本发明涉及寡核苷酸和使用寡核苷酸治疗免疫介导的病症的治疗药物(remedy)。免疫介导的病症包括自身免疫性疾病、移植物排斥、超敏反应、与自身抗原、微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病、toll样受体(tlr)介导的疾病、nf-kb介导的疾病、干扰素介导的疾病和炎性细胞因子介导的炎性疾病。
背景技术：
免疫系统保护人体免受细菌、寄生虫、真菌、病毒感染侵害和免于生长肿瘤细胞。免疫可分为固有免疫和适应性免疫。固有免疫应答通常在感染后立即发生，提供针对传染性疾病的早期屏障，而适应性免疫应答随后产生抗原特异性长期保护性免疫。
然而，有时会发生不需要的免疫应答，这可能导致免疫介导的病症。这些病症包括自身免疫性疾病、移植物排斥、超敏反应、与微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病、toll样受体(tlr)介导的疾病、干扰素介导的疾病、nf-kb介导的疾病和炎性细胞因子介导的炎性疾病。自身免疫性疾病是由针对内源性和/或外源性抗原的适应性免疫应答、固有免疫应答或两者引起的。源自细菌、寄生虫、真菌或病毒的外来物质可能模拟自身蛋白质并刺激免疫系统对自体细胞和组织产生应答，导致疾病包括但不限于系统性红斑狼疮(sle)和类风湿关节炎。移植物(graft)排斥是移植物(transplant)受体(宿主)对移植器官/组织的免疫应答引起器官或组织移植的结果。当受试者移植包括肾、胰腺、心脏、肺、骨髓、角膜和皮肤的移植物时，受试者能够产生针对移植物的免疫应答(排斥)。超敏反应是一种具有有害作用的不恰当的免疫应答，其导致显著的组织损伤或者甚至死亡。超敏反应分为四种类型(例如i、ii、iii和iv型)。与微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病是由病毒如流感病毒和其他微生物的感染触发的。在流感病毒和革兰氏阴性细菌感染的情况下，对侵略者的过度免疫应答似乎是患者的致命因素。应答的特征是细胞因子的过度产生。脓毒性休克综合征的研究表明，由于细胞因子介导的致死性休克，细胞因子的过度产生/异常产生可导致快速死亡(slifkaetal.,jmolmed.2000,78,74-80)。革兰氏阴性感染后脓毒性休克是危重患者死亡率的最主要的原因。已知细胞因子的夸张的产生促进以细胞因子介导的致死性休克为特征的败血症(espatetal.,jsurgres,1995,59,153-8)。多器官功能障碍综合征(mods)是严重脓毒症和休克中发病率和死亡率的主要原因。过度产生宿主细胞因子导致的细胞因子介导的致死性休克被认为是导致mods的主要机制(wangetal.,amjemergmed,2008,26,711-5)。toll样受体(tlr)介导的疾病是由toll样受体(tlr)激活引起的病症。
tlr是识别微生物衍生分子结构(病原体相关分子模式或pamp)的受体家族。表达tlr的免疫细胞在结合pamp时被激活。tlr识别一系列病原体衍生产物并被激活。细菌的脂多糖(lps)被tlr4识别；脂磷壁酸和二酰化脂肽，被tlr2-tlr6二聚体识别；三酰化脂肽，被tlr2-tlr1二聚体识别；合成或衍生自病毒或细菌的含cpg的寡核苷酸(cpgodn)，被tlr9识别；细菌鞭毛蛋白，被tlr5识别；酵母聚糖，被tlr2-tlr6二聚体识别；来自呼吸道合胞病毒(rsv)的f蛋白，被tlr4识别；病毒衍生的双链rna(dsrna)和多i:c，dsrna的合成类似物，被tlr3识别；病毒dna，被tlr9识别；单链病毒rna(vsv和流感病毒)和合成鸟苷类似物例如咪唑喹啉和咪喹莫特，被tlr7和tlr8识别(liewetal.,naturereviewsimmunology,2005,5,446-458)。
近年来，tlr激活与一些疾病的发病机理相关，所述疾病包括脓毒症、扩张型心肌病、糖尿病、实验性自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病和器官衰竭(liewetal.,naturereviewimmunology,2005,5,446-458)。自身dna对tlr9的激活在自身免疫性疾病的发展中起重要作用，所述自身免疫性疾病例如银屑病(gillietetal.,nat.rev.immunol.2008,8,594-606)、sle(christensenetal.,immunity,2006,25,417-28；barrat,etal.,jexpmed,2005,202,1131-9；wellmann,etal.,procnatlacadsciusa,2005,102,9258-63)和类风湿性关节炎(leadbetteretal.,nature,2002,416,603-7；bouleetal.,jexpmed,2004,199,1631-40)。还记载了tlr9激动剂激活固有和适应性免疫应答(krieg,naturereviewsdrugdiscovery,2006,5,471-484)。
据报道，具有5’-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’核苷酸序列的寡核苷酸阻止由tlr9激动剂诱导的人外周血单核细胞(pbmc)的增殖和干扰素(ifn)的产生(us8030289b2)。还记录了由核苷酸序列(cct)ncm显示的寡核苷酸，其中n为2至50的整数并且m为0、1或2，具有tlr7、8和9抑制性质，其抑制nf-kb依赖性免疫应答以及炎性细胞因子例如ifna和肿瘤坏死因子α(tnfa)的产生(ep2154144，wo2014/082254)，这意味着广泛使用寡核苷酸(cct)ncm来治疗免疫介导的病症。
通常已经报道过在主链中具有普通磷酸二酯键合的寡核苷酸在体内对核酸酶例如血清外切核酸酶或细胞内核酸内切酶的易感性(steinetal.,nucacidres,1988,16,3209-3221)，导致差的药代动力学谱。为了解决这样的问题，已经采取了一些策略以用包括硫代磷酸酯化在内的耐核酸酶结构来修饰主链。同时，硫代磷酸酯化反应被众所周知地描述为具有强烈的肝脏和肾脏毒性(henryetal.,toxicolpathol,1999,28,95-100；monteithetal.,toxicolpathol,1999,27,307-317)，其阻碍了使用硫代磷酸酯化寡核苷酸治疗全身性疾病。因此，已经进行了一些降低毒性的试验，例如核苷酸序列的改变(hagedornetal.,nucacidther,2013,23,302-310,burdicketal.,nucacidres,2014,42,4882-4891)。然而，关于本发明中描述为cxty(cct)ncm的寡核苷酸，由于寡核苷酸的效力完全取决于独特的核苷酸序列，因此不能进行上述用于改变核苷酸序列的策略。
引文列表
专利文献
ptl1：us8030289b2
ptl2：ep2154144
ptl3：wo2014/082254
ptl4：jp5011520
非专利文献
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发明概述
技术问题
本发明旨在提供更安全的药物组合物并允许增加所述药物组合物的给药方案，同时增加针对靶向疾病的功效。
本发明提供了无毒的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸包含具有式cxty(cct)ncm的寡核苷酸链段，其通过在核苷酸间键中用硫原子取代一个或多个非桥氧而部分硫代磷酸酯化，其中n是2至50、或优选5至16的整数，x表示整数0或1，y表示整数0(仅当x＝0时)或1(x可以是0或1)，并且m是0、1或2。
在本发明中，本发明人鉴定了一些具有部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸实现了毒性的降低，同时维持了血清中的稳定性，这使得更安全的药物组合物制剂成为可能；同时，寡核苷酸的安全谱允许增加每种所述寡核苷酸的给药水平，这将导致治疗接受治疗的人或非人动物中靶向疾病的功效增加。
附图简要说明
[图1]图1a显示部分硫代磷酸酯化(cct)12寡核苷酸物质在含有血清的培养基中的稳定性。在补充有血清的培养基中孵育寡核苷酸并且定量在培养基中剩下的寡核苷酸。如图所示，具有正常磷酸二酯核苷酸间键的cct12po在1天孵育后显示几乎完全降解，而完全硫代磷酸酯化的cct12ps显示更长的持续时间，这表明寡核苷酸在没有核苷酸间修饰的情况下快速降解。同时，部分硫代磷酸酯化的cct12-3(详见实施例部分)显示与cct12ps具有可比较的稳定性，其表明至少某些水平的核苷酸间键的硫代磷酸酯化足以实现抗血清中核酸酶的稳定性。图1b显示部分硫代磷酸酯化(tcc)12寡核苷酸物质在含有血清的培养基中的稳定性。结果表明虽然没有硫代磷酸酯化的寡核苷酸(tcc12po)在1天孵育后显示出快速降解，而部分硫代磷酸酯化寡核苷酸(tcc12-6)显示出与具有相同序列的完全硫代磷酸酯化物质(tcc12ps)一样的增加的稳定性。
[图2]图2揭示了通过某些模式的降低的硫代磷酸酯化水平降低寡核苷酸的毒性。图2a显示了通过降低硫代磷酸酯化水平降低(cct)12的毒性。如这里所示，即使具有相同序列的寡核苷酸cct12ps显示出与另一种完全硫代磷酸酯化寡核苷酸cct8ps的情况相同的强毒性，cct12-1也没有表现出明显的体重减轻。图2b显示了寡核苷酸cct12-2、cct12-3、cct12-4和cct12-5之间的比较，这意味着毒性的降低不仅通过降低硫代磷酸酯化水平而实现，而且与硫代磷酸酯化模式相关。图2c显示通过硫代磷酸酯化模式的改变来降低毒性也适用于(tcc)重复。tcc12-6显示毒性降低，而具有相同硫代磷酸酯化水平的tcc12-7仍具有显著的毒性。图2d和2e显示了显示出强烈毒性的寡核苷酸也发生alt的提高。
[图3]图3a显示了部分硫代磷酸酯化寡核苷酸对nf-kb转录活性的抑制作用。尽管cct12-1、cct12-2和cct12-3显示出降低的毒性，但它们仍保留抑制活性。图3b和c显示通过硫代磷酸酯化模式的改变引起的毒性降低不会影响寡核苷酸的抑制活性，如寡核苷酸cct12-3和tcc12-6所示。
[图4]图4a、b和c显示了描绘抑制性寡核苷酸对来自用tlr7/8激动剂嘎德莫特或tlr9激动剂cpg2395刺激的cal-1细胞的tnfa和白介素(il)-6产生的抑制能力的图。降低毒性的硫代磷酸酯化模式改变对针对tlr7、8或tlr9激活的抑制作用没有显著影响。
[图5]图5a和b显示了描绘抑制性寡核苷酸对来自用cpg2216刺激的人pbmc的ifna产生的抑制活性的图。这些图(5a和5b)还揭示了硫代磷酸酯化模式改变不显著影响寡核苷酸针对由tlr9激动剂诱导的ifna产生水平的抑制活性。
具体实施方式
本发明提供了含有一种寡核苷酸或多种寡核苷酸的药物组合物，所述寡核苷酸包含具有式cxty(cct)ncm的寡核苷酸，其中n是2至50、或优选5至16的整数，x表示整数0或1，y表示整数0(仅当x＝0时)或1(x可以是0或1)，并且m是0、1或2。寡核苷酸序列的实例如下：
5'-cctcctcctcctcctcct-3’(seqidno:1)。
5'-cctcctcctcctcctcctcct-3’(seqidno:2)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’(seqidno:3)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctc-3’(seqidno:4)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcc-3’(seqidno:5)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’(seqidno:6)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctc-3’(seqidno:7)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3’(seqidno:8)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’(seqidno:9)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctc-3’(seqidno:10)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3’(seqidno:11)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’(seqidno:12)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctc-3’(seqidno:13)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3’(seqidno:14)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’(seqidno:15)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’(seqidno:16)。
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’(seqidno:17)。
5'-tcctcctcctcctcctcc-3’(seqidno:18)。
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3’(seqidno:19)。
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3’(seqidno:20)。
其中本发明的寡核苷酸能够基于与具有相同序列的完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸相比降低的毒性通过核苷酸间键中化学修饰模式的排列来进行筛选；化学修饰任选地是硫代磷酸酯化。
优选地，本发明提供具有部分硫代磷酸酯化的寡脱氧核苷酸，其用s以某种模式替换非桥连o原子，导致维持寡核苷酸的活性和体内稳定性，同时导致施用于动物时毒性最小。具有降低的毒性的本发明的所述寡脱氧核苷酸的实例包含通过正常磷酸二酯键连接的完全硫代磷酸酯化的cctcctcct、ctcctcctc或tcctcctcc或其截短的衍生物的链段。所述寡核苷酸包括以下：
5'-cctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:21),
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:22),
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:23),
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:24),
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:25)
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:26),
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:27)
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:28),
5'-ctcctcctcctcctcctc-3'(seqidno.:29),
5'-ctcctcctcctcctcctcctcctcctc-3'(seqidno.:30),
5'-ctcctcctcctcctcctcctcctcctc-3'(seqidno.:31),
5'-ctcctcctcctcctcctcctcctcctc-3'(seqidno.:32),
5'-ctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctc-3'(seqidno.:33),
5'-ctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctc-3'(seqidno.:34),
5'-ctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctc-3'(seqidno.:35),
5'-tcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:36),
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:37),
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:38),
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:39),
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:40),
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:41),
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:42),
其中大写字母表示碱基在3'处在磷酸二酯核苷酸间键中经硫代磷酸酯修饰，小写字母表示碱基未经修饰的碱基。包含完全硫代磷酸酯化的cctcctcct、ctcctcctc或tcctcctcc或其截短衍生物的链段的寡核苷酸的共同结构特征允许降低由具有结构式为cxty(cct)ncm的完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸显示的毒性，其中n是2至50、优选5至16的整数，x表示整数0或1，y表示整数0(仅当x＝0时)或1(x可以是0或1)，并且m是0、1或2。
本发明的寡核苷酸强烈抑制tlr9的激活。含有cpg的寡核苷酸(cpgodn)被称为tlr9激动剂(klinman,nat.rev.immunol,2004,4,249-258)。本发明的寡核苷酸强烈抑制由cpgodn刺激的细胞因子，表明本发明的寡核苷酸能够用作治疗与tlr9过度激活相关的疾病或可以通过抑制tlr9信号传导治疗的其他疾病的治疗药物。例如，因为已有报道称tlr9的激活促进以下的发展：银屑病(gillietetal.,nat.rev.immunol.,2008,8,594-606)、sle(barratetal.,jexpmed,2005,202,1131-9；wellmannetal.,procnatlacadsciusa,2005,102,9258-63；christensenetal.,immunity,2006,25,417-28)和类风湿性关节炎(leadbetteretal.,nature,2002,416,603-7；bouleetal,jexpmed,2004,199,1631-40)，本发明的寡核苷酸能够通过抑制tlr9的激活用作治疗银屑病、sle和类风湿性关节炎的治疗药物。
本发明的寡核苷酸强烈抑制由tlr9激动剂诱导的人pbmc产生ifn。因此，本发明能够治疗与ifna的过度产生相关的疾病或通过抑制ifna产生而治疗的疾病。例如，如已报道的，由于ifn的升高产生促进sle的发展(barratetal.,jexpmed,2005,202,1131-9；wellmannetal.,procnatlacadsciusa,2005,102,9258-63)，本发明的寡核苷酸能够通过抑制ifn产生用作治疗sle的治疗药物。
已经证明注射tlr9激动剂；cpgodn与d-半乳糖胺(d-gal)入小鼠引起高度免疫反应。模型小鼠在12至24小时内死亡。血浆细胞因子的分析揭示了促炎细胞因子如tnfa的过度产生(marshalletal.,infectimmun,1998,66,1325-33；peteretal.,immunology,2008,123,118-28)。本发明的寡核苷酸强烈抑制由tlr9刺激诱导的小鼠细胞产生tnfa。因为细胞因子介导的致死性休克促进脓毒性休克(slifkaetal.,jmolmed,2000,78,74-80；espatetal.,jsurgres,1995,59,153-8)和多器官功能障碍综合征(mods)(wangetal.,amjemergmed,2008,26,711-5)，本发明的寡核苷酸能够通过拯救宿主免受细胞因子介导的致命性休克用作治疗脓毒症和mogs的治疗药物。
本发明的寡核苷酸还强烈抑制由tlr7或tlr8激动剂诱导的细胞因子产生。本发明的寡核苷酸能够通过抑制tlr7或tlr8用作治疗toll样受体(tlr)介导的疾病的治疗药物。
本发明的寡核苷酸强烈抑制由tlr刺激诱导的nf-kb激活，表明本发明的寡核苷酸能够用作治疗与nf-kb激活相关的疾病的治疗药物。由于已报道nf-kb激活促进各种疾病的发展(http://www.bu.edu/nf-kb/physiological-mediators/diseases/；taketal.,jclininvest,2001,107,7-11)，本发明的寡核苷酸能够通过抑制nf-kb激活用作治疗在这些疾病中发生的症状的治疗药物。在一些癌症中，报道了nf-kb的过度激活，本发明的抑制性功能也可用于治疗这样的癌症。
nf-kb是促炎基因表达最重要的调节因子之一。nf-kb的激活通过其诱导促炎细胞因子转录的能力在炎症中起重要作用(baldwin(jr)etal.,annurevimmunol,1996,14,649-683)。已经证实，nf-kb在类风湿性关节炎(ra)滑膜成纤维细胞中的组成型il-6产生中发挥作用(miyazawaetal.,amjpathol1998,152,793-803)。nf-kb也参与人单核细胞中由il-1或tnfα引起的炎症基因的激活(schotteliusetal.,jbiolchem1999,274,31868-31874)。nf-kb阳性细胞的数量与胃炎程度相关。类似地，炎性肠病中存在nf-kb激活的证据，其中固有层巨噬细胞展示激活的nf-kb(neurathetal.,annnyacadsci,1998,859,149-159)。
配体激活tlr诱导转录因子如nf-kb和干扰素应答因子(irf)的激活。这些激活的转录因子进一步诱导炎性细胞因子如il-6、il-1、il-8、tnfa和ifn的产生。炎性细胞因子的产生能够引起诸如但不限于自身免疫性疾病、变态反应和超敏反应等疾病，因此预期本发明用于治疗这样的具有炎症的疾病。
炎性细胞因子如tnfa、ifn、il-1、il-6和il-12也能激活下游前列腺素的产生，其参与疾病病况下的疼痛形成。据报道，tlr还在涉及疼痛感知的cns和pns中表达(liuetal.,neuroscibull,2012,28,131-44；liuetal.,itch:mechanismsandtreatment,carstense,akiyamat,editors,2014,crcpress/taylor&francis)。因此预期本发明用于治愈由炎性病况引起的这样的疼痛症状。
由于本发明的功能可以由上述概念引起，本发明提供了通过将本发明的寡核苷酸单独或与药学上可接受的承载体施用于受试者来治疗免疫介导的病症的治疗药物；施用可以为肠内、肠胃外、皮下、静脉内、透皮、舌下、鼻内、透粘膜、肺、口服、胃、肠、直肠、阴道、气雾剂、眼内、气管内、直肠内、脊柱内、肌内、关节内、腹腔内、心内、骨内、鞘内、玻璃体内、吸入或局部。
在另一实施方案中，本发明通过单独施用本发明的寡核苷酸或与另外的活性成分组合施用提供治疗免疫介导的病症的治疗药物。
在另一实施方案中，本发明通过施用在递送媒介物中的本发明的寡核苷酸提供治疗免疫介导的病症的治疗药物。
在另一实施方案中，本发明的寡核苷酸用一个或多个聚乙二醇(peg)链的连接进行修饰。聚乙二醇化寡核苷酸能够通过减少肾脏清除来延长体内循环时间。
如上所述，本发明提供调节个体免疫应答的方法，包括向个体施用足以调节所述个体免疫应答量的免疫刺激化合物。根据本发明的方法的免疫调节可以对包括患有与不需要的免疫应答激活相关的病症的那些个体的个体实施。
在另一实施方案中，本发明使用本发明的寡核苷酸提供治疗免疫介导的病症的治疗药物。免疫介导的病症包括自身免疫性疾病、移植物排斥、超敏反应、与自身抗原、微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病和toll样受体(tlr)介导的疾病。
在另一实施方案中，本发明使用本发明的寡核苷酸通过抑制由tlr拮抗剂如病毒或自身免疫性患者的自身抗原诱导的tlr激活和炎性细胞因子产生来提供用于治疗toll样受体(tlr)介导的疾病、tlr9介导的疾病、tlr7和/或8介导的疾病、超敏反应、与由微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病、移植物排斥、干扰素介导的疾病和炎性细胞因子介导的炎症疾病。
在另一实施方案中，本发明提供了以足以阻止个体中tlr9依赖性细胞因子产生的量调节所述个体中tlr9依赖性免疫应答的方法，包括用免疫刺激化合物共同施用于个体。
在另一实施方案中，本发明提供了以足以阻止个体中tlr7和/或tlr8依赖性细胞因子产生的量调节所述个体中tlr7和/或tlr8依赖性免疫应答的方法，包括用免疫刺激化合物共同施用于个体。
在另一实施方案中，本发明提供了使用本发明的寡核苷酸通过抑制促炎细胞因子的产生以拯救受试者免受诸如炎症或细胞因子介导的致死性休克的疾病来治疗免疫介导的疾病的治疗药物。
在另一实施方案中，本发明提供了以足以阻止个体中nf-kb依赖性细胞因子产生的量调节所述个体中nf-kb依赖性免疫应答的方法，包括用免疫刺激化合物共同施用于个体。
在另一实施方案中，本发明通过使用本发明的寡核苷酸通过抑制由tlr刺激诱导的nf-kb激活来提供治疗免疫介导的病症的治疗药物。
在另一实施方案中，本发明主要抑制tlr的激活和相关的下游信号传导，并显示对广谱重要生物系统的各种影响，如nf-kb的转录活性，ifn和炎性细胞因子的分泌。因此，包含本发明的寡核苷酸的药物组合物能够用于对抗各种疾病，包括但不限于自身免疫性疾病、炎症、癌症、肿瘤、变态反应，其是由上述系统中的异常引起的。
本发明的寡核苷酸可以包含化学修饰，因为对本发明所示的包括tlr的靶的抑制效果取决于描述为cxty(cct)ncm的寡核苷酸的序列，其中n表示2至50、或优选5至16的整数，x表示整数0或1，y表示整数0(仅当x＝0时)或1(x可以是0或1)，并且m表示0、1或2的整数(sunetal.,clinimmunol,2010,134,262-276；zhangetal.,internationalimmunopharmacol,2012,446-453；ep2154144,wo2014/082254)以及通常由本领域技术人员使用的改善药物谱的化学修饰。
本发明中的寡核苷酸在核苷酸间键中部分被硫代磷酸酯化，其中非桥连的o被s替换。如已经报道的那样，寡核苷酸由于可能由血清中存在的核酸酶引起的快速降解而在体内不稳定。因此，已经进行了许多尝试来提高寡核苷酸的稳定性，从而允许体内更长的半衰期，例如化学修饰或使用药物递送工具来阻止血清核酸酶的攻击。在这样的化学修饰中，从核酸药物开发的早期开始利用核苷酸间修饰的硫代磷酸酯化。然而，这种硫代磷酸酯化作用的毒性也是众所周知的，这对核酸药物的开发造成了障碍。同时，本发明中的寡核苷酸通过减少具有特定模式的硫代磷酸酯键而成功降低肝毒性而没有活性和稳定性的主要挑战。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸除了如上所述的硫代磷酸酯化之外，还包含对应于磷酸二酯核酸间(internucleic)键中、在天然核酸(dna或rna)中的糖中和/或核碱基中的那些化学残基中的各种化学修饰。
迄今为止已经广泛地研究了用作药物目的的这种具有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸的化学修饰(freieretal.,nucacidres,1997,25,4429-4443；kuwaharaetal.,molecules,2010,15,5423-5444；deleaveyetal.,chemistry&biology,19,937-954；mutisyaetal.,nucleicacidsresearch,2014,42,6542-6551；sharmaetal.,med.chem.commun.2014,5,1454-1471)。
核苷酸间键的修饰包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰基乙酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、磷酸甲酯、磷酸乙酯、乙基硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷硫代磷酸酯、甲基硼烷磷酸酯、甲基硼烷硫代磷酸酯、甲基硼烷膦酸酯、亚磷酰胺、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、二氨基硫代磷酸酯、氨基磺酸酯、二亚甲基砜、磺酸、硫化物、磺酸酯、亚甲基亚胺基、草酰基，硫代乙酰胺、甲缩醛、硫代甲缩醛、羧酸酯、甲酰胺、酰胺、三唑基、亚氨基及其衍生物。
糖修饰中的修饰包括但不限于(a)在糖部分的2'-位引入电负性原子/取代基，(b)通过融合额外的环在糖部分形成双环，(c)在戊糖环结构中的修饰，和(d)向糖环中的碳引入螺环结构(sharmaetal.,med.chem.commun.2014,5,1454-1471)。糖部分中的修饰还包括将核酸转化为核酸类似物，例如吗啉代、肽核酸(pna)、锁核酸/桥连核酸(lna、bna)、环己烯基核酸(hna)和乙二醇核酸以及/或苏糖核酸(tna)。
核碱基中的修饰包括但不限于：(a)修饰的嘧啶碱基，例如5-丙炔基u，2-硫代t和n3-硫代乙基t，和(b)通用的修饰碱基，如3-硝基吡咯、咪唑-4-甲酰胺和5-硝基吲哚。它也可包括修饰胞嘧啶核苷碱基以形成胞嘧啶类似物。
本发明中的上述化学修饰可以单独发生，或者可以与其他的同时或与天然核酸同时发生。
构成本发明的寡核苷酸可以从现有的核酸来源(例如基因组或cdna)获得，但优选为合成的。本发明的寡核苷酸能够通过市场上可得到的各种自动核酸合成仪来合成。这些寡核苷酸被称为合成寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可以是单链、双链或单链和双链的杂合体。它们还能够形成单个分子的5'和3'端连接的环状结构；本发明的超过一个寡核苷酸可以通过共价键合或通过独特的接头在5'或3'端连接以形成串联连接的伸长结构或多价结构。接头是本领域技术人员通常使用的有机化学化合物，包括但不限于甘油、(s)-(-)-1,2,4-丁三醇、1,3,5-戊三醇、顺式、顺式-1,3,5,-环己三醇、顺式反式-1,3,5-环己三醇、1,3,5-三-(2-羟乙基)异氰脲酸酯、四甘醇和六甘醇，并且这里也可以用氨基酸核苷酸和/或它们的衍生物构成。本发明中的寡核苷酸优选具有在核心结构中通过磷酸二酯键连接的完全硫代磷酸酯化(cct)3、(ctc)3或(tcc)3基序或其截短形式，其可以在中间被一个或几个核苷酸通过改变或插入核苷酸而间隔，但需要在单个分子中包含2至50、或优选5至16的cct、ctc或tcc重复。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可以彼此组合使用、与其他具有相似功能机制的寡核苷酸组合使用、与其他有机化合物如(多)肽/抗体或核酸/寡核苷酸或通常用于改善或修饰药物的物理性质的无机化合物如细胞毒性剂其组合使用。这种组合可以通过或不通过共价键合形成。
“寡核苷酸”:寡核苷酸是指多个核苷酸(即包含与磷酸酯基团和可交换的有机碱基连接的糖(例如脱氧核糖)的分子，有机碱基是取代的嘧啶(py)(例如胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t))或取代的嘌呤(pu)(例如腺嘌呤(a)或鸟嘌呤(g))。如本文所用，术语寡核苷酸主要指寡脱氧核糖核苷酸(odn)，但如果功能相同则不受限制。
“化学修饰”:本发明中公开的寡核苷酸可以包括磷酸二酯核苷间桥、核糖单位和/或天然核苷碱基(胞嘧啶和胸腺嘧啶)中的各种化学修饰。修饰能够在寡核苷酸合成期间或之后发生。在合成过程中，修饰碱基可以在内部或末端掺入。合成后，可以使用活性基团(经由氨基修饰剂、经由3'或5'羟基或经由磷酸基团)进行修饰。本领域技术人员知道化学修饰的实例。根据本发明的寡核苷酸可以具有一个或多个修饰，其中与由天然dna组成的相同序列的寡核苷酸相比，每个修饰位于特定磷酸二酯核苷间桥和/或特定核糖单位和/或特定天然核苷碱基位置。化学修饰包括本发明寡核苷酸的“主链修饰”。如本文所用，本发明的寡核苷酸的修饰的主链包括但不限于“硫代磷酸酯主链”，其是指其中非桥连磷酸酯氧被硫替换的核酸分子的稳定的糖磷酸主链。其他主链修饰表示用非离子dna类似物例如烷基-和芳基-膦酸酯(其中带电荷的膦酸酯氧被烷基或芳基取代)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯(其中带电的氧部分被烷基化)进行修饰。化学修饰还包括本发明寡核苷酸的碱基取代。取代的碱基包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶和其他结构上相关的天然或非天然存在的核碱基。本发明的寡核苷酸的化学修饰还包括修饰寡核苷酸的碱基。修饰的碱基是与通常在dna中发现的天然存在的碱基例如t、c、g和a化学不同的碱基，但它们与这些天然碱基具有共同的基本化学结构。本发明的寡核苷酸可以通过使用胞苷衍生物和/或胸苷衍生物进行修饰。术语“胞苷衍生物”是指胞苷样核苷酸(不包括胞苷)，术语“胸苷衍生物”是指胸苷样核苷酸(不包括胸苷)。另外，本发明的寡核苷酸能够通过在寡核苷酸的任一或两个末端连接二醇如四甘醇或六甘醇进行化学修饰。
“免疫介导的病症”:免疫介导的病症是由受试者中不需要的免疫应答引起的疾病。病症包括自身免疫性疾病、移植物排斥、超敏反应、与微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病。免疫介导的病症还可以基于受疾病影响的生理途径分类，例如与tlr激活相关的疾病(tlr介导的疾病、tlr9介导的疾病、tlr7和/或8介导的疾病)、nf-kb介导的疾病、干扰素介导的疾病或炎性细胞因子介导的疾病。如上所述，本发明中公开的寡核苷酸能够用作治疗免疫介导的病症的治疗药物。
“免疫应答”:免疫系统细胞如b细胞、t细胞、自然杀伤细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞对刺激的应答。应答包括固有免疫应答和适应性(特异性或获得性)免疫应答。适应性(特异性或获得性)免疫应答包括体液免疫应答和细胞免疫应答。
“预防或治疗免疫介导的病症”:如本文所用，预防指阻止受试者中免疫介导的病症的充分发展；治疗是指对受试者进行治疗性干预以改善免疫介导病症的病征或症状、停止其进展或消除病理病况。
“受试者”:如本文所用，受试者是指人或非人脊椎动物。非人脊椎动物是非人灵长类动物、家畜动物和伴侣动物。本发明的寡核苷酸可以被施用以预防或/和治疗受试者中的免疫介导的病症。
“自身免疫性疾病”:术语“自身免疫性疾病”是指由自身耐受性的破坏引起的疾病，使得适应性和固有免疫系统对自身抗原起反应并介导细胞和组织损伤。自身免疫性疾病的特征往往在于它们涉及单个器官或单个细胞类型，或涉及多个器官或组织系统。自身免疫性疾病也被称为“胶原蛋白”或“胶原血管”或“结缔组织”疾病。自身免疫性疾病通常与超敏反应相关。本发明的寡核苷酸能够用于治疗和/或预防各种类型的自身免疫性疾病。具体地，自身免疫性疾病的非限制性实例是系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性(i型)糖尿病、炎性关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、慢性侵袭性肝炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、恶性贫血的自身免疫萎缩性胃炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性睾丸炎、获得性血友病、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、白塞病、心肌病、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、多发性肌炎皮肌炎、盘状狼疮、交感性眼炎、基本混合冷球蛋白血症、纤维肌痛、纤维肌炎、吉兰-巴雷综合征、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、iga肾病、幼年型关节炎、系统性硬化症、结节性多动脉炎、多软骨炎、皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、超免疫球蛋白e综合征、进行性系统硬化症、银屑病、莱特尔综合征、结节病、僵人综合征、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、桥本氏甲状腺炎、肺出血肾炎疾病、恶性贫血、艾迪生病、舍格伦综合征、重症肌无力、格雷夫斯病、过敏性脑脊髓炎、肾小球性肾炎、显微镜下多血管炎、韦氏肉芽肿病、自身免疫性甲状腺疾病、幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病等(davidson,engljmed,2001,345,340-350；delgado-vegaetal.,arthritisresearch&therapy2010,12/s2)。从含dna或含rna的微生物释放的dna或rna能够刺激特异性针对自身含dna或含rna的复合物的自身抗体的产生，并因此导致许多上述的自身免疫性疾病，包括但不限于sle。
“移植物排斥”:移植物排斥是由器官或组织移植引起的免疫介导的病症；移植意味着将移植物(transplant)(移植物(graft))从供体转移给受者。移植物是从供体移植给受者的活的细胞、组织或器官。自体移植物是将自己的组织从一个位置转移到另一个位置的移植物；同基因移植物(syngeneicgraft)(同基因移植物(isograft))是同卵双胞胎之间的移植物；同种异体移植物(allogeneicgraft)(同种移植物(homograft))是同一物种的遗传不同成员之间的移植物；和异种移植物(xenogeneicgraft)(异体移植物(heterograft))是不同物种成员之间的移植物。当受试者是同种异体移植物或异种移植物的受者时，身体能够产生针对供体组织的免疫应答。在这种情况下，明确需要抑制免疫应答，以避免移植物的排斥反应(goldsbyetal.,immunology,fifthedition,2003,w.h.freemanandcompany)。本发明的寡核苷酸在用于预防移植物排斥时是有用的。移植物的例子是心脏、肾脏、肝脏、髓质骨骼、皮肤、角膜、肺、胰腺、小肠、肢体、肌肉、神经、十二指肠、小肠、胰岛细胞等。在某种情况下，受者可以是如本发明的“受试者”中所定义的动物。
“超敏反应”:超敏反应是指由于体液或细胞介导的对内源性或外源性抗原的反应而发生组织损伤的病症，并已被分为四类。通常由药理活性物质例如组胺、过敏症的慢反应物质(srs-a)和ige致敏的嗜碱性粒细胞和肥大细胞与特定的外源性抗原接触后形成的嗜酸性粒细胞趋化因子(ecf)的释放导致i型超敏反应(通常称为过敏性、即时型、特应性、反应素的(reaginic)、ige介导的超敏反应或变态反应)。i型超敏反应包括但不限于过敏性外源性哮喘、季节性过敏性鼻炎和系统性过敏症。当抗体与细胞或组织元件的抗原成分或与已经变得与细胞或组织紧密结合的抗原或半抗原反应时，导致ii型超敏反应(也称为细胞毒性、细胞溶解性补体依赖性或细胞刺激性超敏反应)。ii型超敏反应包括但不限于自身免疫性溶血性贫血、胎儿成红细胞增多症和肺出血肾炎疾病。由可溶性循环抗原-抗体复合物在血管或组织中沉积伴随免疫复合物沉积部位的急性炎症反应导致iii型超敏反应(也称为毒性复合物、可溶性复合物或免疫复合物超敏反应)。iii型超敏反应包括但不限于阿瑟斯反应、血清病、系统性红斑狼疮和某些类型的肾小球肾炎。由于特异性抗原接触产生的致敏t淋巴细胞引起iv型超敏反应(通常称为细胞、细胞介导、延迟或结核菌素型超敏反应)。iv型超敏反应包括但不限于接触性皮炎和同种异体移植物排斥(goldsbyetal.,immunology,fifthedition,2003,w.h.freemanandcompany)。
“与微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病”:微生物侵袭，如果严重，有时会引起受试者的全身炎症应答，导致与微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病。例如甲型流感(h5n1)或细菌感染等疾病发展中的事件包括tnfa、il-1、il-6、il-12、ifna、ifnb、ifng、趋化因子ifn诱导蛋白10、单核细胞趋化蛋白1、il-8、il-1b和单核细胞趋化蛋白1的血液水平显著升高。这样的应答能够导致细胞因子介导的致死性休克，部分导致在许多患者中观察到的脓毒症、ards和多器官功能衰竭(thewritingcommitteeoftheworldhealthorganization(who)consultationonhumaninfluenzaa/h5,nengljmed,2005,353,1374-85)。微生物感染后细胞因子的血液水平显著升高称为高细胞因子血症(hypercytokinemia)(高细胞因子血症(hypercytokinaemia))或细胞因子风暴。该研究表明，感染禽流感或sars的患者除抗病毒药物外，还需要抑制免疫应答的药物，以抑制细胞因子升高的症状。因此，本发明的寡核苷酸能够用于治疗和/或预防受试者中与微生物刺激宿主免疫系统相关的疾病。引起疾病的微生物包括但不限于病毒、细菌、真菌、寄生虫和海绵状脑病的病原体。导致与微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病的病毒包括：sarscov、流感病毒、禽流感病毒、hiv-1、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒、冠状病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、汉坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒、内罗病毒、出血热病毒；呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒、乙型肝炎病毒、细小病毒、乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒(hsv)1和hsv-2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)、疱疹病毒、天花病毒、痘苗病毒、痘病毒、非洲猪瘟病毒、海绵状脑病、丁型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、口蹄疫病毒和禽流感病毒的病原体。能够导致与微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病的细菌包括：幽门螺杆菌、boreliaburgdorferi、嗜肺军团菌、分枝杆菌的某些属(如结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登纳分枝杆菌)、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增生李斯特菌、a群链球菌、b群链球菌、链球菌、粪链球菌、牛链球菌、链球菌(厌氧菌的某些属)、肺炎链球菌、致病性卡氏杆菌的某些属、肠球菌的某些属、流感嗜血杆菌、炭疽杆菌(bacillusantracis)、白喉棒状杆菌、棒状杆菌的某些属、猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringers)、破伤风梭菌、产气肠杆菌(enterobacteraerogeytes)、肺炎克雷伯氏菌、多杀巴斯德氏菌、拟杆菌的某些属、具核梭杆菌、念珠状链球菌、梅毒螺旋体、细弱密螺旋体、钩端螺旋体和以色列放线菌。能够引起微生物过度刺激宿主免疫系统疾病的真菌包括但不限于新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、白念珠菌。能够导致与微生物过度刺激宿主免疫系统相关的疾病的寄生虫包括：恶性疟原虫和刚地弓形虫。
“toll样受体(tlr)介导的疾病”:toll样受体(tlr)介导的疾病是指与tlr家族成员的激活相关的免疫介导的病症。该疾病包括但不限于与脂多糖(lps)引起tlr4激活相关的脓毒症、与tlr2、3、4、9激活相关的扩张型心肌病、与tlr2、3、4、9激活相关的糖尿病、与tlr3激活相关的实验性自身免疫性脑脊髓炎、与tlr3激活相关的年龄相关性黄斑病(pateletal.,molcellneurosci,2014,63,38-48)、与tlr9激活相关的系统性红斑狼疮、与tlr4激活相关的动脉粥样硬化、与lps引起tlr4激活相关的哮喘、与tlr4激活相关的慢性阻塞性肺病、与tlr4激活相关的eae和tlr4激活相关的器官衰竭(liewetal.,naturereviewimmunology,2005,5,446-458)。可以从sle血清中鉴定来自含核酸感染原的含cpg的dna(tlr9激动剂)，所述sle血清诱导被认为促进sle发展的ifna分泌主导的有效免疫应答。本发明的寡核苷酸可以用于治疗和/或预防受试者中的toll样受体(tlr)介导的疾病，包括但不限于sle。
“tlr9-介导的疾病”:术语“tlr-9介导的疾病”表示涉及被认为是症状原因的不受控制的tlr9表达和/或tlr9信号传导的激活的疾病，并且这样的疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、iga肾病、牙周炎、硬化性胆管炎、多发性硬化症、炎性肠病、移植物抗宿主病、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(anca)相关血管炎(aav)、暴发性1型糖尿病(ft1d)、终末期肾病、急性胰腺炎(ap)、具有多血管炎(gpa)的肉芽肿病、干眼病、威斯科特-奥尔德里奇综合征、特发性肺纤维化、囊性纤维化、慢性鼻窦炎、类风湿性关节炎(ra)、舍格伦综合征、疼痛、早产和先兆子痫。
“tlr7和/或8介导的疾病”:术语“tlr7和/或8介导的疾病”表示涉及不受控制的tlr7和/或8过表达和/或tlr7和/或8信号传导的过度激活的疾病。这些现象被认为是治疗疾病的好靶标,所述疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、狼疮肾炎(smith,curropinnehrolhypertens,2009,18,189)、多发性硬化症(gambuzzaetal.,jneuroimmunol,2011,239,1-12)、i型糖尿病、类风湿性关节炎(ra)、舍格伦综合征、白塞综合征(hatemietal.,clinexprheumatol,2015,33(6suppl94),3-14)、哮喘(tangetal.,respirology,2015,oct18.doi:10.1111/resp.12657.[印刷版出版前电子公开])
“nf-kb介导的疾病”:术语“nf-kb介导的疾病”表示涉及不受控制的nf-kb的过度激活并影响下游基因表达的疾病。它包括但不限于类风湿性关节炎、胃炎和炎性肠病、变态反应、头痛、疼痛、复合区域疼痛综合征、心脏肥大、肌营养不良、肌肉萎缩、分解代谢疾病、i型糖尿病、ii型糖尿病、胎儿生长迟缓、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、心脏病、慢性心力衰竭、缺血/再灌注、中风、脑动脉瘤、心绞痛、肺部疾病、囊性纤维化、酸性肺损伤、肺性高血压、慢性阻塞性肺病(copd)、透明膜病、肾病、肾小球疾病、酒精性肝病、钩端螺旋体病肾病、肠道疾病、腹膜型子宫内膜异位症、鼻窦炎、无汗性外胚层发育不良-id、白塞病、色素失调症、结核、哮喘、关节炎、克罗恩病、眼部过敏、青光眼、阑尾炎、佩吉特病、胰腺炎、牙周炎、子宫内膜异位症、炎性肺病、脓毒症、睡眠呼吸暂停、抗磷脂综合征、狼疮、狼疮性肾炎、慢性疾病综合征、家族性地中海热、遗传性周期性发热综合征、帕金森病、多发性硬化症、风湿性疾病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿病、白内障、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、幽门螺杆菌相关性胃炎、全身炎症反应综合征和癌症(http://www.bu.edu/nf-kb/physiological-mediators/diseases/；taketal.,jclininvest,2001,107,7-11).
“干扰素介导的疾病”:它是由干扰素过度产生和/或干扰素下游基因过度激活引起的，包括但不限于系统性红斑狼疮、银屑病、舍格伦综合征、类风湿性关节炎(ra)、硬皮病，炎性关节炎、1型糖尿病、炎性肠病、多发性硬化症、格雷夫斯病、显微镜下多血管炎、韦氏肉芽肿病、自身免疫性甲状腺疾病、幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎和克罗恩病(delgado-vegaetal.,arthritisresearch&therapy,2010,12/s2)。
“炎性细胞因子介导的炎症疾病”：它由炎性细胞因子如tnfa、ifna、il-1、il-6、白血病抑制因子(lif)、抑瘤素m(osm)和/或il-12诱导，其通过那些细胞因子的下游信号传导途径过度激活免疫。炎性细胞因子也能激活下游前列腺素的产生，其参与疾病病况下的疼痛形成。由这些炎性细胞因子诱导的疾病表现出如由肿胀、发红、发热、疼痛和功能丧失等标志所显示的炎性应答。慢性炎症还可能导致伤口愈合反应相关的纤维化，这可能导致对正常组织功能的干扰。纤维化包括但不限于肺纤维化、肝硬化、心脏纤维化和囊性纤维化。慢性炎症也可能引起肉芽肿，这是一种由激活的巨噬细胞(上皮样细胞)构成的不受控制的炎症包块(goldsbyetal.,immunology,fifthedition,2003,w.h.freemanandcompany)。
“cpgodn”:已经记载了tlr9激动剂激活固有和适应性免疫应答(krieg,naturereviewsdrugdiscovery,2006,5,471-484)。含有cpg的寡核苷酸(cpgodn)是tlr9激动剂(klinman,nat.rev.immunol,2004,4,249-258)。基于功能特征，将cpgodn分成三种类型(itoetal.,blood,2006,107,2423-2431)。a型cpgodn激活人浆细胞样树突状细胞(pdc)以产生大量i型ifn(ifna/b)并强烈激活自然杀伤细胞(nk细胞)。b型cpgodn主要激活b细胞，导致其增殖和抗体分泌。c型cpgodn共有a型和b型cpgodn的活性。作为tlr9激动剂，cpgodn如cpg2216或cpg2006或cpg2395能够被内吞进入它们所暴露于的细胞隔室中并激活tlr9。在pdc中,tlr9激活启动快速固有免疫应答，其特征在于促炎细胞因子(il-6、tnfa)的分泌，i型ifn的分泌和ifn诱导型趋化因子分泌的分泌。通过ifn依赖性和ifn非依赖性途径，包括自然杀伤(nk)细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的固有免疫细胞由pdc二次激活。通过tlr9激活的b细胞对抗原刺激的敏感性大大提高，并有效地分化成抗体分泌细胞，并因此促进适应性免疫应答，特别是体液免疫应答。通过tlr9激活的pdc分泌ifna，其驱动pdc向淋巴结和其他次级淋巴组织的迁移和聚集，其中pdc激活幼稚和记忆t细胞，协助可溶性蛋白抗原交叉呈递至cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)并促进强烈的th1偏爱的细胞cd4和cd8t细胞应答。基于上述发现，显而易见的是，拮抗cpgodn活性的药剂能够通过抑制固有免疫应答和适应性免疫应答用于治疗或预防免疫介导的病症。
“药学上可接受的承载体”:药学上可接受的承载体表示适合于将本发明的寡核苷酸施用于受试者的一种或多种固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。承载体可以是有机、无机、天然或合成的。承载体包括任何和所有溶液、稀释剂、溶剂、分散介质、脂质体、乳剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及适用于施用本发明寡核苷酸的任何其他承载体并且其用途在本领域中是众所周知的。取决于寡核苷酸施用的具体模式选择药学上可接受的承载体。胃肠外制剂通常包含可注射流体，其包括药学和生理学可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水右旋糖、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如散剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体承载体能够包括例如药物级别的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性承载体外，待施用的药物组合物能够包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖醇酐单月桂酸酯。
“治疗有效量”:为了治疗或预防免疫介导的病症，向受试者施用治疗有效量的本发明的寡核苷酸。“治疗有效量”的一种或超过一种寡核苷酸是指用于达到治疗或预防受试者免疫介导的病症的所需结果的足够量的寡核苷酸。可以纯的形式或在药学上可接受的承载体中的形式利用本发明的寡核苷酸。或者，可以作为药物组合物施用寡核苷酸。本发明中的“量”应指剂量。剂量可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术确定，并且可以不同地取决于包括但不限于受试者的大小或/和总体健康或疾病症状的严重程度的因素。本发明的寡核苷酸的引入能够作为单一治疗或通过一系列治疗进行。本发明寡核苷酸用于施用的受试者剂量范围为每次施用约1μg(微克)至10g。优选地，剂量范围0.1mg至5g。更优选地，剂量范围0.3mg至3g。最优选地，剂量范围1mg至1g。本领域技术人员例如由主治医师在适当的医学判断范围内可以调整更优选的剂量以提供最佳的治疗效果。
“施用途径”:对于临床应用，本发明的寡核苷酸可以单独施用或者配制成经由任何合适的施用途径的药物组合物，以有效实现期望的治疗结果。施用本发明的寡核苷酸的“途径”应当是指肠内、肠胃外和局部施用或吸入。施用本发明的寡核苷酸的肠内途径包括口服、胃、肠和直肠。肠胃外途径包括皮下、静脉内、透皮、舌下、鼻内、透粘膜、肺部、阴道、气雾剂、眼内、气管内、直肠内、脊髓内、肌内、关节内、腹膜内、心内、骨内、鞘内、玻璃体内、吸入或局部施用。本发明寡核苷酸的局部施用途径表示将寡核苷酸从外部施用到表皮、口腔和耳朵、眼睛和鼻子中。
“药物组合物”:药物组合物应当是指包含治疗有效量的本发明的寡核苷酸和含或不含药学上可接受的承载体的组合物。药物组合物可以包含本发明的一种或多种寡核苷酸。组合物包括但不限于水溶液或盐水溶液、颗粒、气雾剂、丸剂、颗粒剂、散剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、乳膏剂、滴剂和适用于各种药物递送系统的其它药物组合物。组合物可以肠胃外、口服、直肠、阴道内、腹膜内、局部(以散剂、软膏、凝胶、滴剂或透皮贴剂的剂型)、经颊或作为口腔或鼻腔喷雾剂施用。在所有情况下，组合物必须在制备和存储条件下无菌并且稳定并且防止微生物污染保存。用于肠胃外注射的本发明的药物组合物包含药学上可接受的无菌水溶液或非水性溶液、分散剂、混悬剂或乳剂，以及用于即将在使用前重构为无菌注射液或分散液的无菌散剂。本发明的寡核苷酸可以重悬于水性承载体中，例如于ph约3.0至约8.0、优选ph约3.5至约7.4、3.5至6.0或3.5至约5.0的等渗缓冲溶液中。缓冲溶液包括柠檬酸钠-柠檬酸和磷酸钠-磷酸，以及乙酸钠-乙酸缓冲液。对于口服施用，组合物将与可食用承载体一起配制成散剂、片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等。对于固体组合物，常规无毒固体承载体可以包括医药等级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。对于经颊施用，组合物将是传统方式的片剂或锭剂。对于吸入，组合物将是来自加压包装、喷雾器气雾剂喷雾或干粉，并且可以由本领域技术人员选择。在一些情况下，为了延长本发明的寡核苷酸的作用，本发明的寡核苷酸也适合通过缓释系统施用。本发明的寡核苷酸以水溶性差的晶体或无定形材料的液体混悬剂的形式使用，以减缓寡核苷酸的释放。或者，通过将寡核苷酸溶解或悬浮于疏水材料(例如可接受的油性媒介物)中来实现胃肠外施用的寡核苷酸药物形式的延迟释放。通过将寡核苷酸包埋在脂质体或微乳剂或其他可生物降解的半透性聚合物基质如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中制备可注射储库形式。
“活性成分”:本发明的寡核苷酸能够单独使用，它们之间组合使用，在药学上可接受的承载体中使用，与一种或多种另外的活性成分组合使用。本发明的寡核苷酸和另外的活性成分的施用能够顺序进行或同时进行。活性成分包括非甾体抗炎剂、甾体、非特异性免疫抑制剂、生物反应调节剂、化学化合物、小分子、核酸和tlr拮抗剂。活性成分还表示通过拮抗趋化因子、通过诱导调节性t细胞(cd4+cd25+t细胞)的产生、通过抑制补体、基质金属蛋白酶和一氧化氮合酶、通过阻断共刺激因子以及通过抑制免疫细胞中的信号传导级联来抑制免疫激活的药剂。非甾体抗炎剂包括但不限于双氯芬酸、双氟尼酸、依托度酸、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、吡罗昔康、舒林酸、托美汀(tohnetin)、塞来昔布和罗非考昔。甾体包括但不限于可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松和去炎松。非特异性免疫抑制剂是指用于预防免疫介导疾病发展的药剂。非特异性免疫抑制剂包括但不限于环磷酰胺、环孢素、氨甲蝶呤、甾体、fk506、他克莫司、霉酚酸和西罗莫司。生物应答调节剂包括如下的小分子、重组蛋白或单克隆抗体靶向分子，但不限于：
i)靶向il-1:阿那白滞素/anakinra和利纳西普/arcalyst
ii)靶向tnfa信号传导:依那西普/enbrel,英夫利昔单抗/remicade和戈利木单抗/simponi
iii)靶向il-6:托珠单抗/actemra,司妥昔单抗/sylvant,sirukumab和olokizumab
iv)靶向ifna:sifalumab和rontalizumab
v)靶向baff:贝利单抗/benlysita,blisimod和阿塞西普
vi)靶向il-17:苏金单抗/cosentyx,brodalumab/lumicef和ixekizumab/talz
vii)靶向il-23或il-12/23:ustekinumab/stelara,guselkumab,briakinumab和tildrakizumab
viii)靶向jak(janus激酶):鲁索替尼/jakafi和托法替尼/xeljanz
药剂还包括干扰素β-1a、il-10和tgfβ或其衍生物。它们还包括用于消除某些免疫细胞的单克隆抗体/重组蛋白，例如b细胞(利妥昔单抗/rituxan、依帕珠单抗(eptratuzumab))和抑制淋巴细胞活化的蛋白质，如阿巴西普/orencia，那他珠单抗/tysabri和达克珠单抗/zimbryta。
“递送媒介物”:本发明的寡核苷酸可以在递送媒介物中施用/与递送媒介物一起施用或与媒介物连接的形式施用。媒介物包括但不限于甾体(例如胆固醇)、螺旋形、乳脂体、iscom；脂质(例如阳离子脂质、阴离子脂质)、脂质体；乙二醇(peg)；活的细菌载体(例如沙门氏菌、大肠杆菌、卡介苗、志贺菌、乳杆菌)、活的病毒载体(例如痘苗病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒)、病毒体、病毒样颗粒、微球体、核酸疫苗、聚合物(例如羧甲基纤维素、壳聚糖)、聚合物环和由特异性受体识别靶细胞的靶向剂。
“聚乙二醇化”:聚乙二醇化是聚(乙二醇)聚合物链与另一种分子(通常为药物或治疗性蛋白质)共价连接的过程。聚乙二醇化通常通过将peg的反应性衍生物与靶剂孵育来实现。聚乙二醇化剂能够“掩盖”来自宿主免疫系统的药剂，并增加药剂的流体动力学尺寸，从而延长其循环时间。本发明的寡核苷酸能够被聚乙二醇化。
除非另外定义，否则本发明的所有术语具有与本公开所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非上下文另外指出，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数指代物。类似地，除非上下文另外指出，否则单词“或者”旨在包括“和”。在本说明书中术语“少数”是指2至3的数字。在本说明书中术语“几个”是指2至6的数字。在发生冲突的情况下，以本申请(包括术语解释)为准。此外，材料、方法和实例仅仅是示例性的并不旨在限制。治疗(treat、treating或treatment)应该具有相同的含义而不涉及语法。类似地，预防(prevent、preventing或prevention)应该具有相同的含义而不涉及语法。
实施例
将在下面的实施例中更详细地描述本发明。同时，本发明不限于这些实施例。除非另有说明，否则在本文这些实施例中，使用市售试剂盒和试剂的实验根据所附的方案进行。本领域技术人员将会理解，本发明的寡核苷酸能够容易地应用于治疗免疫介导的病症。现在将通过以下非限制性实施例来证明本发明。
用于以下实施例中的tlr9刺激性寡核苷酸是cpg2395(5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’,seqidno.:43),cpg2216(5’-gggggacgatcgtcgggggg-3’,seqidno.:44)，其均为单链dna并且在hokkaidosystemscienceco.ltd(sapporo,japan)合成，其中寡核苷酸中大写字母表示硫代磷酸酯化的核苷酸，而小写字母表示在其3'端具有磷酸二酯键的核苷酸。通过添加嘎德莫特(invivogen)来实现tlr7或8的刺激。用于该实施例的本发明的所有寡核苷酸也是单链dna，在hokkaidosystemscienceco.ltd(sapporo,japan)合成。在实施例中使用的那些是寡核苷酸，所述寡核苷酸能够被描述为cxty(cct)ncm，其中n是2至50或优选5至16的整数，x表示整数0或1，y表示整数0(仅当x＝0时)或1(x可以是0或1)，并且m是0、1或2，其在核苷酸间键是完全或部分硫代磷酸酯化的。在实施例中描述的样品寡核苷酸如下：
cct8ps(23个硫代磷酸酯键):5'-cctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:45),
cct12po(0个硫代磷酸酯键):
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:15)
cct12ps(35个硫代磷酸酯键):
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:46)
cct12-1(30个硫代磷酸酯键):
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:25)
cct12-2(32个硫代磷酸酯键):
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:26)
cct12-3(31个硫代磷酸酯键):
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:27)
cct12-4(32个硫代磷酸酯键):
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:47)
cct12-5(31个硫代磷酸酯键):
5'-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3'(seqidno.:48),
tcc12po(0个硫代磷酸酯键):
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3’(seqidno:20)
tcc12ps(35个硫代磷酸酯键):
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3’(seqidno:49)
tcc12-6(32个硫代磷酸酯键):
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:40),
tcc12-7(32个硫代磷酸酯键):
5'-tcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:50),
tcc6-1(16个硫代磷酸酯键):5'-tcctcctcctcctcctcc-3'(seqidno.:36),
其中大写字母表示碱基在3'处在磷酸二酯核苷酸间键中经硫代磷酸酯化修饰，而小写字母表示碱基未经修饰。在以下实施例中用于操作寡核苷酸的所有试剂都是无热原的。
实施例1
与具有正常磷酸二酯键的寡核苷酸或硫代磷酸酯化寡核苷酸相比，部分硫代磷酸酯化寡核苷酸的稳定性
<实验方法>
寡核苷酸(10ng/ul)在蒸馏水(dw)中与20％(v/v)的人血清(cosmobio,cat.12181201)在37℃孵育。1天孵育后收集含有寡核苷酸的溶液并检查剩下的未降解的寡核苷酸的浓度。使用(cct)12或(tcc)12的互补寡核苷酸作为探针通过杂交测定确定溶液中寡核苷酸的浓度，所述探针仅检测具有(cct)12或(tcc)12序列的全长寡核苷酸的寡核苷酸。
<实验结果>
图1显示在含血清培养基中1天孵育后剩下的完整寡核苷酸的比例；该比例以与研究开始时的寡核苷酸浓度相比的％表示。如图1a所示，具有正常磷酸二酯核苷酸间键的cct12po在1天孵育中显示几乎完全降解，而完全硫代磷酸酯化的cct12ps显示相当更长的持续时间，这表明寡核苷酸在没有核苷酸间修饰的情况下快速降解。如图1a所示，非硫代磷酸酯化的寡核苷酸cct12po在水溶液中存在血清的情况下显示快速降解，而完全或部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸(cct12ps和cct12-3)超过24小时仍显示稳定。图1b显示部分硫代磷酸酯化(tcc)12物质的稳定性。结果表明虽然没有硫代磷酸酯化的寡核苷酸(tcc12po)在1天孵育后显示出快速降解，而部分硫代磷酸酯化寡核苷酸(tcc12-6)显示出与具有相同序列的完全硫代磷酸酯化物质(tcc12ps)相比增加的稳定性。
实施例2
寡核苷酸的体内毒性检查
<实验方法>
寡核苷酸以2mg/ml溶解于盐水中并每天一次以100ul/10g体重皮下注射至小鼠(balb/c)，连续7天得到20mg/kg(mpk)。检查小鼠的体重以查看寡核苷酸是否显示出对体重的任何影响。在图2a至2c的图中，x轴表示从第一次给药开始的天数(即第0天是给药的第一天；第6天是给药的最后一天)。在y轴上显示体重平均值(每组3只动物)，比例为从研究开始设为100％。
在最后一次给药的第二天(第7天)，将从小鼠收集的血液进行生物化学分析，以观察对显示肝损伤的标志物如丙氨酸转氨酶(alt)的影响。图2d和2e在y轴上显示血液alt的浓度。alt通常在临床上作为肝细胞损伤诊断评估的一部分来测量，以确定肝脏健康。通常,10-40iu/l是任何哺乳动物如人、猫、狗、小鼠、大鼠等的标准参考范围。根据受试者的年龄、性别和种族等情况，alt的范围可能会有所不同，甚至在人中也有所不同；因此靶化合物的毒性通常通过与具有类似背景的受试者中获得的参考值的比较来评估。在本申请中，将alt的测定外包给orientalyeastco.,ltd.的nagahama生命科学实验室。并且根据制造商的标准方案，使用实验室检测试剂盒l型altj2(wakopurechemicals)进行测量。如果测量的alt值显著超过给予盐水的动物(图2d和2e中的盐水)，则该受试者被诊断为遭受肝毒性。
<实验结果>
如图2a所示，给予盐水的小鼠体重没有显示任何减少，而给予cct8ps或cct12ps的小鼠显示体重显著降低，伴随着在任一给药组中的一只动物由于强烈的毒性而死亡。同时，部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸在它们之间表现出可变性行为(从图2a至c)，使得对于cct12-4(图2b)、cct12-5和tcc12-7(图2c)通过体重的急剧下降所显示的强毒性，而对于cct12-2、cct12-3(图2b)、tcc6-1和tcc12-6(图2c)没有观察到明显的毒性。在给予tcc12-7的小鼠组中，一只小鼠在施用过程中死亡，表现出强烈的毒性。有趣的是，即使是具有相同硫代磷酸酯化比例的寡核苷酸，如cct12-2和cct12-4、cct12-3和cct12-5以及tcc12-6和tcc12-7，也表现出毒性差异。
在最后一次施用后的一天还对小鼠进行生化分析检查(第7天，图2d和2e)。具有毒性寡核苷酸的小鼠，例如完全硫代磷酸酯化的cct12ps或部分硫代磷酸酯化的cct12-4或tcc12-7显示出alt急剧升高。同时，一些部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸(例如cct12-1、cct12-2、cct12-3(图2d)和tcc12-6(图2e))的给药未显示alt的升高，表明如盐水对照给药动物的情况下一样缺乏肝损伤。
总之，结果是毒性不依赖于每个分子中的硫代磷酸酯键的比例或数目；在具有32个硫代磷酸酯键的12个cct重复的寡核苷酸中，cct12-2没有显示任何毒性而cct12-4显示强烈的毒性；在具有31个硫代磷酸酯键的12个cct重复的寡核苷酸中，cct12-3没有显示任何毒性而cct12-5显示强烈的毒性；在具有32个硫代磷酸酯键的12个tcc重复的寡核苷酸中，tcc12-6没有显示任何毒性而tcc12-7显示强烈的毒性。
毒性降低的所有寡核苷酸中的共同特征是3个cct或tcc完全硫代磷酸酯化的链段或其通过磷酸二酯键连接的截短链段的结构，而具有毒性的寡核苷酸通常具有至少4个cct或tcc完全硫代磷酸酯化的链段。
同时,当根据基于体表面积的fda指导方针通过剂量转换计算时，在该实施例中检查的20mg/kg剂量可认为等于人中的1.62mg/kg(guidanceforindustry,estimatingthemaximumsafestartingdoseininitialclinicaltrialsfortherapeuticsinadulthealthyvolunteers,u.s.departmentofhealthandhumanservicesfoodanddrugadministration,centerfordrugevaluationandresearch(cder),july2005)，其中单剂量约100mg(在60千克体重的情况下)。因此，该研究表明，当将本发明的100mg寡核苷酸施用于人时，至少一周连续每天给药本发明的100mg寡核苷酸是足够容忍的，并且还表明甚至将允许更高的剂量。给药时间表和给药水平将由医生或本领域其他技术人员进行调整。
实施例3
抑制nf-kb转录活性
<实验方法>
建立cal-1/nf-kb-gfp细胞系，用于在基于细胞的测定中监测nf-kb转录因子的活性(wo2014/082254)。由nf-kb共有转录应答元件驱动的编码gfp报道基因的载体通过电穿孔转染进入人浆细胞样dc细胞系；cal-1(人pdc细胞系,maedaetal.,intjhematol.,2005,81,148-54,jp5011520)。进一步用抗生素选择转染细胞。然后，cal-1/nf-kb-gfp细胞(1×105/孔)接种于96孔平底板(costar)并用tlr激动剂和含或不含本发明的寡核苷酸的情况下培养。细胞在37℃在5％co2加湿的培养箱中培养4小时(tlr7/8)或6小时(tlr9)。作为来自设定为100％的不含抑制剂的细胞(培养基(medium))的数据，通过流式细胞仪(facscalibur,bdbioscienceco.,ltd)检测的gfp阳性细胞的比例显示nf-kb转录活性的变化。通过添加3μg/ml的图3a(寡核苷酸，0.1μm)和2μg/ml的图3b和3c(寡核苷酸，0.33μm)的嘎德莫特实现tlr7/8下游信号传导的激活和通过添加1um的cpg2395实现tlr9下游信号传导的激活。
<实验结果>
在图3a中，水平轴表示与仅用培养基作为100％(培养基)处理的细胞中显示的样品相比，由活性nf-kb驱动的发光的比例。如图3a所示，部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸(cct12-1、2、3和4)显示与完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸cct12-ps相似水平的抑制活性。因此，这里显示的寡核苷酸不显示对nf-kb转录活性的抑制活性的变化，而不管核苷酸间键处的硫代磷酸酯化水平的降低。在图3b和图3c中，还显示了通过具有相同的硫代磷酸酯化比例的寡核苷酸(cct12-3和cct12-5；tcc12-6和tcc12-7)没有显示出对tlr7/8或tlr9活化的显著差异的抑制作用的事实所揭示的硫代磷酸酯化模式的变化不影响抑制作用。
实施例4
寡核苷酸在cal-1细胞中对细胞因子产生的抑制
<实验方法>
cal-1细胞(以1×105/孔接种)与tlr激动剂(嘎德莫特作为tlr7/8激动剂，3ug/ml用于图4a或2ug/ml用于图4b；或者cpg2395作为tlr9激动剂，1um)在含或不含抑制性寡核苷酸在37℃孵育24小时，并通过离心收集上清。然后，通过elisa针对培养基中的浓度检查细胞因子如tnfa或il-6。根据制造商的方案用以下试剂盒进行elisa：humantnfaduosetelisa(r&dsystems,cat.dy210),humanil-6duosetelisa(r&dsystems,cat.dy206)
图4a、4b和4c描绘了由针对不含抑制性寡核苷酸的样品的比例显示的tnfa或il-6产生水平，培养基中不含抑制性寡核苷酸的样品的细胞因子的浓度设定为100％(培养基)。在图4a中，寡核苷酸cct12ps、cct12-1、cct12-2、cct12-3和cct12-4对于tlr7/8激动剂或tlr9激动剂均以0.1um使用，而在图4b和4c中，寡核苷酸cct12-3、cct12-5、cct12-6和cct12-7对于tlr7/8激动剂以0.037um使用，或对于tlr9激动剂以0.011um使用。
<实验结果>
如图4a所示，包括部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸(cct12-1、2、3和4)的所有寡核苷酸在细胞因子产生中显示出相似的由tlr7/8或tlr9诱导的抑制水平，这表明部分硫代磷酸酯化不影响对细胞因子产生的抑制作用。图4b显示当在cct12-3和cct12-5或tcc12-6和tcc12-7之间比较时，由嘎德莫特或cpg2395诱导的对tnfa和il-6产生的抑制作用不受硫代磷酸酯化水平变化的影响。
实施例5
寡核苷酸在人pbmc中对ifna的抑制作用
<实验方法>
从2个健康志愿者供体收集的人pbmc与tlr9激动剂cpg2216以1um在含或不含抑制性寡核苷酸的情况下在37℃孵育24小时，并通过elisa检测上清中的ifna。
根据制造商的方案，用humanifnamoduleset(bendermedsystems,cat.bms216mst)进行对ifna浓度的elisa分析。
在图5a(0.03μm的寡核苷酸)和b(0.011μm的寡核苷酸)中，每个样品中的ifna水平显示为与使用tlr激动剂但不含抑制性寡核苷酸的ifna产生的比例并且来自2个供体的结果之间的平均值被绘制在y轴上。
<实验结果>
如图5a所示，由tlr9激动剂诱导的ifna产生受任何抑制性寡核苷酸、无论是具有或是不具有毒性的抑制性寡核苷酸抑制，揭示了硫代磷酸酯化的减少不影响寡核苷酸的抑制作用，甚至具有相同水平的硫代磷酸酯化的寡核苷酸也不影响抑制作用。t检验结果支持cct12ps与每个部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸(即cct12-1、cct12-2、cct12-3或cct12-4；各自p值是0.3501、0.5108、0.3096和0.2922)之间没有显著性差异。
在图5c中，比较了具有不同硫代磷酸酯化模式的tcc12物质对ifna产生的抑制，并且发现硫代磷酸酯化模式不影响寡核苷酸的活性，这通过t-检验计算的p值支持，tcc12-6和tcc12-7的结果之间没有显示显著性差异(p值＝0.4541)。
总之，本发明提供了寡核苷酸与先前发明相比更稳定但毒性更低来治疗免疫介导的病症。有趣的是，具有低毒性的本发明的寡核苷酸通常具有这样的结构，其具有3个cct或tcc重复的完全硫代磷酸酯化的链段和/或其间的磷酸二酯键连接的截短链段(例如cct12-1、cct12-2、cct12-3、tcc12-6和tcc6-1)，而具有强毒性的寡核苷酸具有更大(超过3个)完全硫代磷酸酯化的链段(例如cct12-4、cct12-5、tcc12-7，包括cct12ps和tcc12ps)。
因此，与现有技术相比，本申请中的寡核苷酸能够对免疫介导的病症的治疗有效，因为寡核苷酸能够具有较低的毒性，从而使得增加包含所述寡核苷酸的药物组合物的剂量方案成为可能。
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<120>tlr抑制性寡核苷酸及其用途
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