本发明涉及通过环介导等温扩增(lamp)检测核酸扩增的方法，以及用于进行本发明方法的一组寡核苷酸和试剂盒。
背景技术：
环介导等温扩增(lamp)是最近开发的经由自动循环链置换反应的核酸扩增方法，其通常在60℃至65℃的恒定温度下进行(notomit.etal2000.nucleicacidsres.vol.28(12)-e63)。这种技术采用具有链置换活性的dna聚合酶和一组四个寡核苷酸，称为内部和外部引物，其专门设计为识别靶核酸上的六个不同的识别位点。两个外部引物仅在非循环步骤期间在链置换中发挥作用，而内部引物同时包括正义和反义序列并帮助形成具有茎环结构的典型lamp扩增产物。
除了四种寡核苷酸引物之外，lamp测定还可以涉及使用两种另外的引物，即所谓的环引物，以提高扩增效率，由此得到每个靶序列共六个引物。跨越靶核酸上的八个不同序列的不同引物的这种组合提供了显著程度的测定特异性。
基于lamp的技术具有灵敏度高，扩增快和操作简单的优点。lamp测定导致扩增产物的高效合成，其比相同体积中通过经典pcr反应获得的高至少50倍。另外，在等温条件下扩增核酸的能力使得能够使用简单且有成本效益的设备，而不需要热循环。在lamp测定中，特异性扩增子的扩增和检测可以在一个步骤中完成，从而与标准rt-pcr相比显著减少了反应时间。
已经采用了几种方法检测lamp扩增产物，包括沉淀的焦磷酸镁的目测或浊度监测(tomitan.,etal.2008.nat.protoc.3:877-882；moriy.,etal.2001.biochem.biophys.res.commun.289:150-154)，采用插入荧光团的双链dna(dsdna)的荧光检测(zhangx,etal.2013,plosone8(12):e82841；mairg.etal.2013,bmcveterinaryresearch9:108.)，通过焦磷酸盐转化报道的生物发光(gandelmanoa.,etal.2010,plosone5(11):e14155)。
用于间接检测lamp扩增的已知策略主要依赖于作为反应副产物的焦磷酸盐的形成。随着lamp反应进行，焦磷酸根离子通过在核酸聚合期间脱氧核苷酸三磷酸(dntp)引入dna链中而释放，而这些离子与存在于反应混合物中的二价金属离子，特别是镁离子反应而产生白色不溶性焦磷酸镁沉淀(moriy.,etal.2001.biochem.biophys.res.commun.289:150-154)。这种产物导致反应溶液的浊度逐渐增加，并且焦磷酸盐沉淀物可以在浊度方面定量测量，或通过离心后通过肉眼观察为颗粒。在可选的方式中，lamp扩增的检测通过在反应中引入锰离子和钙黄绿素实现。钙黄绿素的荧光通过结合锰离子而自然淬灭。作为lamp反应的副产物的焦磷酸盐生成通过沉淀从缓冲液中去除锰离子，而与恢复的钙黄绿素荧光相关联的浊度增加使得能够在用可见光或uv光激发时容易地目视读取(tomitan.,etal.2008.nat.protoc.3:877-882)。在又一种检测方式中，通过由热稳定的萤火虫荧光素酶产生的生物发光监测在dna合成期间产生的焦磷酸向atp中的酶促转化(gandelmanoa.,etal.2010,plosone5(11):e14155)。
lamp扩增产物也可以通过经由荧光报告(fluorescencereporting)作用的直接方法检测。大多数此类方法是基于嵌入染料如溴化乙锭，sybrgreen，evagreen和yo-pro-i的使用(zhangx,etal.2013,plosone8(12):e82841；mairg.etal.2013,bmcveterinaryresearch9:108)。通常，嵌入染料是非序列特异性的荧光染料，其在结合到dsdna中时显示出荧光发射的大幅增加。通过连续测量lamp反应期间的荧光，可以利用这种性质实时监测核酸扩增。然而，由于嵌入染料会结合到任何dsdna，在实时扩增方法中实施这种染料不能允许区分特异性靶扩增产物和共同产生的人工产物(artifact)，如非特异性扩增子和引物二聚体，这可能导致靶浓度的高估。因此，通过嵌入染料检测核酸扩增需要广泛的优化，且通常需要后续测定以验证结果。
lamp扩增的基于荧光的检测还可以依赖于福斯特
chou等人(chouph,etal.2011jvirolmethods.173(1):67-74)描述了一种诊断虾中的白斑综合症病毒(wssv)感染的测定，其组合了lamp和fret杂交探针技术。更具体地，除了包括所谓的环引物的标准lamp引物组以外，chou等人的测定涉及分别在3'-和5'-末端序列标记的两个荧光探针的使用(图1a)，其以头至尾构型与存在于中间lamp产物中的单链环区杂交。通过使两个荧光团邻近，发生能量转移并在等温扩增反应期间产生实时fret信号。图1a示出了lamp中间产物，其中放大一个环末端以详细显示fret测定检测步骤中使用的寡核苷酸的杂交。
在基于荧光能量转移的检测方法中，杂交诱导的荧光淬灭，特别是通过鸟嘌呤淬灭的原理，也利用于lamp应用中(zerillietal.2010.clinchem56:1287-96)。在这种方法中，由5'标记的lamp环引物发射的荧光在与含有鸟嘌呤的互补靶序列杂交后逐渐淬灭。淬灭效应的程度取决于互补靶序列上相邻g碱基的数目和位置。随着靶序列在实时lamp测定中累积，核酸扩增的定量测量通过监测作为在扩增产物中引入染料标记的环引物的结果的淬灭荧光的量而实现。然而，这种策略具有依赖于靶核酸的特异性核苷酸序列的缺点，并且受限于这种序列内鸟嘌呤核苷酸的存在和/或位置。
近年来，大量努力致力于将等温方法如lamp用于分子诊断测定，利用不需要温度循环的简化测试设备并允许生产用于相当基础的卫生保健环境的版本。随着等温技术被采用作为诊断工具，这种技术的基本要求是它们在很短的时间内产生患者结果的能力，以为患者护理的每个阶段的临床决策提供可靠和快速的帮助，即早期诊断，风险评估，筛查，分期和预后，治疗选择和监测。例如，急性白血病等血液恶性肿瘤的早期诊断对于确保患者预后良好是重要的，因为及时治疗对于疾病管理可以是重要和决定性的。
因此，本领域需要开发能够实现靶核酸序列的快速检测而不影响关键测定参数如特异性，灵敏度和精度的环介导的等温扩增方法。通过所附权利要求中定义的方法，寡核苷酸和试剂盒组可以满足这个和其他需要，这些构成了说明书的组成部分。
技术实现要素：
如以下实验部分进一步说明，本发明提供了利用荧光能量转移的原理检测靶核酸序列的lamp扩增的方法，可选地包括检测靶核酸序列中的突变。本发明的方法采用了具有链置换活性的dna聚合酶和一组由两个外部引物即f3和b3，两个内部引物即fip和bip，一个或两个环引物即lf和/或lb以及一个核酸探针组成的寡核苷酸lamp引物。lamp引物和环引物的特征和功能的描述可以在例如eiken网站找到(loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.html；loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/loop.html)。
根据本发明，第一内部引物fip由标号为f2的3'核酸序列(其与靶核酸序列的f2c、区域互补)和标号为f1c的5'核酸序列组成。第二内部引物bip由标号为b2的3'核酸序列(其与靶核酸序列的b2c区域互补)和标号为b1c的5'核酸序列组成。f2c和b2c区域是位于靶核酸序列的相反链上的非重叠区域。
外部引物f3包含在与f3c区域互补的f3区域中；外部引物b3包含在与b3c区域互补的b3区域中。如上所述，本发明的方法采用了一种或两种环引物，即环引物b和/或环引物f(在下文中分别称为“lf环引物”和“lb环引物”)，它们含有与位于b1和b2区域之间或位于f1和f2区域之间的单链环区互补的序列。
通常，当用于lamp反应时，环引物与中间lamp产物杂交并为dna合成提供增加数量的起始点。根据本发明，lf环引物或lb环引物如果存在，在其5'-末端用至少一个受体荧光团标记。
与标准lamp技术相比，本发明的方法涉及使用另外的寡核苷酸，更具体地是核酸探针，其在3'-末端用至少一个供体荧光团标记。所述核酸探针能够在标记的lf或lb引物的5'的位置与靶核酸序列杂交，使得与靶核酸序列杂交时，核酸探针的3'-末端紧邻标记的lf或lb环引物的5'-末端。
在本说明书中，能够与给定靶核酸序列杂交的核酸序列(引物或探针)是例如与所述核酸序列互补的。
应该注意的是，当环引物被引入并延伸到lamp扩增产物中时，所述标记的环引物和所述标记的核酸探针的“紧邻”仅在lamp反应的扩增阶段发生。
如图1b中所示，根据本发明的方法采用了在其5'-末端标记有至少一个受体荧光团的环引物，结合一个在其3'-末端标记有至少一个供体荧光团的核酸探针。图1b示出了lamp中间产物，其中放大一个环末端以详细显示fret分析检测步骤中采用的寡核苷酸的杂交。
标记的环引物可以是lf或lb中的任一种(当lb存在时)。根据本发明，在所述寡核苷酸在lamp反应期间与靶核酸序列杂交时，核酸探针3'-末端的供体荧光团会紧邻lf或lb环引物的5'-末端的受体荧光团。在这种荧光团之间发生荧光能量转移，例如，位于核酸探针的3'-末端的供体荧光团将激发能量转移到位于lf或lb环引物的5'-末端的受体荧光团上。因此，产生受体荧光团的荧光发射强度的增加并被检测到。这种增加是dna扩增的指示，因为其在lamp扩增产物中引入标记的环引物和随后引物延伸时产生。
本发明的方法的性能由本发明人与现有技术的基于荧光的lamp测定，更具体而言由chou等人描述的基于fret的lamp测定，以及利用了嵌入染料的lamp系统比较而评价。
为了比较本发明的lamp方法和chou等人的测定的性能，使用了稀释设计，并将范围为2×101个拷贝/μl至2×106个拷贝/μl的含wssv基因组片段的变性质粒的滴定系列在rotor-geneq仪器(qiagen)上进行lamp扩增。具体地，分别对对应于2×103个拷贝/μl和2×106个拷贝/μl的稀释液进行比较测定。靶的扩增产生了具有s形的渐增荧光信号，其通过以1分钟的步长设置读数而检测到。
通过使用rotor-gene软件产生归一化信号，并通过将荧光阈值设定为0.2，对应于约50％的荧光增量，确定阈值时间(分钟)以检测靶的扩增。
这些稀释样品通过在检验下的每种lamp方法产生的阈值时间的比较分析表明，与chou等人的方法相比，本发明的方法实现了靶核酸序列的显著更早的检测(图2中所示)。
此外，通过进行学生t-检验计算在检验下的lamp方法之间测量的检测时间的差异的统计学显著性，其给出低于0.05的p值。
为了进一步评价本发明的方法检测天然基质中靶核酸的能力，将上述实验程序应用于人类基因组dna(20ng/μl)中的wssv质粒(2×103拷贝/μl和2×106拷贝/μl)同样的稀释物。在这种稀释物上进行的lamp扩增反应表明，这种可能引起干扰的基因组dna材料的存在确实在通过两种方法对靶核酸序列检测中产生了延迟。此外，通过本发明的方法在比由chou等人的lamp系统实现的检测早10分钟或更多的时间完成了靶检测。
在测定验证中，线性代表测定准确度最相关的指标之一，因为其测量程序返回与测试样品中靶分析物浓度成正比的值的能力。在本研究中，将通过应用本发明的方法或chou等人的方法对上述样品滴定系列获得的lamp扩增数据进行线性回归分析。
在图3中，对于(a)本发明的lamp方法和(b)chou等人的lamp测定二者，将阈值时间(以分钟表示)相对于质粒核酸靶的浓度(以拷贝数/μl表示)作图。该图表明本发明的方法提供了优良的线性，因为对于回归线计算的相关系数(r2)＝0.99，斜率＝-7.2。此外，确定这种良好的线性也是测定精度的指示，因为这意味着重复测量之间的高度重现性。
本发明人通过比较本发明的方法的性能与涉及使用嵌入染料进行荧光检测的lamp测定而进行进一步评价。对通过对含有myh11基因的10倍连续稀释的质粒dna样品实施本发明的方法或基于嵌入染料的测定所获得的lamp扩增数据应用线性回归分析。图4中显示了线性回归分析的结果。该图显示了对于(a)本发明的lamp方法和(b)嵌入染料测定，阈值时间(以分钟表示)相对质粒核酸靶标浓度(以拷贝数/μl表示)的绘图。获得的数据证实了本发明方法与使用yo-pro嵌入染料的lamp系统相比的显著更高的线性(r2＝0.97相对r2＝0.80)。
连同更好的测定线性一起，对于本发明的方法观察到更高的分析灵敏度和更宽的线性范围。最后，与基于嵌入染料的lamp相比，采用标记的环引物/探针fret对的本发明方法导致测定的特异性增强，因为嵌入染料如yo-pro在结合至任何双链dna时都会发射荧光信号，与特异性核苷酸序列无关。
在本发明的方法中，靶核酸序列的扩增会导致荧光参数的可检测的变化，即当在核酸探针的3'-末端的供体荧光团和lf或lb环引物的5'-末端处的受体荧光团之间发生能量转移时受体荧光强度的增加。
应该理解的是，还可以评价受供体和受体荧光团的接近度以及由此受受体荧光发射的影响的其他荧光参数，包括，例如，供体和/或受体荧光强度或荧光寿命的比率。
如上概述，通过fret受体荧光团接受供体激发能量需要所述分子之间的紧密接近，并且fret的效率对供体和受体之间的距离和相对取向非常敏感。根据本发明的方法，在与靶核酸序列杂交时，核酸探针的标记的3'-末端与环引物的标记的5'-末端之间的距离应该优选为0至6个核苷酸，例如，0，1，2，3，4，5或6个核苷酸。
根据本发明，核酸探针包含与其3'-末端连接的至少一个供体荧光团。这种供体荧光团作用为dna合成的阻断剂，因为其使得核酸探针的3'-末端不再可以用作dna聚合的起点。
相反，在本发明中，由标记的环引物携带的受体荧光团与寡核苷酸的5'-末端连接，以避免在lamp反应期间对dna合成的任何干扰。具体地，根据本发明的标记的环引物具有3'-游离羟基基团，其用作互补dna链的合成的起点。
由于靶标检测是通过特异性寡核苷酸上连接的信号组分直接实现的，本发明的方法提供了序列特异性检测技术。根据本发明，标记的核酸探针和/或标记的环引物设计为耐受用于检测各种dna或rna序列的序列变异或区分序列多态性。另外，应理解的是，核酸探针或环引物与其在靶核酸上的各自互补序列的杂交可以通过在此类寡核苷酸中引入特定类型的改性核苷酸，例如2'-o-甲基核糖核苷酸或基于硝基吡咯的核苷酸，或具有非天然骨架的某些类型的核酸类似物，例如pna(肽核酸)或lna(锁核酸)而增强。核酸类似物在核酸扩增方法中的使用已经充分确立而是本领域技术人员熟知的。
在本发明的上下文中，术语“靶核酸序列”是指待扩增和检测的核酸序列。这还包括待扩增的核酸序列的互补第二链和通过扩增产生的核酸序列的拷贝的任一链。靶核酸可以源自多种来源。例如，如本领域已知的，靶核酸可以是从任何来源分离出的天然dna或rna，重组分子，cdna或合成类似物。在一些实施方式中，靶核酸序列可包含一个或多个单核苷酸多态性(snp)，等位基因变体和其他突变，如缺失突变，插入突变，点突变。在其他实施方式中，靶核酸序列可以包含可以与癌症相关的融合基因的接合序列。在又一个实施方式中，靶核酸序列可以源自微生物，包括可能参与诱导人类和动物疾病的特异性克隆体或微生物菌株。
本发明的方法也适用于定量检测样品中靶核酸序列的量。在本发明的优选实施方式中，靶核酸序列的定量经由通过绘制这种靶核酸序列的已知拷贝数(或浓度)相对于阳性的lamp测定时间的图表而产生标准曲线完成。测试样品中未知靶拷贝数(或浓度)的定量可以基于未知样品中测定的到阳性的时间由标准曲线推断。
本发明的另一方面是用于检测靶核酸序列的环介导等温扩增(lamp)的一组寡核苷酸，该组由第一外部引物f3，第二外部引物b3，第一内部引物fip，第二内部引物bip，第一环引物lf，第二环引物lb和一个核酸探针组成，所有这些都参照本发明的方法如以上定义。
lf环引物或lb环引物中的任一个(当lb存在时)在其5'-末端用至少一个受体荧光团标记，而核酸探针在其3'-末端用至少一个供体荧光团标记。
发生福斯特共振能量转移的要求是供体荧光团的发射光谱与受体荧光团的吸收光谱重叠，使得激发能量转移到受体荧光团之后由供体荧光团的较低波长光激发。
有许多分子可以用作本发明中的供体或受体荧光团。
根据优选的实施方式，供体荧光团选自由荧光素，bodipyfl，alexa555，atto550，cy3，fam，tet，hex，joe，vic，cy3，ned，quasar570，oyster556，tamra组成的组，和/或受体荧光团选自由cy5.5，cy5，atto647n，alexa647，rox，lc红610，德克萨斯红，lc红640，lc红670，quasar670，oyster645，lc红705组成的组。
特别优选的是供体/受体对bodipyfl/atto647n。
在又一个实施方式中，核酸探针和/或环引物用多于一个荧光团，优选两个荧光团标记。
在最优选的实施方式中，fret供体/受体对分别由两个bodipyfl荧光团和一个atto647n荧光团组成。适用于本发明的合适的供体/受体荧光团对的选择完全在本领域技术人员的知识范围内。
如上所述，本发明的进一步的方面是用于检测靶核酸序列的环介导等温扩增(lamp)的试剂盒，试剂盒包含如上定义的一组寡核苷酸，以及一种或多种具有链置换活性的dna聚合酶。dna聚合酶优选选自由bst大片段聚合酶，bst2.0，bst3.0，bca(exo-)，vent，vent(外)，deepvent，deepvent(外)，φ29噬菌体，ms-2噬菌体，z-taq，kod，klenow片段，gspssd，gspf，omniamp聚合酶，sd聚合酶及它们的任何组合组成的组。最优选的dna聚合酶是bst大片段聚合酶。
以下实验部分纯粹以举例说明的方式提供，并不旨在限制如所附权利要求中限定的本发明的范围。
具体实施方式
实验部分
实施例1—本发明的lamp方法与chou等人的lamp测定的对比。
样品制备
为了比较本发明的lamp方法和chou等人描述的lamp测定，制备合适的靶核酸序列。简而言之，通过使用sfii/sfii限制位点组合而将源自白斑综合症病毒(wssv)基因组(nt226681-227934，genbankaf332093.1)的350-bpdna片段克隆到pma-t载体(geneart)而提供阳性对照。对重组wssv质粒制备了2×106个拷贝/μl至2×101个拷贝/μl的10倍稀释液系列。
制备两种不同的质粒稀释系列，用作单独的tris-hcl10mm，ph8.5，或另外含有人基因组dna(20ng/μl)的这种缓冲液。在本研究中，将分析的质粒稀释液在100℃下变性10分钟。变性后，将质粒样品立即置于冰上10分钟。
lamp反应
如chou等人描述的设计用于比较分析的lamp寡核苷酸引物和探针，并列于以下表1中。
表1
表1包含由chou等人在测定中使用的全组寡核苷酸。对于以下特征，根据本发明的lamp方法中使用的寡核苷酸的组不同于chou等人设定的寡核苷酸：
1)其含有一个单核酸探针，即lcf，在其3'-末端用荧光素标记；
2)其不包含任何环引物环b，且后者用lcq引物取代，lcq引物在其5'-末端用荧光部分lc640标记。鉴于上述情况，chou等人的方法通过标记的供体探针和标记的受体探针之间的fret机制提供了荧光放大信号的产生。相反，在根据本发明的方法中，受体寡核苷酸的功能通过之前标记的环引物中的一个进行，由此减少了lamp反应中使用的寡核苷酸数量。此外，本发明的方法克服了与chou等人的测定相关的缺点，即在所述测定中使用的fret探针可能会与用于结合至相同靶核苷酸序列的环引物竞争。
在本研究中，以下引物浓度用于lamp反应：0.375μm外部引物(f3和b3)，2μm内部引物(fip和bip)，1.1μm环引物环f，0.3μm环引物环b(仅存在于根据chou等人的反应中)，0.25μmlcf和lcq。
lamp反应在20μl混合物中进行，混合物含有：0.375mmdntps，2.4u的bstdna聚合酶大片段(newenglandbiolabs，beverly，ma，usa)，1×反应缓冲液(20mmhepes缓冲液，ph7.9，20mmkcl，3mmmgcl2和0.1％tritonx100)。
反应混合物在rotor-geneq仪器(qiagen)上在60℃下培养120分钟。然后将扩增产物保持于4℃下。
通过分析反应期间产生的归一化荧光信号而检测重组wssv质粒的lamp扩增。阈值时间通过将荧光阈值设定于0.2(对应于荧光增量的约50％)而确定。
数据分析和归一化
使用microsoftexcel中的统计软件包进行数据分析。使用相同的软件包用于线性回归分析。
通过rotor-genepuredetectionv2.1软件获得数据归一化。
实施例2—本发明的lamp方法与基于嵌入染料的lamp测定的比较。
样品制备
为了将本发明的方法的性能与涉及使用嵌入染料的lamp测定相比较，制备了合适的靶核酸序列。简言之，通过使用sfii/sfii限制位点组合将源自myh11基因(genbankd10667.1)的350-bpdna片段克隆到pma-t载体(geneart)中而提供阳性对照。
将重组myh11质粒在缓冲液tris-hcl10mm，ph8.5中连续稀释10倍，从约2×106个拷贝/μl至2×101个拷贝/μl。
在本研究中，将测定的质粒稀释液在100℃变性10min。变性后，将质粒样品立即置于冰上10分钟。
lamp反应
在以下表2中列出了用于比较分析的lamp寡核苷酸引物和探针。
表2
在根据本发明的方法的lamp反应中，使用了以下的寡核苷酸浓度：0.05μm外部引物(f3和b3)，0.4μm内部引物(fip和bip)，0.2μm受体lb环引物和0.2μm供体fret探针。相反，除了上述的外部和内部引物之外，用于基于嵌入染料的lamp测定中的寡核苷酸组仅包括未标记形式的lb环引物。
lamp反应在25μl混合物中进行，混合物包含：1.4mmdntp，8u的bstdna聚合酶大片段(newenglandbiolabs，beverly，ma，usa)，8mmmgcl2，1×反应缓冲液(30mmtris-hcl，ph8.0，30mmkcl和0.1％tritonx100)。
对于基于嵌入染料的lamp测定设定的反应混合物进一步包括浓度为1μm的yo-pro嵌入染料(lifetechnologies)。
lamp扩增反应在rotor-geneq仪器(qiagen)上在65℃下进行40分钟。然后，将扩增产物保持于4℃。
通过分析反应期间产生的归一化荧光信号而检测重组myh11质粒的lamp扩增。阈值时间通过将荧光阈值设定为0.2(对应于荧光增量的约50％)而确定。
数据分析和归一化
使用microsoftexcel中的统计软件包进行数据分析。使用相同的软件包用于线性回归分析。
通过rotor-genepuredetectionv2.1软件获得数据归一化。