞团在含有胎牛血清的培养基中的化学灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养。在胎牛血清存在下，在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上将未分化es细胞的集落传代培养以产生es细胞群体。在一些方法中，通过将细胞因子白血病抑制因子(lif)加入含血清培养基，可以在没有饲养层的情况下培养小鼠es细胞(smith，2000)。在其他方法中，小鼠es细胞可以在骨形态发生蛋白和lif的存在下在无血清培养基中生长(ying等，2003)。人es细胞可以由受精卵或胚泡阶段的哺乳动物胚胎产生或衍生：通过融合精子和卵细胞、核转移、孤雌生殖或染色质重编程，随后通过先前描述的方法将重编程染色质掺入到质膜中以产生胚细胞(thomson和marshall，1998；reubinoff等，2000)。在一种方法中，将人胚泡暴露于抗人血清，并将滋养外胚层细胞裂解并从内细胞团移除，在小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上培养。此外，来源于内细胞团的细胞团被化学或机械解离、重新铺板，并通过微量移液器选择具有未分化形态的集落，解离并重新铺板。在一些方法中，通过在存在碱性成纤维细胞生长因子的情况下在成纤维细胞的饲养层上培养es细胞，可以在没有血清的情况下培养人es细胞(amit等，2000)。在其他方法中，通过在包含碱性成纤维细胞生长因子的“条件化”培养基的存在下在蛋白质基质例如matrigeltm或层粘连蛋白上培养细胞，可以在没有饲养细胞层的情况下培养人es细胞(xu等人，2001)。通过先前描述的方法(thomson和marshall，1998；thomson等，1995；thomson和odorico，2000；美国专利号5,843,780)，es细胞也可以源自包括恒河猴和绒猴在内的其他生物体，以及来自已建立的小鼠和人细胞系。例如，已建立的人es细胞系包括maoi，ma09，act-4，hi，h7，h9，h13，h14和act30。作为另一个实例，已建立的小鼠es细胞系包括从129品系小鼠胚胎的内细胞团建立的cgr8细胞系，并且cgr8细胞的培养物可以在没有饲养层的情况下在lif存在下生长。es干细胞可以通过蛋白质标记检测，包括转录因子oct4，碱性磷酸酶(ap)，阶段特异性胚胎抗原ssea-1，阶段特异性胚胎抗原ssea-3，阶段特异性胚胎抗原ssea-4，转录因子nanog，肿瘤排斥抗原1-60(tra-1-60)，肿瘤排斥抗原1-81(tra-1-81)，sox2或rex1。b.诱导的多能干细胞在其他方面，本文使用的多能干细胞是诱导多能干(ips)细胞，通常缩写为ips细胞或ipsc。多能性的诱导最初是在2006年使用小鼠细胞(yamanaka等，2006)和2007年使用人细胞(yu等，2007；takahashi等，2007)通过引入与多能性有关的转录因子重编程体细胞实现的。使用ipsc可以避免与大规模临床使用es细胞相关的大多数伦理和实际问题，而具有ipsc衍生的自体移植的患者可能不需要终身免疫抑制治疗来预防移植排斥反应。除了生殖细胞之外，任何细胞都可以用作ipsc的起点。例如，细胞类型可以是角质形成细胞，成纤维细胞，造血细胞，间充质细胞，肝细胞或胃细胞。t细胞也可以用作重编程体细胞的来源(美国专利8,741,648)。对细胞分化的程度或收集细胞的动物的年龄没有限制；甚至未分化的祖细胞(包括成体干细胞)和最终分化的成熟细胞可以用作本文公开的方法中的体细胞的来源。可以使用本领域技术人员已知的方法将体细胞重编程以产生诱导的多能干细胞(ipsc)。本领域技术人员可以容易地产生诱导的多能干细胞，参见例如公开的美国专利申请号20090246875，公开的美国专利申请号2010/0210014；公布的美国专利申请号20120276636；美国专利号8,058,065；美国专利8,129,187；美国专利号8,268,620；pct公开号wo2007/069666a1和美国专利8,268,620，其通过引用并入本文。通常，核重编程因子用于从体细胞产生多能干细胞。在一些实施方案中，利用klf4，c-myc，oct3/4，sox2，nanog和lin28中的至少三种或至少四种。在其他实施方案中，利用oct3/4，sox2，c-myc和klf4。这些核重编程物质的小鼠和人cdna序列可参考wo2007/069666和美国专利8,183,038中提及的ncbi登录号，其通过引用并入本文。用于引入一种或多种重编程物质或编码这些重编程物质的核酸的方法是本领域已知的，并且公开于例如美国专利号8,268,620,8,691,574,8,741,648,8,546,140，公开的美国专利号8,900,871和美国专利号8,071,369，这两个专利都通过引用并入本文。一旦获得，可以在足以维持多能性的培养基中培养ipsc。如美国专利号7,442,548和美国专利公开号2003/0211603中所述，ipsc可与各种培养多能干细胞更具体地胚胎干细胞的培养基和技术一起使用。在小鼠细胞的情况下，通过向普通培养基中加入作为分化抑制因子的白血病抑制因子(lif)进行培养。在人细胞的情况下，期望加入碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)来代替lif。正如本领域技术人员已知的，用于ipsc的培养和维持的其他方法可以用于本发明的方法。在某些实施方案中，可以使用未确定的条件；例如，多能细胞可以在成纤维细胞饲养细胞或已暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基上培养，以保持干细胞处于未分化状态。在一些实施方案中，将细胞在作为饲养细胞的小鼠胚胎成纤维细胞(用辐射或抗生素处理以终止细胞分裂)的共存下培养。或者，可以使用确定的不依赖饲养细胞的培养系统如tesrtm培养基(ludwig等人，2006a；ludwig等人，2006b)或e8tm/essential8tm培养基(chen等，2011)培养多能细胞并将其维持在基本上未分化的状态。已就多个目标设计了质粒，例如实现调节的高拷贝数和避免细菌中质粒不稳定的潜在原因，并提供与用于包括人细胞的哺乳动物细胞相容的质粒选择手段。已对用于人细胞的质粒的双重要求给予了特别的关注。首先，它们适用于大肠杆菌中的维持和发酵，从而可以生产和纯化大量的dna。其次，它们安全且适用于人患者和动物。第一个要求需要高拷贝数的质粒，这些质粒可以在细菌发酵期间选择并且相对容易地保持稳定。第二个要求要求关注元件例如选择性标记和其他编码序列。在一些实施方案中，编码标记的质粒由以下组成：(1)高拷贝数复制起点，(2)选择性标记，例如但不限于用卡那霉素进行抗生素选择的neo基因，(3)转录终止序列，包括酪氨酸酶增强子和(4)用于掺入各种核酸盒的多克隆位点；和(5)编码与酪氨酸酶启动子可操作连接的标记的核酸序列。本领域已知许多质粒载体用于诱导编码蛋白质的核酸。这些包括但不限于美国专利号6,103,470；美国专利号7,598,364；美国专利号7,989,425；和美国专利号6,416,998中公开的载体，其通过引用并入本文。游离型基因递送系统可以是质粒，基于epstein-barr病毒(ebv)的游离型载体(美国专利8,546,140)，基于酵母的载体，基于腺病毒的载体，基于猿猴病毒40(sv40)的游离型载体，基于牛乳头瘤病毒(bpv)的载体或慢病毒载体。病毒基因递送系统可以是基于rna或基于dna的病毒载体(pct/jp2009/062911)。c.由体细胞核转移衍生的胚胎干细胞用于产生造血前体细胞的多能干细胞也可以通过体细胞核移植来制备，其中供体细胞核被转移到无纺锤体卵母细胞中。核转移产生的干细胞在遗传上与供体细胞核相同。在一种方法中，将来自恒河猴皮肤成纤维细胞的供体成纤维细胞核通过电融合引入无纺锤体成熟中期ii恒河猕猴卵母细胞的细胞质中(byrne等，2007)。通过暴露于伊屋诺霉素激活融合的卵母细胞，然后孵育直至胚泡阶段。然后培养选定胚泡的内细胞团以产生胚胎干细胞系。胚胎干细胞系显示正常的es细胞形态，表达各种es细胞标记，并在体外和体内分化成多种细胞类型。iii.造血前体细胞编程因子a.造血前体编程因子本公开内容的某些方面提供了编码造血前体编程基因的构建体，用于将psc编程为多谱系造血前体细胞。本公开内容的多谱系造血前体细胞可以通过修饰psc以表达至少三种造血前体编程基因如ets基因、造血发育基因和homoebox基因而直接从多能干细胞产生。该至少三种造血前体编程基因可以由一种或多种多谱系构建体编码。造血前体编程基因可以与本领域已知的用于造血前体细胞扩增的序列融合(美国专利公开号us20080299095，通过引用并入本文)。示例性的序列是nup98或其同源域。1.ets基因多谱系构建体编码来自e26转化特异性(ets)转录因子家族的至少一个基因。所有ets家族成员通过高度保守的dna结合结构域ets结构域鉴定，ets结构域是与具有中央gga(a/t)dna序列的dna位点结合的有翼螺旋-转角-螺旋结构。除了dna结合功能外，有证据表明ets结构域也参与蛋白质-蛋白质相互作用。ets家族存在于整个身体中，并涉及多种功能，包括调节细胞分化，细胞周期控制，细胞迁移，细胞增殖，细胞凋亡(程序性细胞死亡)和血管生成。这个基因家族的成员已经涉及不同组织的发育以及癌症进展。ets基因可以是ets家族中分为12个亚家族的任何基因，包括elf，elg，erg，erf，ese，ets，pdef，pea3，er71，spi，tcf和tel。例如，ets可以是erg(v-ets成红细胞增多症病毒e26癌基因同源物；登录号nm_001136154)，etv2(ets变体2；登录号nc_000019.10)，fli-1(friend白血病病毒整合1；登录号nm_001167681),elk3(含ets结构域的蛋白；登录号nm_001303511)，ets1(c-ets-1；登录号nm_001143820)，ets2(c-ets-2；登录号nm_001256295)，e74-样因子1(elf1；登录号m_001145353)，e74样因子2(elf2；登录号nm_001276457)，ets相关转录因子(elf4；登录号nm_001127197)，ets变体3(etv3；登录号nm_001145312)，或转录因子pu.1(spi1；登录号nm_001080547)。特别地，ets基因可以是称为erg的内皮分化因子，其也被称为：转录调节子erg，ets相关转化蛋白erg，tmprss2-erg前列腺癌特异性，v-ets成红细胞增多症病毒e26癌基因样，v-ets禽成红细胞增多症病毒e26癌基因相关，或转化蛋白erg。在一些实施方案中，ets基因是erg的特定同种型，例如erg同种型2(erg-2)(登录号nm_004449)或erg同种型3(erg-3)(登录号nm_001136154)。在具体的实施方案中，ets基因是etv2。2.造血发育基因多谱系构建体还编码至少一种造血发育基因。造血发育基因可以是任何诱导造血发育的基因。造血发育基因的非限制性例子包括gfi1(生长因子非依赖性1转录阻遏物；登录号nm_001127215)，gfi1b(生长因子非依赖性1b转录阻遏物；登录号nm_001135031)，tal1(t细胞急性淋巴细胞白血病；登录号nm_001287347)，lyl1(淋巴母细胞白血病衍生序列1；登录号nm_005583)，lmo2(仅lim结构域2(rhombotin样1)；登录号m_001142315)，gata2(gata结合蛋白2；登录号nm_001145661)，或gata3(gata结合蛋白3；登录号nm_001002295)。在具体的实施方案中，造血发育基因是gata2。3.同源盒基因另外，多谱系构建体编码至少一个同源盒基因。同源盒基因编码长约180个碱基对的同源盒，其编码结合dna的蛋白质结构域。特征性同源域蛋白质折叠由60个氨基酸的螺旋-转角-螺旋(hth)结构组成，其中三个α螺旋通过短环区连接。n-末端的两个螺旋是反向平行的，较长的c-末端螺旋大致垂直于由前两个建立的轴。该第三个螺旋通过许多氢键和疏水相互作用直接与dna相互作用，这种相互作用发生在dna的主沟内的特定侧链与暴露的碱基和胸腺嘧啶甲基之间。许多同源域蛋白通过启动产生个体组织和器官所需的共调节基因的级联来诱导细胞分化。同源盒基因可以是编码同源盒结构域的任何基因。例如，同源盒基因可以是hox基因例如hoxa9(登录号nm_152739)，hoxa10(登录号nm_018951)，hoxa3(登录号nm_030661)，hoxa4(登录号nm_002141)，hoxa5(登录号nm_019102)，hoxa6(登录号nm_024014)，hoxa7(登录号nm_006896)，hoxb3(登录号nm_002146)或hoxb6(登录号nm_018952)。hox基因的其他非限制性实例包括活性依赖性神经保护剂同源盒(adnp；登录号nm_001282531)，同源盒蛋白aristaless样4(alx4；登录号nm_021926)，同源盒蛋白dbx1(登录号nm_001029865)，双同源盒4(dux4；nm_001127386)，同源盒蛋白质emx1(登录号nm_001040404)，gbx2(登录号nm_001301687)，在es细胞中表达的同源盒1(hesx1；登录号nm_003865)，nanog(登录号nm_001297698)，pax3登录号nm_000438)，视网膜和前神经折叠同源盒(rax；登录号nm_013435)或锌指e盒结合同源盒1(zeb1；登录号nm_001128128)。在具体的实施方案中，同源盒基因是hoxa9。b.造血干细胞编程因子本公开内容的某些方面提供了编码用于长期植入潜能的造血干细胞编程因子的构建体。能够长期植入的造血干细胞可以直接从本公开内容的多谱系造血前体细胞通过增加细胞中造血干细胞编程基因(特别是表1中列出的基因)的水平而产生。本发明人还考虑将本部分中列出的基因的所有同种型和变体都包括在本公开内容中，并且提供了某些同种型或变体的登录号的非限制性实例。表1提供了用于将多谱系造血前体编程为能够长期植入的造血干细胞的基因列表。由列出的基因id和登录号提供的所有基因序列和相关信息自本申请的申请日通过引用并入本文。表1：用于长期植入潜能的造血干细胞编程基因。在一些实施方案中，造血干细胞编程基因是表1中包括的基因中的任一种，其包括参与造血细胞的特化中的基因，参与造血细胞的维持和/或增殖的基因，和在造血细胞中表达的基因。在某些实施方案中，将一种或多种造血干细胞编程基因组合用于编程至能够长期植入的造血干细胞。在一些实施方案中，将三个或更多个，例如4、5、6、7、8、9、10、15个、至多20个或其中可导出的任何范围的造血干细胞编程基因组合用于编程至能够长期植入的造血干细胞。造血干细胞编程基因可以与本领域已知的扩增造血前体细胞的序列融合(美国专利公开号us20080299095，通过引用并入本文)。示例性的序列是nup98或其同源域。iv.造血编程基因的递送在某些实施方案中，构建用于递送编码编程因子的核酸的载体以在多能干细胞中表达那些因子。下面公开了这些载体的组分和递送方法的细节。另一方面，以下系统和方法也可用于递送报道基因表达盒以鉴定所需细胞类型，例如造血前体细胞。具体而言，可以使用对造血干细胞或造血前体特异的调控元件来驱动报道基因的表达。因此，通过使用报道分子可以表征、选择或富集来源于编程的造血干细胞或前体。a.核酸递送系统本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(参见例如sambrook等，2001和ausubel等，1996，两者均通过引用并入本文)。载体包括但不限于质粒，粘粒，病毒(噬菌体，动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如yac)，如逆转录病毒载体(例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒载体(momlv)，mscv，sffv，mpsv，snv等)，慢病毒载体(例如衍生自hiv-1，hiv-2，siv，biv，fiv等)，腺病毒(aav)载体包括其有复制能力、复制缺陷和无病毒基因(gutless)的形式，猴病毒40(sv-40)载体，牛乳头瘤病毒载体，epstein-barr病毒载体，疱疹病毒载体，牛痘病毒载体，哈维鼠肉瘤病毒载体，鼠乳腺肿瘤病毒载体，rous肉瘤病毒载体。1.病毒载体病毒载体可以在本公开内容的某些方面提供。在产生重组病毒载体时，非必需基因通常用异源(或非天然)蛋白质的基因或编码序列置换。病毒载体是利用病毒序列将核酸和可能的蛋白质导入细胞的一种表达构建体。某些病毒通过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞并整合入宿主细胞基因组并稳定且高效地表达病毒基因的能力使其成为将外来核酸转移入细胞(例如哺乳动物细胞)的有吸引力的候选者。以下描述可用于递送本公开内容的某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例。由于逆转录病毒将它们的基因整合到宿主基因组中、转移大量外来遗传物质、感染广谱物种和细胞类型和被包装在特定细胞系中的能力，逆转录病毒具有作为基因递送载体的前景(miller，1992)。为了构建逆转录病毒载体，将核酸插入病毒基因组中以取代某些病毒序列以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒颗粒，构建了包含gag、pol和env基因的包装细胞系(但没有ltr和包装组分)(mann等，1983)。当将含有cdna以及逆转录病毒ltr和包装序列的重组质粒引入特定细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许重组质粒的rna转录物被包装入病毒颗粒然后将其分泌到培养基中(nicolas和rubenstein，1988；temin，1986；mann等，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(paskind等，1975)。慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外还含有具有调控或结构功能的其他基因。慢病毒载体在本领域中是公知的(参见例如naldini等，1996；zufferey等，1997；blomer等，1997；美国专利6,013,516和5,994,136)。重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可以用于体内和离体基因转移以及核酸序列的表达。例如，美国专利5,994,136描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞用携带包装功能即gag、pol和env以及rev和tat的两种或更多种载体转染，该专利通过引入并入本文。2.游离型载体基于质粒或脂质体的染色体外(即游离型)载体的使用也可以在本公开内容的某些方面提供。这种游离型载体可以包括例如基于orip的载体，和/或编码ebna-1衍生物的载体。这些载体可以允许dna的大片段被引入细胞并维持在染色体外，每个细胞周期复制一次，被有效分配到子细胞，并且基本上不引起免疫应答。特别地，ebna-1(基于orip的表达载体的复制所需的唯一病毒蛋白)不引起细胞免疫应答，因为其已开发出有效机制来绕过将其抗原呈递至mhci类分子所需的处理(levitskaya等，1997)。此外，ebna-1可以反式作用以增强克隆基因的表达，在一些细胞系中诱导克隆基因的表达高达100倍(langle-rouault等，1998；evans等，1997)。最后，这种基于orip的表达载体的制造是便宜的。其他染色体外载体包括其他基于淋巴营养性疱疹病毒的载体。淋巴营养性疱疹病毒是在淋巴母细胞(例如人b淋巴母细胞)中复制并成为其天然生命周期的一部分的质粒的疱疹病毒。单纯疱疹病毒(hsv)不是“淋巴营养性”疱疹病毒。示例性淋巴营养性疱疹病毒包括但不限于ebv，卡波西肉瘤疱疹病毒(kshv)；松鼠猴疱疹病毒(hs)和马立克氏病病毒(mdv)。还考虑了游离体基载体的其他来源，如酵母ars，腺病毒，sv40或bpv。本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(参见例如maniatis等，1988和ausubel等，1994，两者均通过引用并入本文)。载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达或以其他方式向靶细胞提供有益特性的其他组分或功能元件。这样的其他组分包括例如影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的组分；影响摄取后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的组分。这些组分还可以包括标记，例如可用于检测或选择已摄取并正在表达由载体递送的核酸的细胞的可检测和/或选择标记。这些组分可作为载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和摄取的组分或功能元件的某些病毒载体)，或可修饰载体以提供此类功能元件。本领域已知多种这样的载体并且通常是可用的。当载体保持在宿主细胞中时，载体可以在有丝分裂过程中作为自主结构稳定地复制，掺入宿主细胞的基因组中，或保持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。3.基于转座子的系统在某些方面，编程因子的递送可以使用转座子-转座酶系统。例如，转座子-转座酶系统可以是众所周知的sleepingbeauty，frogprince转座子-转座酶系统(关于后者的描述，参见例如ep1507865)或ttaa特异性转座子piggybac系统。转座子是可以在单个细胞的基因组内移动到不同位置的dna序列，称为转座过程。在这个过程中，它们可以引起突变并改变基因组中的dna含量。转座子也曾被称为跳跃基因，并且是可移动遗传元件的实例。存在各种可移动遗传元件，并且可以基于它们的转座机制对它们进行分组。i类可移动遗传元件或逆转录转座子首先被转录成rna，然后通过逆转录酶逆转录为dna，然后被插入到基因组中的另一位置而自我复制。ii类可移动遗传元件直接从一个位置移动到另一个位置，使用转座酶在基因组中“剪切和粘贴”它们。在具体的实施方案中，本公开内容提供的构建体(例如，多谱系构建体)使用piggybac表达系统。piggybac(pb)dna转座子通过“剪切-粘贴”机制移动，由转座子自身编码的转座酶(pb转座酶)在基因组内的其他位点切除并重新整合转座子。pb转座酶特异性识别转座子侧翼的pb反向末端重复序列(itr)；它结合这些序列并催化转座子的切除。pb随后以相对随机的方式整合到整个基因组的ttaa位点。为了产生基因捕获突变(或适合于产生转基因动物)，转座酶在一个质粒上反式供应，并与包含供体转座子的质粒共转染，其为包含侧接转座酶(itr)结合位点的基因陷阱的重组转座子。转座酶将催化从质粒中切除转座子并随后整合到基因组中。在编码区内的整合将捕获基因陷阱表达所需的元件。pb具有几个理想特性：(1)它优先插入基因内(插入的50％到67％命中基因)；(2)它没有局部跳跃(广泛的基因组覆盖)；(3)对过度生产抑制(升高的转座酶水平导致转座减少)不敏感；4)它从供体部位干净地切除，不像sleepingbeauty那样留下“足迹”。4.同源重组在某些方面，可以以特定方式将核酸分子引入细胞中用于基因组工程改造，例如通过同源重组。如上所述，在细胞中表达基因的一些方法涉及使用随机整合到基因组中的病毒载体或转基因。然而，这些方法具有整合出现在不能有效介导整合的核酸的表达或导致天然基因破坏的位点的缺点。与随机整合相关的问题可以通过同源重组到目标基因组中的特定基因座(例如rosa26基因座)来部分克服。同源重组(hr)，也称为一般重组，是一种用于所有生命形式的基因重组，其中核苷酸序列在两条相似或相同的dna链之间交换。自20世纪80年代中期以来，该技术一直是哺乳动物细胞基因组工程的标准方法。这个过程涉及几个步骤的物理破坏和dna的最终重新结合。这一过程被广泛用于修复dna中可能致命的双链断裂。此外，同源重组在减数分裂期间产生dna序列的新组合，这是真核生物制造生殖细胞如精子和卵子的过程。这些新的dna组合代表后代中的遗传变异，使得种群随着时间的推移可以适应不断变化的环境条件。同源重组也用于水平基因转移，以在不同菌株和细菌和病毒物种之间交换遗传物质。同源重组也被用作分子生物学中用于将遗传变化引入到靶生物中的技术。可以使用同源重组作为靶向的基因组修饰。标准hr在哺乳动物细胞中的效率仅为处理的细胞的10-6至10-9(capecchi，1990)。已使用大范围核酸酶或归巢核酸内切酶如i-scei来增加hr的效率。已经使用天然大范围核酸酶以及具有修饰的靶向特异性的工程改造的大范围核酸酶来提高hr效率(pingoud和silva，2007；chevalier等，2002)。提高hr效率的一个途径是改造具有可编程dna特异性结构域的嵌合内切核酸酶(silva等，2011)。锌指核酸酶(zfn)是这样的嵌合分子的一个例子，其中锌指dna结合结构域与iis型限制性内切核酸酶如foki的催化结构域融合(如durai等，2005中所述)。另一类这样的特异性分子包括与iis型限制性内切核酸酶如foki的催化结构域融合的转录激活物样效应物(tale)dna结合结构域(miller等人，2011；pct/ib2010/000154)。talen可以设计用于在几乎任何给定的感兴趣的位点进行位点特异性基因组修饰(cermak等，2011；christian等，2010；li等，2011；miller等，2011；weber等，2011；zhang等人，2011)。位点特异性dna结合结构域表达为与dna切割酶如foki的融合蛋白。dna结合结构域是重复氨基酸的支架；连接每个重复序列的是与dna中的单个核苷酸结合的两个可变氨基酸。例如，asn-asn结合鸟苷，asn-ile结合腺苷，asn-gly结合胸腺嘧啶，而his-asp结合胞嘧啶。这两种氨基酸被称为重复可变双残基或rvd。有许多不同的rvd，可以将它们设计到tal效应子/fok1蛋白质构建体中以创建特定的talen。然后可以纯化编码重组talen的rna并将其转染到细胞中以进行位点特异性基因组修饰。一旦talen引入双链dna断裂，可以通过非同源末端连接(nhej)或通过同源定向修复(hdr)修饰dna。这允许取决于dna修复期间存在的其他序列而进行dna诱变、缺失或添加。b.调控元件包含在用于本公开内容的载体中的表达盒优选含有(以5'至3'方向)与蛋白质编码序列有效连接的真核转录启动子，包含插入序列的剪接信号以及转录终止/聚腺苷酸化序列。1.启动子/增强子本文提供的表达构建体包含驱动编程基因表达的启动子。启动子通常包含用于定位rna合成的起始位点的序列。这最好的实例是tata盒，但在一些缺少tata盒的启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和sv40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始的位置。额外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp区域，尽管已经显示许多启动子在起始位点下游也包含功能元件。为了使编码序列“受控于”启动子，将转录阅读框的转录起始位点的5'末端定位在所选启动子的“下游”(即3')处。“上游”启动子刺激dna的转录并促进编码的rna的表达。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，使得当元件相对于彼此倒转或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加到50bp，然后活性开始下降。根据启动子的不同，单个元件可以共同或独立地起作用以激活转录。启动子可以或可以不与“增强子”结合使用，“增强子”指涉及核酸序列转录激活的顺式作用调控序列。启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，如可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列获得的启动子。这样的启动子可以被称为“内源性”。类似地，增强子可以是与位于该序列的下游或上游的核酸序列天然相关的增强子。或者，通过将编码核酸片段置于重组或异源启动子的控制下来获得某些优点，所述重组或异源启动子是指通常不与其天然环境中的核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子也指通常不与其天然环境中的核酸序列相关的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及不“天然存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，最常用于重组dna构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括pcrtm)连同本文公开的组合物产生序列(参见美国专利号4,683,202和5,928,906，各自通过引用并入本文)。此外，预期可以使用指导在非核细胞器例如线粒体、叶绿体等内的序列转录和/或表达的控制序列。当然，使用有效指导dna片段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员通常知道启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达的应用(参见例如sambrook等人，1989，通过引用并入本文)。所使用的启动子可以是组成型的，组织特异性的，可诱导的和/或在合适的条件下用于指导导入的dna片段的高水平表达，例如在大规模生产重组蛋白和/或肽中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。另外，任何启动子/增强子组合(例如，根据通过万维网在epd.isb-sib.ch/上的真核启动子数据库epdb)也可用于驱动表达。使用t3、t7或sp6细胞质表达系统是另一个可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶，真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录，作为递送复合物的一部分或作为另外的基因表达构建体。启动子的非限制性例子包括早期或晚期病毒启动子，如sv40早期或晚期启动子，巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒(rsv)早期启动子；真核细胞启动子，例如，例如，β肌动蛋白启动子(ng，1989；quitsche等人，1989)，gadph启动子(alexander等人，1988，ercolani等人，1988)，金属硫蛋白启动子(karin等人，1989；richards等人，1984)；和连接的响应元件启动子，例如环状amp应答元件启动子(cre)，血清应答元件启动子(sre)，佛波醇酯启动子(tpa)和在最小tata盒附近的应答元件启动子(tre)。也可以使用人生长激素启动子序列(例如，genbank中描述的人生长激素最小启动子，登录号x05244，核苷酸283-341)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可从atcc获得，目录号atcc45007)。作为鉴定衍生的造血细胞和前体的方法，组织特异性转基因表达，特别是造血细胞和来自编程的造血细胞的前体中的报道基因表达可能是期望的。为了提高特异性和活性，已经考虑使用顺式作用调节元件。例如，可以使用造血细胞特异性启动子。许多这样的造血细胞特异性启动子是本领域已知的，例如表1中提供的造血基因的启动子。在某些方面，本发明的方法还涉及增强子序列，即增加启动子活性并且具有顺式作用且不管其取向甚至在相对长的距离(距离目标启动子多至几千个碱基)上起作用的可能性的核酸序列。然而，增强子功能不一定限于如此长的距离，因为它们也可以靠近给定的启动子起作用。已经鉴定了许多造血细胞启动子和增强子序列，并且可以用于本发明的方法中。参见例如美国专利5,556,954；美国专利申请20020055144；美国专利申请20090148425。在特定方面，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子的活性可以通过生物或非生物因子的存在或不存在来诱导。诱导型启动子在基因工程改造中是非常有力的工具，因为可操作地连接至其的基因的表达可以在生物体发育的某个阶段或在特定组织中打开或关闭。例如，可以使用基于大肠杆菌四环素抗性操纵子的基本调节组分的tet-on和tet-off诱导型基因表达系统。一旦建立在起始细胞中，诱导剂多西环素(dox，四环素衍生物)可以以剂量依赖性方式控制表达系统，从而允许精确调节编程基因的表达水平。在示例性实施方案中，诱导型启动子是rttet诱导型紧密启动子(ptight)。因此，ptight启动子可用于诱导多谱系编程基因如etv2、gata2和hoxa9表达足够的时间以允许将psc编程为造血前体细胞，并且随后可以关闭该表达。ptight启动子也可以是双向启动子。2.起始信号和连锁表达在本发明的方法中提供的表达构建体中也可以使用特定的起始信号来有效翻译编码序列。这些信号包括atg起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括atg起始密码子。本领域的普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框“符合读框”，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含适当的转录增强子元件可以增强表达效率。在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(ires)元件来产生多基因或多顺反子信息。ires元件能够绕过5'甲基化cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并开始在内部位点翻译(pelletier和sonenberg，1988)。哺乳动物信息中的ires(macejak和sarnow，1991)已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的ires成分(pelletier和sonenberg，1988)。ires元件可以与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框可以一起转录，每个框架由一个ires分隔开来，从而形成多顺反子信息。凭借ires元件，核糖体可以利用每个开放阅读框进行高效翻译。使用单个启动子/增强子可以有效表达多个基因以转录单个信息(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，各自通过引用并入本文)。另外，某些2a序列元件可用于在本公开内容中提供的构建体中产生编程基因的连锁或共表达。例如，可以使用切割序列通过连接开放阅读框以形成单个顺反子来共表达基因。示例性的切割序列是f2a(口蹄疫病毒2a)或“2a样”序列(例如thoseaasigna病毒2a；t2a)(minskaia和ryan，2013)。在具体的实施方案中，f2a切割肽用于连接多谱系构建体中基因的表达。3.复制起点为了在宿主细胞中增殖载体，其可以含有一个或多个复制位点起始(通常称为“ori”)，例如，与上述ebv的orip或在编程中具有相似或升高的功能的遗传上工程化的orip相对应的核酸序列，其是启动复制的特定核酸序列。或者，可以使用如上所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ars)。4.选择和可筛选标记在某些实施方案中，本公开内容的含有核酸构建体的细胞可以通过在表达载体中包含标记而体外或体内鉴定。这种标记会赋予细胞可识别的变化，从而容易鉴定含有表达载体的细胞。通常，选择标记是赋予允许选择的属性的标记。阳性选择标记是其中标记的存在允许其选择的标记，而阴性选择标记是其存在阻止其选择的标记。阳性选择标记的一个例子是耐药性标记。通常包含药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予对新霉素，嘌呤霉素，潮霉素，dhfr，gpt，博来霉素和组氨醇醇的抗性的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于条件的实施区分转化体的表型的标记之外，还设想了其他类型的标记，包括基于比色分析的可筛选标记，例如gfp。或者，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标记，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(cat)。本领域技术人员也知道如何使用免疫学标记，其可能与facs分析结合。所使用的标记不被认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标记的其他例子对于本领域技术人员来说是公知的。c.核酸递送如本文所述，将核酸(例如dna或rna)引入待利用本发明的方法编程为造血前体细胞的多能干细胞中可以使用用于核酸递送以转化细胞的任何合适的方法，或者正如本领域普通技术人员所知道的那样。这些方法包括但不限于直接递送dna，例如通过离体转染(wilson等人，1989，nabel等人，1989)，通过注射(美国专利号5,994,624,5,981,274,5,945,100,5,780,448,5,736,524,5,702,932,5,656,610,5,589,466和5,580,859，通过引用并入本文)，包括显微注射(harland和weintraub，1985；美国专利号5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253,通过引用并入本文；tur-kaspa等人,1986；potter等人,1984)；通过磷酸钙沉淀(graham和vandereb，1973；chen和okayama，1987；rippe等人，1990)；通过使用deae-葡聚糖和聚乙二醇(gopal，1985)；通过直接声波加载(fechheimer等人，1987)；通过脂质体介导的转染(nicolau和sene，1982；fraley等人，1979；nicolau等人，1987；wong等人，1980；kaneda等人，1989；kato等人，1991)和受体介导的转染(wu和wu，1987；wu和wu，1988)；通过微粒轰击(pct申请号wo94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,7835,563,055,5,550,318,5,538,877和5,538,880，并且各自通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(kaeppler等人，1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，通过引用并入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的dna摄取(potrykus等人，1985)以及这些方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术，细胞器、细胞、组织或生物体可以被稳定或瞬时转化。1.脂质体介导的转染在某个实施方案中，可以通过脂质体介导的转染将核酸引入多能干细胞。在该方法中，核酸被包载在脂质复合物例如脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在封闭结构形成之前发生自我重排并在脂质双分子层之间包裹水和溶解的溶质(ghoshandbachhawat，1991)。还考虑了与lipofectamine(gibcobrl)或superfect(qiagen)复合的核酸。所使用的脂质体的量可以根据脂质体的性质以及使用的细胞而变化，例如，可以考虑每1至10x106个细胞约5至约20μg载体dna。体外脂质体介导的核酸递送和外源dna表达已经非常成功(nicolau和sene，1982；fraley等，1979；nicolau等，1987)。在培养的鸡胚、hela和肝细胞瘤细胞中脂质体介导的递送和外源dna的表达的可行性也已被证实(wong等，1980)。在某些实施方案中，脂质体可以与血凝素病毒(hvj)复合。已显示这有助于与细胞膜融合并促进脂质体包裹的dna进入细胞(kaneda等，1989)。在其他实施方案中，脂质体可以与核非组蛋白染色体蛋白(hmg-1)(kato等，1991)结合或联合使用。在一些实施方案中，脂质体可与hvj和hmg-1二者复合或联合使用。在其他实施方案中，递送载体可以包含配体和脂质体。2.电穿孔在某些实施方案中，通过电穿孔将核酸引入细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔涉及将细胞和dna的悬浮液暴露于高电压放电。受体细胞可以通过机械伤害更容易转化。所用载体的量也可以根据使用的细胞的性质而变化，例如，可以考虑每1至10x106个细胞约5至约20μg载体dna。使用电穿孔转染真核细胞已经相当成功。已经用人κ-免疫球蛋白基因转染了小鼠前b淋巴细胞(potter等，1984)，并且用这种方式用氯霉素乙酰转移酶基因(tur-kaspa等，1986)转染了大鼠肝细胞。v.产生造血前体细胞的方法a.多谱系造血前体细胞本公开内容提供了用于从多能干细胞(psc)产生多谱系造血前体细胞的方法。将psc(例如esc或ipsc)进行基因修饰以表达本文所述的造血前体编程基因，其将psc正向编程为多谱系造血前体细胞。特别是，多谱系造血前体具有分化成髓样和淋巴样谱系细胞的潜能。优选地，造血前体编程基因包括ets基因、造血发育基因和同源盒基因。示例性造血前体编程基因包括evt2或erg、gata2和hoxa9。另外的造血前体编程基因，例如hoxa10可以增强正向编程效率。在一些方面，造血编程基因与本领域已知用于扩增造血前体细胞的序列融合(美国专利公开号us20080299095，通过引用并入本文)。示例性的序列是nup98或其同源域。在一个示例性方法中，造血前体编程基因包括evt2或erg，gata2，hoxa9，nup98-hoxa9和nup98-hoxa10。造血前体编程基因可以由一个或多个表达构建体编码。优选地，基因由一种表达构建体编码。因此，造血前体编程基因的表达可以在单个启动子的控制下。造血编程基因的表达可以例如通过ires或2a序列元件可操作地连接。优选地，三种造血前体编程基因只被表达足以将psc正向编程为造血前体细胞的一段时间。因此，造血前体编程基因可以处于诱导型启动子的控制之下。因此，可以在psc中诱导造血前体编程基因的表达足够的时间以正向编程至多谱系造血前体细胞。该时间段可以是约1天至约20天，诸如约3,4,5,6,7,8,9或10天。或者，可通过游离型载体将造血前体编程基因引入psc。因此，造血前体编程基因可以在psc中短暂表达。然后可以进一步培养多谱系造血前体细胞以产生淋巴样和髓样谱系细胞以及进一步编程为可植入的造血干细胞。b.用于长期植入的造血细胞多谱系造血前体细胞可以进一步编程为能够长期植入的造血干细胞。优选地，用一种或多种另外的表达构建体转染psc或造血前体细胞，所述一种或多种另外的表达构建体编码本文所述的一种或多种造血干细胞编程基因(例如表1)，其表达使得多谱系造血前体在体内稳定植入。一种或多种另外的表达构建体可以与多谱系构建体同时或在psc已经正向编程为未成熟造血前体细胞之后被引入psc。用于长期植入的造血干细胞编程基因可以由一种或多种表达构建体编码。优选地，多个基因由表达构建体编码。因此，一个或多个造血干细胞编程基因(即长期植入基因)的表达可以处于单个启动子的控制之下。长期植入基因的表达可以可操作地连接，例如通过ires或2a序列元件。在某些方面，用于长期植入的造血干细胞编程基因在多谱系造血前体中表达并且不在psc中表达。因此，造血干细胞编程基因可处于在psc中基本沉默的启动子的控制之下。在一个示例性方法中，造血干细胞编程基因处于巨细胞病毒(cmv)启动子的控制之下。或者，造血干细胞编程基因可以处于诱导型启动子的控制之下。因此，可以在psc已被正向编程为多谱系造血前体细胞之后诱导造血干细胞编程基因的表达。在又一个替代方案中，编码造血干细胞编程基因的构建体可以在它们已经从psc正向编程之后转染到未成熟的造血前体细胞中。c.细胞培养可以在本领域已知的造血干细胞培养条件下培养能够长期植入的多谱系造血前体细胞或造血干细胞。具体而言，造血前体细胞也可以在衍生特定造血谱系如髓样或淋巴样谱系的条件下培养。通常，将本公开内容的细胞在培养基中培养，所述培养基是能够维持细胞生长的富含营养物的缓冲溶液。根据本文所述的方法，适合于将多能干细胞分离，扩增和分化成造血前体细胞和造血细胞的培养基包括但不限于高葡萄糖dulbecco改良eagle培养基(dmem)，dmem/f-15，liebovitzl-15，rpmi1640，iscove改良dubelcco培养基(imdm)和opti-memsfm(invitrogeninc.)。包含补充有人血清白蛋白、人excyte脂蛋白、转铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和促细胞分裂剂的最小基本培养基，例如iscove改良dulbecco培养基(imdm)的化学成分确定的培养基也是合适的。如本文所用，促细胞分裂剂是指刺激细胞分裂的试剂。药物可以是化学物质，通常是某种形式的蛋白质，它刺激细胞开始细胞分裂，从而触发有丝分裂。在一个实施方案中，如美国系列号08/464,599和wo96/39487中所述的无血清培养基和如美国专利号5,486,359中所述的“完全培养基”预期与本文所述的方法一起使用。在一些实施方案中，培养基补充有的10％胎牛血清(fbs)，人自体血清，人ab血清或富含血小板的血浆，其补充有肝素(2u/ml)。细胞培养物可保持在co2气氛(例如5％至12％)中以维持培养液的ph，在37℃下在潮湿的气氛中温育并传代以保持汇合度低于85％。待分化为造血细胞及其前体的多能干细胞可以在足以维持多能性的培养基中培养。在本公开内容的某些方面中产生的诱导的多能干细胞的培养可以使用开发用于培养灵长类多能干细胞更特别是胚胎干细胞的各种培养基和技术，如美国专利申请20070238170和美国专利申请20030211603中描述的。例如，与人胚胎干细胞一样，可以将诱导的多能干细胞维持在80％dmem/f12(gibco#11330032或#11320082)、20％knockout血清替代物、1％非必需氨基酸、1mml-谷氨酰胺、0.1mmβ-巯基乙醇和bfgf(4-100ng/ml)(pct申请wo99/20741)。或者，可将人es细胞和ips细胞维持在化学成分确定的无血清培养基如mtesr1中。通过在增加造血编程因子的细胞内水平以足以促进细胞编程为造血前体细胞的条件下，在培养基中培养多能干细胞或其他非造血细胞，可以产生造血细胞及其前体。培养基还可以含有一种或多种造血细胞分化和成熟剂，如各种生长因子。这些药物可以帮助诱导细胞表现出更成熟的表型-或优先促进成熟细胞的存活-或者具有这两种效应的组合。造血前体细胞和造血细胞分化和成熟剂可以包括能够促进造血细胞谱系细胞生长的可溶性生长因子(肽激素，细胞因子，配体-受体复合物和其他化合物)。这些试剂的非限制性实例包括但不限于造血或内皮生长因子如成纤维细胞生长因子(fgf)，血管内皮生长因子(vegf)，干细胞因子(scf)，血小板生成素(tpo)，flt-3(flt3l)，白细胞介素-3(il-3)，白细胞介素-6(il-6)，白细胞介素-9(il-9)或粒细胞集落刺激因子(g-csf)或其同种型或变体。vi.造血前体细胞和造血干细胞特征本公开内容的造血前体细胞和造血干细胞可以根据许多表型标准来表征。标准包括但不限于表达的细胞标记的检测或定量，功能活性以及形态特征和细胞间信号的表征。在其它方面，待编程的细胞可包含报道基因表达盒，所述报告基因表达盒包含组织或细胞特异性转录调控元件，如造血细胞特异性启动子以用于造血细胞识别。涵盖在本公开内容的某些方面的造血前体细胞具有天然造血前体细胞特征性的形态学特征。这些特征是本领域技术人员在评估这些情况时容易理解的，并且包括检测产生圆形非贴壁细胞的细胞簇。另外，造血前体细胞具有圆形形状和低的细胞质与细胞核比率。本发明的细胞还可根据其是否表达造血细胞谱系细胞的某些特征性标记来表征。用于区分造血干细胞和造血细胞前体的细胞标记的非限制性实例包括：cd43，cd33，cd34，cd45，cd235a，cd38，cd90，cd133，cd105，cd117(c-kit；scf受体)，cd74和cd41a。例如，能够分化成髓样和淋巴样谱系的不成熟造血前体可以通过cd43和cd34阳性来区分。为了鉴定已经从多潜能起始细胞(例如esc或ipsc)分化的细胞，鉴定不表达存在于多能干细胞或体细胞上的某些标记(如tra-1-60，tra-1-81，cd166或cd140b)的细胞可能是有用的。可以通过与其他细胞的比较来确定这种标记的表达水平的评估。造血前体细胞或造血细胞标记的阳性对照包括成人造血细胞或感兴趣物种的造血干细胞，和已建立的造血细胞系。请读者注意，永久细胞系或长期造血细胞培养物可能代谢改变，并且不能表达原代造血细胞和造血前体细胞的某些特征。阴性对照包括单独谱系的细胞，如成人成纤维细胞系，成人间充质干细胞或视网膜色素上皮细胞(rpe)。如下面的例子所示，未分化的干细胞对于上面列出的一些标记是阳性的，但对于造血细胞和造血前体细胞的某些标记是阴性的。本公开内容中列出的造血特异性蛋白质和寡糖决定簇可以使用任何合适的免疫学技术检测，例如用于细胞表面标记的流式免疫细胞化学，用于细胞内或表面标记的免疫组织化学(例如固定的细胞或组织切片)，细胞提取物的蛋白质印迹分析和酶联免疫测定法，用于分泌到培养基中的细胞提取物或产物。如果在标准免疫细胞化学或流式细胞术测定中，任选地在细胞固定之后，并且任选使用标记的二级抗体或其他缀合物(例如生物素-抗生物素蛋白缀合物)以放大标记，显著可检测量的抗体将与抗原结合，则细胞表达抗原被称为“抗体可检测的”。还可以通过northern印迹分析，斑点印迹杂交分析或通过使用标准扩增方法中的序列特异性引物的逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)在mrna水平检测特异性(例如造血前体细胞特异性)标记的表达(美国专利号5,843,780)。本公开内容中列出的特定标记的序列数据可以从公共数据库如genbank获得。根据本公开内容描述的测定之一，如果在细胞样品上根据典型加对照的实验的标准程序进行的测定的表现在标准时间窗口内导致明显可辨别的杂交或扩增产物，则在mrna水平上的表达被称为根据本公开内容的测定之一是“可检测的”。除非另有要求，否则如果相应的mrna可通过rt-pcr检测到，则表示特定标记的表达。如果水平比对照细胞如未分化的多能干细胞、成纤维细胞或其他不相关的细胞类型的水平高至少2倍并且优选高于10或50倍，则在蛋白质或mrna水平检测到的特异性标记的表达被认为是阳性的。还可根据它们是否表现出造血谱系细胞的特征性功能活性来表征细胞。例如，造血前体细胞具有自我更新的能力并且可以产生多于一种类型的造血细胞。在具体的实施方案中，获得的造血前体细胞可以有效地产生淋巴样细胞(例如t细胞，b细胞和nk细胞)，红-巨核细胞(例如红细胞和凝血细胞)，和髓样细胞(例如，粒细胞和单核细胞)。在其他实施方案中，造血干细胞能够在哺乳动物中长期植入。例如，在小鼠模型中的长期植入可以通过例如在植入后6、12、18、20或25周在外周血和/或骨髓中存在人造血细胞(例如cd45+和hlai类+的细胞)来表征。通过根据本发明方法编程提供的造血前体细胞和造血干细胞可具有它们旨在呈现的细胞阶段的许多特征。存在于特定细胞中的这些特征越多，其就越能表征为造血细胞谱系的细胞。具有至少2、3、5、7或9个这些特征的细胞是越来越优选的。关于可能存在于培养容器或施用制剂中的特定细胞群，表达这些特征的细胞之间的一致性通常是有利的。在这种情况下，其中至少约40％，60％，80％，90％，95％或98％的细胞具有期望特征的群体是越来越优选的。vii.造血前体细胞和造血干细胞的用途由本公开内容的某些方面的方法和组合物提供的造血前体细胞和造血干细胞可用于各种应用。这些包括但不限于体内移植或植入造血细胞和造血前体；筛选细胞毒性化合物，致癌物，诱变剂生长/调节因子，药物化合物等；阐明血液病和损伤的机制；研究药物和/或生长因子的作用机制；诊断和监测患者的癌症；基因治疗；和生物活性产品的产生，仅举几例。a.测试化合物筛选本公开内容的编程衍生的造血前体细胞和造血干细胞可用于筛选影响本文提供的造血细胞的特征的因子(诸如溶剂，小分子药物，肽和多核苷酸)或环境条件(诸如培养条件或操作)。本公开内容的特定筛选应用涉及药物研究中的药物化合物的测试。读者通常参考标准教科书“invitromethodsinpharmaceuticalresearch”，academicpress，1997，和美国专利号5,030,015。在某些方面，编程为造血谱系的细胞在标准药物筛选和毒性测定中起到测试细胞的作用，如之前在短期培养中对造血细胞和前体进行的那样。候选药物化合物活性的评估通常涉及将某些方面提供的造血细胞或前体与候选化合物组合，确定归因于该化合物的细胞的形态学，标记表型或代谢活性的任何变化(与未处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)，然后将化合物的作用与观察到的变化相关联。可以进行筛选，因为化合物被设计为对造血细胞或前体具有药理学作用，或者因为设计为具有其他效应的化合物可能对造血细胞或前体具有意想不到的作用。两种或两种以上的药物可联合使用(通过与细胞同时或顺序联合)来检测可能的药物-药物相互作用效应。在一些应用中，可筛选化合物对造血干细胞或造血前体细胞的毒性。b.造血细胞治疗本公开内容还提供了将本文提供的造血干细胞和造血前体细胞用于恢复可能由于血液疾病或病症或损伤而需要这种治疗的受试者的功能程度。例如，通过本文公开的方法衍生的造血细胞和造血前体细胞可用于治疗血液学疾病和病症，例如血红蛋白病，贫血症等。另外，造血干细胞及其前体可用于供应血液或血细胞(例如红细胞，血小板和嗜中性粒细胞)给有需要的受试者(例如需要输血的受试者或患有血液疾病的受试者)。此类细胞可用于治疗由细胞抑制疗法(例如化学疗法)引起的造血细胞缺陷。为了确定本文提供的造血干细胞和前体对治疗应用的适用性，可以首先在合适的动物模型中测试细胞。在一个水平上，评估细胞在体内存活和维持其表型的能力。将本文提供的编程的细胞在适于进一步观察的位置(例如在肾囊下，脾脏中，肝小叶中或骨髓中)施用于免疫缺陷动物(例如nog小鼠或化学或通过辐射免疫缺陷的动物)。在几天到几周或更长时间后收获组织，并评估起始细胞类型如多能干细胞是否仍然存在。这可以通过向被施用细胞提供可检测标记(例如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)来进行；或者通过测量对施用的人细胞具有特异性的组成型标记。当在啮齿动物模型中测试本文提供的编程的细胞时，可以通过使用人特异性抗体的免疫组织化学或elisa或通过使用引起特异于人多核苷酸序列的扩增的引物和杂交条件的rt-pcr分析来评估施用的细胞的存在和表型。在本公开内容的其他地方提供了用于评估mrna或蛋白质水平上的基因表达的合适标记。通过本公开内容的方法提供的造血干细胞和造血前体可以在各种动物模型中测试其治疗血液病症和损伤的能力。例如，镰状细胞贫血症小鼠模型或t/b细胞缺陷型rag-2敲除小鼠可能是用于测试本文公开的造血细胞和造血前体的特别有用的动物模型。在本公开内容的某些方面中提供的在动物模型中表现出期望的功能特征或功效的造血干细胞和造血前体细胞也可适于直接施用于有需要的人受试者。出于止血的目的，细胞可以在任何有足够通路进入的部位给药。造血细胞或其前体也可以在损伤或疾病部位递送。本文提供的细胞可用于治疗有此需要的任何受试者。可能适合于这种治疗的人疾病包括各种贫血和血红蛋白病，以及以造血细胞数量减少为特征的疾病(例如髓样增生异常综合征，髓样纤维化，嗜中性白血球减少症，粒细胞缺乏症，格兰士曼氏血小板无力症，血小板减少症和获得性免疫缺陷综合征)。对于人治疗，剂量通常在约109至1012个细胞之间，并且通常在约5×109至5×1010个细胞之间，从而调整受试者的体重，疾病的性质和严重程度，以及施用的细胞的复制能力。确定治疗模式和适当剂量的最终责任在于管理临床医师。c.商业、治疗和研究目的的分配为了制造、分配和使用的目的，本公开内容的造血前体细胞和造血干细胞通常以在等渗赋形剂或培养基中的细胞培养物或悬浮液的形式供应，任选冷冻以促进运输或储存。本公开内容还包括不同的试剂系统，其包含在制造、分配或使用过程中的任何时间存在的细胞集合或组合。细胞集合包括本公开内容中描述的两种或更多种细胞群体的任何组合，例如但不限于编程衍生的细胞(造血谱系细胞，其前体和亚型)，与未分化的干细胞组合，体细胞衍生的造血细胞或其他分化细胞类型。该集合中的细胞群体有时共享相同的基因组或其遗传修饰形式。每个细胞类型可以在相同或不同的时间在共有商业关系的相同或不同实体的控制下包装在一起，或包装在同一实体中的不同容器中，或包装在不同的位置。v.实施例包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在下面的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在所公开的具体实施方式中做出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。实施例1-etv2/erg、gata2和hoxa9的连锁表达有效地将人psc编程为未成熟cd34+造血祖细胞进行本研究以产生具有多谱系潜能的造血前体，包括髓样和淋巴样潜能。对编程基因的多种配置进行编程效率测试以实现多谱系潜能(表2)。在rttet诱导性tight启动子(ptight)的控制下，将转基因的编码区克隆到piggybac表达载体中。将etv2/erg和gata2(e+g)克隆到分别具有杀稻瘟菌素和遗传霉素抗性的分开的表达载体中。使用联合的杀稻瘟菌素和遗传霉素选择在转染的细胞中实现etv2/erg和gata2共表达。或者，为了在转染的细胞中均衡地表达，在一个ptight-控制的表达盒中通过f2a-切割肽连接etv2/erg和gata2(eg)。发现etv2/erg和gata2(eg)的连锁共表达导致编程效率显著提高，并且似乎绕过当etv2/erg和gata2(e+g)在分开的载体上表达时看到的中间内皮细胞阶段(图1)。表2：编程基因的配置接下来，使用双向tight启动子(bi-ptight)将hoxa9与eg表达盒(egh)连接以确定hoxa9是否可以提高编程效率以产生具有多谱系潜能的造血前体，包括髓样和淋巴样潜能。e+g、eg和egh诱导基因配置使用经改造以组成性表达rttet蛋白质的人psc就多西环素(dox)-诱导性基因表达进行测试。使用电穿孔将piggybac转基因载体与表达hpbase的载体一起导入表达rttet的人psc。用100μg/ml杀稻瘟菌素和/或遗传霉素在培养中选择具有稳定的piggybac转座子整合的细胞。对于转基因诱导的造血编程，转染的psc使用0.5mmedta解离约5-10分钟，重新悬浮于psc培养基(例如tesr或e8)中，并在补充有5μmrock抑制剂肌球蛋白抑制剂的psc培养基中以5-10×104个细胞/孔涂布在基质胶包被的6孔板上。次日，通过用3ml/孔的补充有0.25μg/ml多西环素的诱导培养基(表3)代替psc培养基来启动转基因表达和造血诱导。诱导培养基每隔一天更换一次，使用accutase(innovativecelltechnologies)细胞解离溶液在诱导的第8天收获培养物。表3：诱导培养基组分浓度iscove改良dulbecco培养基(imdm)聚乙烯醇100μg/ml重组人白蛋白100μg/ml人转铁蛋白20μg/ml化学成分确定的脂质浓缩物1/1000；gibco亚油酸0.3μm抗坏血酸磷酸镁150μmn-乙酰半胱氨酸100μm微量元素补充剂a1/5000微量元素补充剂b1/2000微量元素补充剂c1/4000；corning氯化钠5mm肝素0.1μg/ml腐胺0.5μm乙醇胺20μm单硫代甘油100μm胰岛素100ng/mligf1100ng/mlfgf22ng/mlscf100ng/mltpo10ng/ml对收获的细胞进行计数并通过流式细胞术分析以测量cd34+cd43-内皮细胞，cd43+总造血细胞和cd43+cd34+未成熟造血祖细胞。点图和图像表明，在基于etv2和erg的基因配置中，用单独的e+g基因诱导导致产生混合的cd34+cd43-内皮细胞和cd43+造血细胞群，而连锁的eg基因有效地(>80％)编程人psc为cd43+造血细胞群。更重要的是，尽管在e+g和eg诱导的培养物中未成熟cd43+cd34+祖细胞的比率类似(总cd43+细胞的30-40％)，表明造血细胞中具有相似的分化率，但etv2/erg-gat2-hoxa9(egh)基因配置有效诱导和维持造血祖细胞的未成熟群体，如通过超过90％的cd43+细胞中的cd34+表达显示的(图1b)。8天dox诱导的培养物中的绝对细胞计数表明，在基于etv2和erg的基因配置中，通过诱导基因(eg)的连锁，诱导的cd43+造血细胞总数显著(例如，超过5倍)增加，而含有hoxa9的egh基因配置特异性诱导了不成熟cd34+cd43+祖细胞数量的2倍以上(图1c)。为了检查eg-和egh-诱导的造血细胞的功能特性，在与ms5基质细胞共培养物中测试8天dox-诱导的细胞的扩增和分化潜能。将诱导的细胞以104个细胞/孔在4ml/孔共培养培养基(表4)中铺板到具有丝裂霉素c处理的ms5细胞单层的6孔板中。培养物保持2周，每3天换一半培养基。收集非贴壁细胞并通过用1mg/ml胶原酶iv连续处理15分钟和accutase处理15分钟来解离细胞单层。将非贴壁和解离的贴壁细胞组分合并，用于通过流式细胞术分析绝对细胞计数、总cd43+和未成熟cd34+cd43+造血细胞的比率，并通过methocult测定法(stemcelltechnologies)对集落形成细胞进行分析。与eg诱导的细胞(其显示非常有限的生长，主要归因于小的漂浮细胞簇)相比，egh诱导的细胞显示出具有显著和广泛的鹅卵石样生长区域的强烈扩增(图1d)，这是广为人知的非常原始造血祖细胞特征。总cd43+和未成熟cd43+cd34+细胞的绝对计数表明，在扩增的eg-诱导的细胞中，总cd43+细胞仅增加约5倍并且缺乏未成熟cd34+cd43+细胞。相反，在egh诱导的细胞中，总cd43+造血细胞扩增超过30倍，cd43+cd34+未成熟细胞扩增约5倍(图1e)。尽管在eg诱导的细胞中集落形成潜能被严重耗尽，仅检测到少量髓样集落，但在与ms5基质共培养2周后在egh诱导的细胞中检测到多谱系集落形成潜能(图1f)。表4：共培养培养基组分浓度iscove改良dulbecco培养基(imdm)fbs(hyclone)10％glutamax(gibco)1:100单硫代甘油100μmfgf12ng/mligf150ng/mlscf100ng/mlflt3l100ng/mltpo10ng/mlil3(仅在细胞铺板时添加)10ng/ml实施例2-未成熟造血前体的多谱系潜能的增强筛选其他基因以改善psc至未成熟造血祖细胞的正向编程效率。设计筛选模型以检测可与etv2/erg-gata2-hoxa9(egh)互补的另外基因，用于改善未成熟cd43+cd34+和cd43+cd34+cd133+细胞的产生。由于已显示pcmv在未分化的人psc中基本上被抑制并且在分化的细胞如hpc中具有活性表达，因此进行研究以确定cmv启动子的此特征是否可用于在诱导的cd43+细胞中的诱导后基因表达。使用piggybac表达载体将pcmv-egfp和ptight-eg构建体导入表达rttet的人psc中。在dox诱导的造血编程之后监测cd43+细胞中的egfp表达。在未分化/未诱导的ipsc中，直到dox诱导的第8天，在包括诱导的cd43+细胞的约20％的细胞中检测到低egfp表达。相反，在另外4天后(例如第12天)，在超过50％的诱导的cd43+细胞中检测到高egfp表达(图2)。因此，pcmv启动子可用于其他基因的诱导后转基因表达。为了筛选另外的基因，在piggybac表达载体中用ptight-egh(杀稻瘟菌素抗性)和一个额外的ptight-或pcmv-测试基因(遗传霉素抗性)转染表达rttet的psc。egh和测试基因在转染细胞中的共表达通过联合杀稻瘟菌素+遗传霉素选择实现。用egh和测试基因转染的人psc通过dox诱导8天以产生cd43+细胞，然后在2个连续的2周ms5共培养物中进一步扩增(图3b)。对于每个测试基因，计算扩增培养物中全部和原始造血细胞群的产生并表示为内部egh对照的一部分。在egh诱导的原始祖细胞扩增中表现出积极作用的基因的筛选结果显示在图3c中。发现在巨细胞病毒(cmv)启动子驱动的hoxa10(其在第8天后允许转基因表达)对etv2/erg、gata2和hoxa9的添加大大改善了在ms-5基质饲养细胞上两周扩增培养期间诱导的细胞的增殖和cd43+cd34+cd133+细胞的生成(图3a)。接下来，设计筛选模型以检测从egh诱导的细胞中改善淋巴样细胞发育的基因(图4a)。对于t/nk细胞，将用egh和测试基因组合转染的第8天诱导的细胞以5x103个细胞/cm2在t/nk细胞分化培养基(例如，stemspansfem(stemcelltechnologies)(补充有抗坏血酸、磷酸镁(95μm)、glutamax(1/100；gibco)、青霉素/链霉素(1/100；gibco)和细胞因子-scf、flt3l、tpo和il7(各自50ng/ml))中铺板到dll4-fc/纤维连接蛋白包被的平板(各自0.5μg/cm2)中。将培养物维持在低氧(例如5％o2)条件下，每2或3天更换一半的培养基。2周后，将细胞转移到新鲜的dll4-fc/纤维连接蛋白包被的平板上2周。通过流式细胞术分析4周后收获的细胞的cd3+cd8+t细胞和cd3-cd8+nk细胞。对于b细胞，将用egh和测试基因组合转染的第8天诱导的细胞以103个细胞/cm2在b细胞分化培养基(例如补充有fbs(10％，hyclone)、glutamax(1/100，gibco)、青霉素/链霉素(1/100；gibco)、单硫代甘油(100μm)和细胞因子-scf、flt3l、tpo(各50ng/ml)、il7(20ng/ml)和il3(10ng/ml，仅在细胞铺板时添加)的imdm；或例如补充有fbs(10％，hyclone)、glutamax(1/100，gibco)、青霉素/链霉素(1/100；gibco)、抗坏血酸(95μm)和细胞因子-scf和flt3l(各50ng/ml)、il7(20ng/ml，仅在b细胞培养的前2周加入)和il3(10ng/ml，仅在b细胞培养的前1周加入)的dmem-f12)中铺在丝裂霉素c处理的ms5单层上。培养物保持4周，每2或3天更换一半体积的培养基。每次进料新鲜培养基时，用培养基将悬浮的非贴壁细胞悬浮并除去。通过流式细胞仪就cd45+cd19+b细胞分析4周后收集的细胞。发现egh、pcmv-na9hd(nup98-hoxa9同源域融合蛋白)和pcmv-na10(nup98-hoxa10融合蛋白)基因的组合使得能够有效分化成t、nk和b细胞(图4b)。实施例3-造血干细胞编程基因赋予长期植入潜能设计筛选模型以检测可与egh表达载体组合的造血干细胞编程基因，以实现长期造血移植。通过磁激活细胞分选(macs)从第8天dox诱导培养物纯化转染有egh和不同测试基因组合(例如，每个组合多达20个基因)的cd34+细胞(图5a)。对于立即的诱导后注射，将4×106个cd34+细胞以106个细胞/ml铺板在hsc培养基(例如补充有scf、flt3l和tpo(各100ng/ml)的stemspansfem)中的恢复培养物中，18-24小时后回收，并在6-8周龄的nod/scid/il2rg-/c-kitw41(nbsgw)小鼠中静脉内注射。然后将注射的小鼠置于含有含dox的饮食(即625mgdox/kg)的笼中以提供用于体内持续转基因表达7天的dox供应。为了注射适应hsc培养物的细胞，将0.5×106个cd34+细胞以0.2×106个细胞/ml在hsc培养基中铺板在dll4-fc/纤维连接蛋白包被的平板上，并在低氧(例如5％o2)条件下培养7天，在第4天更换一半的培养体积。培养后，将收获的细胞注射入先前在第8天注射cd34+细胞并喂食含有dox的饮食7天的相同小鼠中。注射后，将小鼠转移至不含dox的正常饮食，并在6、12和18周时测试外周血中人造血细胞(即cd45+1类hla+)细胞的存在，并在20-24周时测试骨髓。在注射后12周在nbsgw小鼠的外周血和骨髓中检测到人造血cd45+细胞(图5b)。在注射egh诱导的细胞的小鼠中未检测到人cd45+细胞，而egh与另外的10个编程基因(表1)组合在外周血和骨髓中产生可检测的人cd45+细胞。进行进一步分析用于检测注射后12周nbsgw小鼠的小鼠骨髓和外周血中的cd43/45+细胞。在注射egh诱导的细胞的小鼠中未检测到这些cd43/45+细胞，而egh与其他编程基因的组合导致产生小鼠骨髓中的4.64％cd43/45+细胞(图5c)。接下来，用造血诱导性egh基因(杀稻瘟素选择载体)和用于hsc编程的测试基因的各种组合(g418选择载体)共转染h1-a16-tetesc。转染的esc在杀稻瘟菌素和g418存在下培养2代以选择双转染子(egh+测试基因组合)，然后诱导至cd34+细胞并在nsgw小鼠中测试植入，如图5a所述。通过转基因特异性qpcr分析移植的小鼠骨髓样品中每个测试的转基因的表达，针对通过egh特异性引物检测的总转基因细胞群标准化。将该表达与注射的cd34+细胞中的初始转基因表达进行比较。各植入/注射表达比率显示细胞移植后转基因的富集(正值)或消耗(负值)(图6)。在3个独立移植实验中(使用pcmv表达载体)测试了从初步体外筛选中选择的40个候选hsc编程基因。在细胞注射后超过12周，在移植小鼠的骨髓中总共检测到20个人转基因。如图6所示，与注射的cd34+细胞相比，骨髓中一些转基因的表达水平显著更高或更低，表明可移植细胞的体内选择。然而，无论表达水平如何，所有检测到的人基因都可能有助于骨髓环境中psc衍生的cd34+细胞的迁移、存活和持久性，这是可移植造血干细胞/祖细胞的已知的特征。因此，通过在nbsgw小鼠中使用组合筛选策略(mcintosh等，2015)，鉴定了在骨髓和外周血中赋予人psc衍生的细胞的长期植入的造血干细胞编程基因。***根据本公开内容，可以在没有过度实验的情况下制作和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员来说明显的是，可以在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下对所述方法的步骤或者所述方法的步骤顺序进行变化。更具体地说，明显的是，化学和生理学上相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，而获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。参考文献以下参考文献，就其提供的示例性程序性补充或其他细节补充到本文中阐述的那些的程度，通过引用明确地并入本文。欧洲专利号ep1507865欧洲专利号ep0412700美国专利4,683,202美国专利5,030,015美国专利5,302,523美国专利5,322,783美国专利5,384,253美国专利5,460,964美国专利5,464,765美国专利5,486,359美国专利5,538,877美国专利5,538,880美国专利5,550,318美国专利5,556,954美国专利5,563,055美国专利5,580,859美国专利5,589,466美国专利5,591,616美国专利5,610,042美国专利5,635,387美国专利5,656,610美国专利5,677,136美国专利5,681,599美国专利5,702,932美国专利5,716,827美国专利5,736,396美国专利5,736,524美国专利5,750,397美国专利5,759,793美国专利5,780,448美国专利5,789,215美国专利5,811,094美国专利5,827,735美国专利5,827,740美国专利5,837,539美国专利5,837,670美国专利5,843,780美国专利5,925,565美国专利5,928,906美国专利5,935,819美国专利5,945,100美国专利5,981,274美国专利5,994,136美国专利5,994,624美国专利6,013,516美国专利6,184,038美国专利6,200,806美国专利6,833,269美国专利6,991,897美国专利7,015,037美国专利7,029,913美国专利7,399,632美国专利7,410,773美国专利7,410,798美国专利7,422,736美国专利8,741,648美国专利publn.2002/0055144美国专利publn.2002/0102265美国专利publn.2003/0040038美国专利publn.2003/0082561美国专利publn.2003/0211603美国专利publn.2004/0235175美国专利publn.2007/0072295美国专利publn.2007/0116690美国专利publn.2007/0238170美国专利publn.2008/0260706美国专利publn.2009/0148425美国申请系列08/464,599美国申请系列61/058,858美国申请系列61/172,079美国申请系列61/184,546alexander等人,proc.nat.acad.sci.usa,85:5092-5096,1988.alisonetal,hepatol.,29:678-83,1998.amit等人,dev.bio.,227:271-278,2000.andrews等人,in:teratocarcinomasandembryonicstemcells,robertson(ed.),irlpress,207-246,1987.asoh等人,proc.natl.acad.sci.usa,99(26):17107-12,2002.ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepubl.assoc.inc.&johnwiley&sons,inc.,ma,1996.ausubel等人,in:currentprotocolsinmolecularbiology,john,wiley&sons,inc,newyork,1994.batta等人,cellrep.2014.blomer等人,j.virol.,71(9):6641-6649,1997.boczkowski等人,cancerres.,60:1028-1034,2001.boyer等人,cell,122(6):947-56,2005.buss等人,mol.cell.biol.,8:3960-3963,1988.byrne等人,nature,450(7169):497-502,2007.capecchi,nature,348(6297):109,1990.cassiede等人,j.boneminer.res.,11(9):1264-1273,1996.cermak等人,nucleicacidsres.,39(17):7879,2011.chambers等人,cell,113(5):643-55,2003.chenandokayama,mol.cellbiol.,7(8):2745-2752,1987.chevalier等人,prostaglandinsotherlipidmediat.,70(1-2):31-37,2002.christian等人,genetics,186(2):757-761,2010.currentprotocolsinstemcellbiology,bhatiaet.al.(ed.),johnwileyandsons,inc.,2007.derossi等人,j.bio.chem.,269:10444-10450,1994.derossi等人,j.biol.chem.,271:18188,1996.derossi等人,trendsincellbiol.,8:84-87,1998.doulatov等人,cellstemcell13(4):459-470,2013.durai等人,nucleicacidsres.,33(18):5978-5990,2005.elango等人,biochem.biophys.res.comm.,330:958-966,2005.elcheva等人,natcommun5:4372,2014.elliottando'hare,cell,88:223-234,1997.ercolani等人,j.biol.chem.,263:15335-15341,1988.evans,等人,in:cancerprinciplesandpracticeofoncology,devita等人(eds.),lippincot-raven,ny,1054-1087,1997.fawell等人,proc.natl.acad.sci.usa,91:664-668,1994.fechheimer等人,procnatl.acad.sci.usa,84:8463-8467,1987.fraley等人,proc.natl.acad.sci.usa,76:3348-3352,1979.frankelandpabo,cell,55(6):1189-1193,1988.ghoshandbachhawat,in:liverdiseases,targeteddiagnosisandtherapyusingspecificreceptorsandligands,wu等人(eds.),marceldekker,ny,87-104,1991.gopal,mol.cellbiol.,5:1188-1190,1985.grahamandvandereb,virology,52:456-467,1973.gronthos,blood,84(12):41644173,1994.hancock等人,emboj.,10:4033-4039,1991.harlandandweintraub,j.cellbiol.,101(3):1094-1099,1985.hill等人,exp.hematol.,24(8):936-943,1996.ho等人,cancerres.,61(2):474-7,2001.invitromethodsinpharmaceuticalresearch,academicpress,1997.jaiswal等人,j.cellbiochem.,64(2):295-312,1997.johnstone等人,238(1):265-272,1998.kaeppler等人,plantcellrep.,8:415–418,1990.kaneda等人,science,243:375-378,1989.karin等人cell,36:371-379,1989.katoetal,j.biol.chem.,266:3361-3364,1991.kilic等人,stroke,34:1304-10,2003.kirchmaierandsugden,j.virol.,72(6):4657–4666,1998.kitajima等人,blood,2011.klein等人,nature,327:70-73,1987.kyba等人,cell109(1):29-37,2002.langle-rouault等人,j.virol.,72(7):6181–6185,1998.levitskaya等人,proc.natl.acad.sci.usa,94(23):12616–12621,1997.li等人,nucleicacidsres.,39(14):6315-6325,2011.lindgren等人,trendsinpharmacol.sci.,21:99-103,2000.lindneret.al.,j.virol.,82(12):5693-702,2008.macejakandsarnow,nature,353:90-94,1991.makino等人,j.clin.invest.,103(5):697-705,1999.maniatis,等人,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborpress,coldspringharbor,n.y.,1988.mannandfrankel,emboj.,10:1733-1739,1991.mann等人,cell,33:153-159,1983.mcintosh等人,stemcellreports,2015.miller等人,am.j.clin.oncol.,15(3):216-221,1992.miller等人,nat.biotechnol.,29(2):143-148,2011.minskaiaandryan,biomedresearchinternational,291730,2013.nabel等人,science,244(4910):1342-1344,1989.naldini等人,science,272(5259):263-267,1996.ng,nuc.acidres.,17:601-615,1989.nicolasandrubenstein,in:vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,rodriguezanddenhardt,eds.,stoneham:butterworth,pp.494-513,1988.nicolauandsene,biochim.biophys.acta,721:185-190,1982.nicolau等人,methodsenzymol.,149:157-176,1987.oberlin等人,int.j.dev.biol.sci.,54:1165,2010.paskind等人,virology,67:242-248,1975.pct申请pct/ib2010/000154pct申请wo03/042405pct申请wo03/059940pct申请wo03/059941pct申请wo94/09699pct申请wo95/06128pct申请wo96/39487pct申请wo99/20741pelletierandsonenberg,nature,334:320-325,1988.pereira等人,cellstemcell,2013.pimandaandgottgens,intj.dev.biol.sci.,54:1201,2010.pingoudandsilva,nat.biotechnol.,25(7):743-744,2007.potrykus等人,mol.gen.genet.,199(2):169-177,1985.potten,philos.trans.rsoc.lond.bbiol.sci.,353:821-30,1998.potter等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:7161-7165,1984.quitsche等人,j.biol.chem.,264:9539-9545,1989.reubinoff等人,nat.biotechnol.,18:399b404,2000.richards等人,cell,37:263-272,1984.riddell等人,cell157(3):549-564,2014.rippe等人,mol.cellbiol.,10:689-695,1990.rothbard等人,nat.med.,6(11):1253-7,2000.sambrookandrussell,molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.coldspringharborlab.press,2001.sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,vol.1,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,(7)7:19-17.29,1989.sandler等人,nature511(7509):312-318,2014.schwarze等人,science,285(5433):1466-7,1999.schwarze等人,science,285:1569-1572,1999.seaboe-larssen等人,j.imm.methods,259:191-203.2002.silva等人,curr.genether.,11(1):11-27,2011.smith,in:originsandpropertiesofmouseembryonicstemcells,annu.rev.cell.dev.biol.,2000.suzuki等人molther,2013.takahashiandyamanaka,cell,126:663-676,2006.takahashi等人,cell,126(4):663-76,2007.takahashi等人,cell,131:861-872,2007.tanaka等人,j.immunol.,170(3):1291-8,2003.temin,in:genetransfer,kucherlapati(ed.),ny,plenumpress,149-188,1986.thomsonandmarshall,curr.top.dev.biol.,38:133-165,1998.thomsonandodorico,j.trends.biotechnol.,18:53b57,2000.thomson等人proc.natl.acad.scie.usa,92:7844-7848,1995.thomson等人,science,282:1145,1998.tur-kaspa等人,mol.cellbiol.,6:716-718,1986.vodyanik等人,blood,108:2095,2006.walsh等人,immunity,17:665,2002..watt,philos.trans.r.soc.lond.b.biol.sci.,353:831,1997.weber等人,plosone,6(5):e19722,2011.wender等人,proc.natl.acad.sci.usa,97(24):13003-8,2000.wilson等人,blood,113:5456,2009.wilson等人,mol.cellbiol.,30:3853,2010.wilson等人,science,244:1344-1346,1989.wong等人,gene,10:87-94,1980.wuandwu,biochemistry,27:887-892,1988.wuandwu,j.biol.chem.,262:4429-4432,1987.xu等人,nat.biotechnol.,19:971-974,2001.yangandrussell,proc.natl.acad.sci.usa,87:4144-4148,1990.ying等人,cell,115:281-292,2003.yoo等人,j.bonejointsure.am.,80(12):1745-1757,1998.yuandthompson,genesdev.,22(15):1987-97,2008.yu等人,science,318:1917-1920,2007.yu等人,science,324(5928):797-801,2009.zhang等人,nat.biotechnol.,29(2):149-153,2011.zufferey等人,nat.biotechnol.,15(9):871-875,1997.当前第1页12