本申请要求于2015年12月28日提交的标题为“用于离散接种微点的具有微保持架的流体单元”的美国临时申请no.62/271,544，和于2016年3月16日提交的标题为用“于离散接种微点的具有微保持架和颗粒分离器的流体单元”的美国临时申请no.62/309,122的优先权，其内容以引用的方式并入本文中。
本发明大体上涉及一种用于进行边合成边测序或其它测序过程的仪器，且尤其涉及在该仪器中使用的流动单元和颗粒分离器。
背景技术：
dna(脱氧核糖核酸)测序仪器被用于确定dna分子序列。这些仪器在临床研究、诊断，所谓的“个性化医疗”(根据个体的遗传内容等定制医学治疗)等中是有用的。现在用于进行dna测序的仪器使用多种技术来分析形成dna序列的碱基对。例如，一些仪器对固定在流动单元内的单链dna分子片段的克隆的集落(dna模板集落)的文库进行测序。流动单元本质上是小腔室，dna模板集落在其中经受一系列的核碱基延伸过程。每个连续的延伸被检测以确定每个dna模板集落的碱基对序列。在延伸过程中，以及在读取每个延伸的碱基对的检测过程中，流动单元提供了保持dna模板集落的环境。
尽管非光学系统也是已知的，但许多边合成边测序的仪器使用诸如显微镜的光学系统来检测碱基延伸。典型的光学仪器使用可见的化学标签来确定每个延伸碱基对的身份(identity)。例如，构成dna分子的每个核碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)可用显微镜可见的独特荧光探针标记。每次延伸dna模板集落时，标签被读取，然后除去标签，为下一碱基对的延伸开路。
在新式的“下一代”仪器中，数以百万计的dna模板集落可以被固定在单个流动单元中，并同时处理。已经开发了多种流动单元设计来保持固定化的dna模板集落，但它们通常包括某些共同特点。典型的流动单元包括刚性流动通道、封闭通道的光学透明盖以及流体入口和流体出口，适当的试剂通过该流体入口和流体出口以控制dna模板集落的生长和延伸。这种流动单元的例子见于美国专利nos.8481259，nos.8940481和nos.9146248和美国专利申请公布nos.2009/0298131和nos.2014/0267669，所有这些均以引用的方式并入本文中。
dna模板集落可以以各种方式固定在流动单元内。例如，克隆的dna模板集落可以固定到个个珠子上，然后珠子可以以随机图案固定到流动单元内的功能化表面。虽然这种技术是有用的，但它很少控制或不控制珠子的间距，从而很少控制或不控制dna模板集落，这能使数据采集变得更加困难。该技术还可以使用流动单元外的单独处理步骤来扩增dna模板。该过程也可能经历相对低效的珠子捕获性能，在制备dna模板文库时，其可能需要更大的扩增量。
另一种技术使用具有组织化微孔图案的流动单元以固定dna模板集落。每个孔包括功能化有引物的凝胶，以捕获dna模板，并将捕获的模板扩增以在流动单元内原位形成dna模板集落。凝胶通过涂覆整个基底表面被置于孔中，然后除去个个孔之间的间隙空间中的凝胶。这个过程会有几个缺点。例如，由于需要去除大量的功能化的凝胶，其能导致额外的操作和材料成本，并且任何可能残留的凝胶，会产生不希望的间隙dna模板接种位点。此外，凝胶会意外地从孔中被除去，这降低了dna引物的密度。
发明人已经确定，对于改进目前用于测序仪器和类似设备的流动单元的工艺水平有着持续的需求。
技术实现要素：
在一个示例性方面，提供了用于测序仪器的流动单元。该流动单元包括流体入口；流体出口；流体通道，所述流体通道形成在至少部分透明的盖和基部之间并将所述流体入口流体连接至所述流体出口；以及捕获基底，所述捕获基底设置在所述流动通道中。所述捕获基底具有多个微保持架，每个微保持架被配置成接收多个微点(microspots)中的单个相应的微点，并且所述多个保持架的每个都通过间隙间距与每个相邻保持架隔开。所述间隙间距可以等于或大于所述微点直径。
在一些实施方案中，基部或盖可以是柔性膜。在一些实施方案中，捕获基底可以与盖和基部分开，并且固定于盖和基部中的至少一者。这样的捕获基底可以是具有形成于其上微保持架的柔性膜。这样的膜可具有热成型于薄膜中的微保持架。这样的膜可以是聚合物，更具体地是环状烯烃共聚物。这样的膜的厚度可以为1微米至100微米、4微米至50微米、或10微米至20微米。
在一些实施方案中，微保持架可以是形成在相邻的微保持架对之间的间隙表面之下的孔。微保持架也可以是形成在相邻的微保持架对之间延伸的间隙表面之上的柱，并且每个柱的顶部被配置为接收相应的微点。微保持架也可以是形成在从间隙表面向上延伸的微柱的相应群之间的开口。这样的微柱的相应群可以是以六边形图案排列的微柱。可以在间隙表面上提供额外的微柱，以防止微点接触间隙表面。
在一些实施方案中，微保持架可以三角形图案分布，该三角形图案具有沿三个不同轴线排列的行(rows)。在这样的实施方案中，三个不同的轴线彼此之间为120°，并且微保持架在等边三角形图案中。
在一些实施方案中，捕获基底可以是压花或注塑成型以形成微保持架的塑料材料。
在一些实施方案中，微点的直径可以为300纳米至3微米、500纳米至1.5微米、或700纳米至1微米。
在一些实施方案中，微保持架的深度可以为大约微点直径的50％，或大于微点直径的50％。
在一些实施方案中，微保持架可以具有等于或大于微点直径的宽度。
在一些实施方案中，基本上所有的微保持架都含有相应的微点，并且每个微点都被用于杂交dna模板的引物功能化，但不包括扩增的dna模板集落。
在一些实施方案中，基本上所有的微保持架都含有相应的微点，且每个微点都包括扩增的dna模板集落。
在另一个示例性方面，提供了一种微流体颗粒分离器。微流体颗粒分离器可以包括：缓冲液入口，所述缓冲液入口被配置为接收含多个微点的缓冲液；加样缓冲液入口，所述加样缓冲液入口被配置为接收加样缓冲液；微流体通道，所述微流体通道被配置为接收所述加样缓冲液和含多个微点的缓冲液；以及和加样缓冲液出口。微流体通道可以包括被配置为将多个微点从释放缓冲液转移到所述加样缓冲液中的微柱的阵列，并且所述阵列可选地由疏水材料制成。所述加样缓冲液出口可以被配置为接收含多个微点的加样缓冲液，并且所述微流体颗粒分离器可以与流动单元结合，使得加样缓冲液出口与流动单元的流体入口流体连接。
鉴于本发明，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。
对发明内容的详述并不旨在限制本申请或任何相关或不相关申请的权利要求。鉴于本文的公开的内容，要求保护的本发明的其他方面、实施方案、修改和特征对普通技术人员将是显而易见的
附图说明
通过参考附图可以更好地理解示例性实施方案，其中同样的附图标记指定同样的部分。附图是示范性的，并不打算以任何方式限制权利要求。
图1为第一示例性实施方案的捕获基底和相关联微点的示意性正视图。
图2为图1的实施方案的局部平面视图。
图3a为第二示例性实施方案的捕获基底和相关联微点的示意性正视图。
图3b为图3a的实施方案的一部分的细节图。
图3c为图3a的实施方案的一部分的细节图，示出替代性的微保持架的形状。
图3d为图3a的实施方案的一部分的细节图，示出另一个替代性的微保持架的形状。
图3e为图3a的实施方案的一部分的细节图，示出又一个替代性的微保持架的形状。
图4为第一示例性流动单元和相关联仪器的示意性正视图。
图5为第二示例性流动单元和相关联仪器的示意性正视图。
图6为第三示例性流动单元和相关联仪器的示意性正视图。
图7a和图7b为另一示例性实施方案的捕获基底和相关联微点的顶部平面图和斜面视图。
图8为另一个示例性实施方案的捕获基底和相关联微点的示意性正视图。
图9a为根据一个示例性实施方案的微流体颗粒分离器的微流通道的示意性局部平面图。
图9b为图9a中b区域的放大图。
图9c为图9b中微柱的示意性局部平面图。
图9d为图9a中的微流通道中发生的颗粒分离的示意性局部平面图。
图10为包含图9a的微流通道的微流体颗粒分离器的示意平面图。
图11为另一个示例性实施方案的包含与流动单元流体连接的多个微流体颗粒分离器的卡盒(cartridge)的示意性局部平面图。
具体实施方式
发明人已鉴定出多种可替代的可用于dna测序仪器或类似装置的流动单元的结构和方法，如2015年12月28日提交的发明人共审申请no.62/271544中所提供的，其全部内容通过引用的方式并入本文中。本文提供了这些结构和方法的非限制性的实施例。
图1和2是捕获基底100的侧视图和顶视图。基底100具有在基底100的上表面上形成截头圆锥状孔的多个微保持架102。凸起区域104被设置在相邻的一对微保持架102之间，且凸起区域104的顶部限定了基底100的上表面。每个微点106被配置为持有包含多个克隆的dna模板链的dna模板集落。为了说明的目的，图1的最左边的微点106从其相应的微保持架102移开而显示，但是在使用中，如其他微点106所示，其将被固定在于保持架102内。如下文所解释的，基底100可以包括流动单元的内表面，或者其可以是设置在流动单元中的单独部分。
基底100可以包括金属、玻璃、刚性塑料、陶瓷、薄膜或任何其他合适的材料。优选地，基底100是相对平坦的，以便呈现固定在其平面内的dna模板集落，该平面位于用于在测序过程中读取dna模板集落的显微镜或其他光学仪器的景深内。
微保持架102通过间隙凸起区域104分离。在图1和2的实施方案中，凸起区域104连接在一起形成基底100的连续上表面，但是在其他实施方案中，凸起区域104可以包括多个从下表面向上延伸的离散区域。例如，形成微保持架102的孔可以通过分开凸起区域104的通道连接。每个凸起区域104在相邻的一对微保持架102之间设置了间隙间隔g。每个间隙间隔g的宽度优选等于，和更优选地大于微点直径d。然而，在一些实施方案中，某些或所有微点之间的间隙间隔g可以小于微点直径d。
可以使用任何合适的制造方法来形成微保持架102和凸起区域104。例如，微保持架102可以选择性地从基底100的上表面被蚀刻掉，同时在适当位置留下的凸起区域104作为基底100的未蚀刻部分。可以通过涂覆未用光刻胶或其他中性层蚀刻的基底100的部分，应用于所需的蚀刻介质而形成微保持架102，然后可选地移除光刻胶涂层，而使用湿的(例如，化学的)或干燥的(例如，等离子体)光刻或蚀刻工艺。微保持架102和凸起区域104也可以通过附加制造技术来制造，例如溶胶-凝胶工艺或微观材料沉积或印刷，其中材料在基底100的原始上表面上组合以形成在微保持架102之间的凸起区域104。某些基底100材料，例如塑料，也可以使用模制技术(例如，注塑模具)或压花来制造。鉴于本发明，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。
微保持架102可以分布在任何期望的图案中，例如直线或方形网格图案或行或列，具有沿三个轴线定向的行的三角形图案，等等。在一个优选的实施方案中，如图2所示，微保持架102以一个等边三角形图案提供，其中微保持架102位于彼此之间为120°的行中。该排列可能有益于在给定基底区域内设置最大数量的微保持架102，同时仍然保持每对相邻的微保持架102之间的最小期望间隙间隔g。
微点106可以包括任何合适的结构以至于能用用于dna模板杂交的引物功能化。在一个优选的实施方案中，微点106是球形的，但其可以是其他形状。微点106可以是固体，诸如玻璃珠。或者，微点106可以包括多孔材料，诸如聚合物珠，以增加微点106的表面积，并增强微点表面上的引物密度。微点也可以是透明的，其能潜在地增加为相关光学显微镜等所见的荧光的强度。透明微点也可以允许相关的显微镜检测反射微点106下方的基底的光。
微点106可以具有任何合适的直径d。在一个优选的实施方案中，微点直径d可以在300纳米(“nm”)到3微米(“μm”)的范围内。在另一个优选实施方案中，微点直径d可以在500nm到1.5μm的范围内。在另一个优选实施方案中，微点直径d可以在700nm到1μm的范围内。为了本发明的目的，非球形微点106的直径d可以被理解为与非球形微点106具有相同容积(包括内部孔隙率，如果材料是可测量多孔的)的球形物体的直径。前述微点尺寸预期具有涉及碱基对延伸检测的荧光方法的功能。其它微点直径，诸如更小的或更大的直径，可能被用于其它实施方案中，并且直径可以根据打算使用的检测类型被具体地选择。
每个微保持架102优选地按大小分类以持有单个微点106。微保持架102优选地也被配置为持有微点106，每个微点106具有大约一半或更小的位于基底100的上表面之上的微点表面。在一些实施方案中，如图1所示，微保持架102可足够深以完全包含微点106，使得微点106不突出于间隙表面106之上。可以理解的是，微点106落在基底100上表面之下的程度可以受到一个或更多个微保持架形状、微保持架深度d和微保持架宽度w的影响，例如，在球形微点106被使用和微保持架102包含具有小于微点直径d的宽度w的深圆柱形时，微点106可以停留在微保持架102的上边缘，而不会下降微保持架102的全深度d。为了使在基底100的上表面上方的微点表面小于50％，微保持架深度d优选等于或大于微点直径d的大约50％，并且微保持架宽度w优选等于微点直径的至少100％。微保持架102也可以为深度d和宽度w都等于或大于微点直径d，使得整个微点106保持在基底100的上表面之下。在一个优选的实施方案中，微保持架102的深度d可以在150nm到1.5μm的范围内的，并且宽度w在300nm到3μm的范围内。在另一个优选实施方案中，微保持架102的深度d可以在250nm到0.75μm范围内和宽度w在500nm到1.5μm的范围内。在另一个优选实施方案中，微保持架102的深度d可以在350nm到0.5μm的范围内，并且宽度w在700nm到1μm的范围内。
微保持架102也可以被成形为与微点106的形状相对应。例如，在微点106是球形的情况下，微保持架102可以是半球形的，诸如在图3b的实施方案中。微保持架102也可以具有抛物线状或透镜状的形状以帮助直射荧光垂直于基底100。微保持架102也可以具有不同的平面轮廓形状(即，垂直于基底100的平面观察的形状)。例如，微保持架102可以包括矩形或方形平面轮廓形状，或六边形平面轮廓形状。从凸起区域104向下延伸的微保持架102的侧面也可以具有不同的深度轮廓形状(即，平行于基底100的平面观察的形状)，例如直线形状、锥形形状、弯曲形状等。
图3a和3b示出了由薄膜形成的基底300的另一实施方案，图3b是图3a中虚线框中示出的部分的细节图。薄膜的实例是聚合物，例如厚度为1～100μm、4～50μm、或10～20μm的环状烯烃共聚物膜，但在其它实施方案中也可以使用其它替代物。在这个例子中，微保持架302可以在膜中压花或热成型。通过引用并入此文中的美国专利公开no.2004/0113316提供了在膜中形成微米规格特性的方法的例子，并且鉴于本发明，其他技术对于本技术领域的普通技术人员来说将是显而易见的。凸起区域304由位于相邻的微保持架302之间的薄膜基底300的间隙部分形成。凸起区域304和微保持架302可以在压花过程、热成型过程或其他过程中同时形成。
每个微保持架302被配置为持有单个微点306。微点306和微保持架302的形状和尺寸可以如上所述选择，或者使用其他标准。在所示的示例中，微点306是球形的，并且微保持架302是半球形的(即圆形的平面轮廓形状和半圆形的深度轮廓形状)，并且尺寸为保持每个微点表面的约50％或更多在基底300上表面以下的微点306。在这种结构中，预期克隆的dna模板集落308将主要存在于微点306的暴露的上表面上。
图3c示出了一个替代实施方案，其中，微保持架314被成形为截头锥形杯(即，锥形或梯形的深度剖面形状)，而不是半球形。图3d示出另一个替代实施方案，其中，微保持架316是圆柱形杯(即，直壁和矩形深度剖面形状)。可选地，微保持架314可以是立方形、六角形或成其它形。这些和其他替代形状可用于上述实施方案中的任何一个或在其他实施方案中。其还可以设想，微保持架302可以包含穿过薄膜基底300的穿孔，在这种情况下，每个微点306都有暴露在基底300下方的一部分将被保留。图3e示出了这种结构的一个例子，其中，微保持架318是具有开口底部320的截头圆锥杯。穿孔微保持架302的使用可以提供更大的通向试剂的入口，扩大在膜基底300中形成微保持架302的可用的技术范围，或者提供其他益处。鉴于本发明，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。
膜基底300可以包括柔性材料，该柔性材料可以以多种不同的方式集成到流动单元中。例如，基底300可以配置在供应辊310上，并在废物辊312上去除。在流动单元中使用薄膜的细节和其他实施方案在2015年12月28日提交的发明人共同申请no.62/271423中提供，其全部内容通过参考文献的方式并入本文。鉴于本发明，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。
基底的实施方案可以配置为以任何适合的方式将微点固定于微保持架中。例如，基底和微点可以通过生物素-链霉亲和素键、共价键、静电相互作用、范德华力等来连接。为此，微保持架和/或微点可以被化学功能化以结合在一起。例如，整个基底可以用键合化学功能化，然后将凸起的区域清除键合化学，以防止其连接除微保持架之外的任何地方。作为另一个示例，可以用掩模(例如，光致抗蚀剂等)来处理基底，以至于在实施键合化学之前覆盖凸起区域。在这个实施方案中，掩模可以是在形成微保持架的初始步骤中使用的相同掩模，在这种情况下，掩模可以被应用，形成微保持架，微保持架被功能化以能够固定微点，然后去除掩模。微点也可以通过重力、磁引力或机械的结合来保留。鉴于本发明，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。
基底的实施方案可以并入在测序仪器等中使用的流动单元中。图4示出了具有流体入口402、流体出口404和从入口402延伸到出口404的封闭通道406的流动单元400。通道406形成在盖408和基部410之间。盖410的至少一部分包括透明窗口，通道406通过该透明窗口可见。流动单元400可以安装在热电加热/冷却装置412(例如，称为“peltier”装置)上，如本领域所知，其被用于热循环流动单元400的内容物。流动单元400可以位于显微镜414或其他用于检测荧光标记以在测序过程中识别每个核碱基延伸的光学仪器之下。流动单元400可以完全或部分地从仪器的其余部分上移除，或者作为仪器的一部分永久地集成。鉴于本发明，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。
在图4的实施方案中，盖408和基部410均如上所述被配置为基底。例如，盖408的内表面(即面对通道406的表面)可以包括被蚀刻以形成多个上部微保持架416的玻璃材料，上部微保持架416被配置为持有微点418的第一群体。类似地，基部410的内表面(即面对通道406的表面)可以包括被蚀刻以形成多个下部微保持架420的金属材料，下部微保持架420被配置为持有微点422第二群体。(此处和其他图示中的微保持架416和微点422的尺寸被极大地夸大，以便于说明。)微点418,422第一和第二群体除了它们在流动细胞400内的固定位置之外，通常可以是相同的，但可以设想，上下微保持架416,420可以被配置为持有不同种类、排列、图案或群体密度的微点422。在其他实施方案中，微保持架可以仅被配置在盖408上或仅在基座410上。
图5示出了结合基底的实施方案的流动单元500的另一示例。再次，流动单元500包括流体入口502、流体出口504和形成从入口502到出口504的流体通道的通道506。通道506配置在至少部分透明的盖子508和基座510之间。流动单元500可以安装在加热装置512上，和显微镜514以下等。
在图5的实施例中，基底516被设置为与基座510和/或盖508连接的独立部件。基底516可以包括一般地刚性的材料，例如塑料、玻璃或金属片，以保持扁平形状。基底516包括多个持有微点520的微保持架518。该布置允许基底516的形状和尺寸被专门设计以适应预先存在的流动单元，并且在测序过程中提供更大的灵活性。例如，流动单元可以具有多种不同的可互换的基底516，以允许仪器操作者选择微保持架之间的数量、几何取向和/或间距。此外，多个不同的基底516(或具有多个不同结构的单个基底516)可以放置在单个流动单元中以同时处理。这可能是特别有用的，以允许基底516的某些部分作为控制区域或作为基底516的其余部分的比较区域。例如，基底516的一部分可以具有较大的间隙间隔g，以提供具有较高的微点差异化品质的区域，从而帮助建立标记荧光强度值基线。在其它实施方案中，也可以使用这种微保持架的间距或其它性质的变化。
图6示出了结合基底的实施方案的流动单元600的另一示例。流动单元600包括流体入口602、流体出口604和形成从入口602到出口604的流体通道的通道606。通道606配置在至少部分透明的盖子608和基座610之间。流动单元600可以安装在加热装置612上，并且在显微镜614以下等。
在该实施方案中，基底616被配置为形成包括持有微点620的微保持架618的薄膜。该膜是柔性的且不必保持平坦的形状而不会通过其他部分保持在适当位置。可以使用任何合适的结构或部件将基底616并入到流动单元600中。例如，基底616可以相对于基部拉伸平，并夹在形成流动单元600周边的垂直壁622和基部610的上表面之间的适当位置。或者，基底616可以通过施加在薄膜两侧的压差保持在适当位置，如本发明人在上述共同申请中所讨论的。鉴于本发明，其他替代方案对于本领域普通技术人员将是显而易见的，且在其他实施方案被讨论和以引用的方式并入前面的公开中。
图7a和7b示出了捕获基底700的另一示例。(为了清楚起见，仅示出基底的一部分。)基底700包含从多个微柱704向上延伸的平坦的下表面702。微柱704被布置成一种形成适合微点708的离散微保持架706图案，以便在基底700上捕获微点708。更具体地说，每个微保持架706形成由多个微柱704包围的开放空间，开放空间的尺寸接受单个微点708。例如，六个微柱704的群可以被布置成六角的图案，以形成直径d1的开口，直径d1大致等于或稍大于微点708的直径d2。如果微点708被预期在其直径d2中具有某种可变性(例如，3％的变异系数，或类似的)，则微保持架有效直径d1可以被选择为包含期望的微点直径d2的期望比例。微保持架706被布置成三角形图案或重复排列的彼此之间为120°的行。这种模式预期为给定的间隙间距g提供最大的微点密度。其他实施方案可以使用其它排列，例如通过微保持架706以方形或彼此相对为90°的行的矩形图案来定向。鉴于本发明，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。
在图7a和7b的实施方案中，微点708可以自由地向下降以接触下表面702，但是并不是在所有实施例中都需要的。此外，其他实施方案可以使用微柱704的不同图案来形成微保持架706，例如在正方形的拐角处的四个微柱704的排列，等等。微点直径d1的特定尺寸可以根据上面讨论的微点尺寸或其它尺寸规格来选择。
微柱704被布置在基底700的其余部分(即，微保持架706之间的部分)中，这样防止微点708掉落到足以被有效捕获的位置。例如，在微保持架706外的区域中，微柱704可以被布置成有效直径d3的重复三角形图案，也即是效直径d3太小而不允许超过约10％或更少的直径d2的微点708掉落至微柱704上平面之下。因此，任何可能停在微保持架706之外的微柱704上的微点708，可以很容易地被试剂或其他溶液的流动或倾斜基底700而冲走。微保持架706之间的基底700的区域在相邻微保持架706之间形成间隙间隔g。间隙间隔g优选等于和更优选地大于微珠直径d2，以帮助防止由间质污染引起的多克隆性。
微柱704的高度h优选地通过向微珠708的运动提供机械阻力在合适位置捕获微球708而被选择。例如，微柱高度h可以等于或更优选大于微点直径d2的一半。作为另一个例子，微柱高度h可以在微点直径d2的50％和100％之间。在其它实施方案中可以使用其他高度。
前述实施方案可以以各种方式进行修改。例如，下表面702可以包括化学处理以在合适位置结合微点708。在这种情况下，微柱704可被用来建立在微点708可以接触下表面702的地方，但是可能不依赖于其在合适位置捕获微点708。因此，微柱高度h可以被减小。还可以修改微保持架706的图案，以获得不同的微点708的分布图案和密度。与本文中描述的其他实施方案一样，可以选择分布图案和密度以最大化微点的数量而增加数据量，减少微点的数量以通过减少串扰等来提高数据精度等。在另一个例子中，微保持架706可具有位于其内的短的微柱以支撑稍微高于下表面702的微点708，这可以增强试剂暴露和模板生长，并且有助于减小也许会反射到下表面的荧光的图案的大小和强度。在另一个例子中，微柱704可以被配置为在与下表面702的不同距离处持有微点708。鉴于本发明，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。
使用微柱704来形成微保持架706有望提供若干益处。例如，微点708将更好的接触试剂，并且可以潜在地生长更大的dna集落，其将在读取过程中提供增强的可见性。此外，过量的试剂可以更容易地被对流流动除去，而不是仅仅依靠扩散。
可以使用任何合适的技术制造具有微柱的基底700。例如，可以使用光刻和电镀方法、薄膜的模塑或热成形、脉冲或时间复用蚀刻、深反应离子蚀刻(以形成模具)等来形成微柱704。鉴于本发明，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。
图8示意性地示出了保持架基底800的另一实施方案，该保持架基底具有从下部表面804向上延伸的呈柱状的微柱802。与先前的实施方案不同，微点806在微反应器802的顶部的合适位置被捕获，例如通过提供合适的化学成分来提供捕获。如本文前面所述，下表面804提供在相邻微点806之间的间隔g。该实施方案可以为微点806提供更大的试剂接触，因为微点806悬浮在周围的间隙下表面804上方，同时仍然保持合适的间隔距离g以减轻由间隙污染引起的多克隆性。
前述说明描述了用于捕获基底的微保持架的三种不同的一般结构：形成延伸到间隙表面之下的孔的微保持架，由形成间隙空间的微柱之间的间隔形成的微保持架，以及通过在柱上捕获微点而形成的微保持架。实施方案可以使用这些结构中的单个结构，或者这些结构中的一个或更多个的组合。
基底和具有基底的流动单元可以以任何合适的方式被使用。在一个例子中，在微点引入流动单元之前，微点可以用特定于目标dna模板的通用dna引物功能化。可以使用任何合适的键，例如共价键、生物素-链霉亲和素键、静电相互作用或范德华力将引物连接到微点上。例如，与引物的共价键可以通过为玻璃和塑料微点表面硅烷化，或通过为金表面硫醇功能化等而形成。鉴于本发明，本领域普通技术人员将理解将引物附着到微点的其他方法。
功能化的微点通过将其引入到流动单元中而被装载，在此，微保持架捕获并固定微点，优选地，每个微保持架不超过一个微点。可以理解的是，一些微保持架可能为空，一些微保持架可能持有多个微点，但其优选地绝大多数微保持架持有单个微点。一旦微点被装载，目标dna模板逐渐加载到流动单元中，从而单个dna模板将结合到每个微点。接下来，每个dna模板在流动单元内扩增，达到引物可用性的程度。在另一个实施方案中，接种过程(装载dna模板)和扩增可以被同时进行。在另一个替代实施方案中，微点在引入流动单元之前被功能化并用dna模板接种。在另一个实施方案中，再其被引入流动单元之前，微点可能被功能化、接种和扩增。鉴于本公开，其他替代方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。边合成边测序是在扩增完成后开始的。
有微保持架和微点的实施方案的上述方法的使用可提供几个好处。例如，扩增的量受在微点暴露的表面上的引物的可用性的限制，而不是扩增时间。这种限制有助于控制和规范扩增过程中形成的不同dna模板集落的大小，使得不同的集落倾向于具有相似的形状和更窄和更均匀的集落大小分布。这有助于在边合成边测序过程中提供更均匀的荧光信号，从而提高碱基对的检测和数据处理。
此外，可以选择微保持架密度和更具体地间隙间隔g的大小，以减少或最小化由间质污染引起的多克隆性(即，在单个微点上的不同dna模板的扩增)的发生率。这也有助于通过去除重叠信号并提高每个微点处信号的纯度来改善数据质量。其预期等于或大于微点直径d的间隙间隔g对此目的是有效的，但也可使用其它间隙间隔g尺寸，例如小于微点直径d的间隔g尺寸。
还可以选择微保持架的分布来改变测序数据的数量和质量。例如，可以使用更密集的间距来增加数量，并且可以使用低密度的间距来增加质量。还可以根据不同应用程序的特殊需要，对微保持架密度进行定制，为在不同的测序应用中的流动单元内产生的数据输出中提供更大的灵活性。基底的实施方案被预期在增加一点或不增加成本或不便的情况下，允许灵活地改变微保持架图案和间距，以在相同的流动单元表面积内实现可变负载量和输出量。此外，微保持架的位置决定dna模板集落的空间分布的事实可以用来简化数据分析过程，因为其能花费更少的计算量来建立每个dna模板集落位置的物理位置，特别是在系统中，其有必要重新登记连续测序周期之间的集落位置。
上述方法的另一个优点是，dna模板集落生长的支持物用引物功能化，且与保留基底分离。因此，引物的浪费较少，不需要额外的步骤从基底上的不希望的位置去除引物，特别是与将功能化凝胶施加到整个基底上然后从所需的dna模板集落之间的区域去除凝胶的系统相比。
此外，虽然本文所描述的实施方案一般在边合成边测序过程的情况下被解释，但是可以理解是，实施方案可以被配置为在需要将微米尺度和纳米尺度对象放置在流动单元中的其他过程中使用。例如，在本发明的另一个实施方案中，与图7a和7b中所示的实施方案类似的具有多个微柱的捕获基底可以被用于微流体颗粒分离和/或至少部分地去除含有目标粒子的乳化样品中的油相。
现在参考图9a至9d，根据本发明的一个实施例，微流控颗粒分离可以通过将期望尺寸和/或形状的微柱904布置成可以引导不同尺寸颗粒(902,903)分离流动的图案而实现。因此，与图7a和7b中所示的实施方案不同，微柱可以不被布置成包括用于捕获微点目的的空间。相反，例如如图9b所示，微流通道901可以提供多个均匀间隔的微柱904。其优选微柱的高度还基本上等于微流通道的高度，使得在流体流动的微粒被迫在微柱之间。图9b提供了图9a中b区内的微柱904的放大图的顶部平面图。(为便于说明，这个和其他图示中的微柱904和颗粒902,903的尺寸被极大地夸大了。)
如图9c的示意图所示，在一个实施方案中的微柱可以为圆柱形，并且在与流体流动900方向垂直的同一柱内的相邻微柱之间的间距可以等于距离g。流体流动方向上的同一排内的相邻微柱中心点之间的距离可以等于距离λ。每个柱中的微柱904也可以以垂直于涉及相邻柱中的微柱904流动的方向移动。例如，垂直于在第一和第二柱中相邻微柱的中心点之间的流动的方向上的距离可以等于距离δ。微柱904的形状以及尺寸g、λ和δ可以变化，以用于提供控制在微流通道中粒子流的分离的微柱阵列。例如，较大尺寸的颗粒902的直径至少是较小尺寸颗粒903的两倍。两种颗粒都可被微流通道901中以流体900的方向的流体携带。然而，由于微柱904的尺寸、形状和排列以及微流通道901的长度，较大尺寸颗粒902可能以角度α与较小尺寸的颗粒903分离。这可能是由于以碰撞的方式沿微柱微柱904的阵列跟踪(tracking)的较大尺寸的颗粒902，但是较小尺寸的颗粒903可以在微柱904之间更平稳地流动，如图9d所示。
在一个应用中，微流体颗粒分离器可用于从样品中提取目标颗粒，如图10中的设备的顶部平面图所示。包含目标微珠902和不希望的较小颗粒903的流体样品可以在端口1003中引入到装置中。运行缓冲液可以被引入端口1002到微流通道1010的顶半部i。流动缓冲液和流体样品的层流将提供在1008方向上的两个基本分离且平行的流体流动分别通过微流通道1010的顶半部i和底半部ii。微流通道1010可以包括微柱阵列(未示出)，其被配置成引起目标微珠902的碰撞流动。应选择微流通道1010的微柱的结构和长度l，使得颗粒的分离角α允许目标微珠902从微流通道1010的底半部ii中的样品流体流动到顶半部i而进入运行缓冲液流中。这允许从设备的出口端口1004中提取和收集目标微珠902，并且通过废物端口1005丢弃不希望的较小颗粒903。如本领域技术人员所理解的，目标颗粒可以可选地是较小尺寸的颗粒，因此，在一些实施例中，从出口端口1004退出的颗粒可能被废弃，并且离开端口1005的较小颗粒可以被收集用于进一步的处理。
如前所述，微柱的尺寸和形状和微柱阵列的结构可以根据目标颗粒的大小和不希望的颗粒修改以提供适当的分离角α。在一些实施方案中，目标颗粒可以包括直径大于或小于不希望的颗粒的微点或微珠。例如，样品流体中的不希望的颗粒可以包括一种或更多种细菌(小于2微米)、白细胞、血小板、红细胞(～3～7微米)、中性粒细胞(～10微米)、寄生虫(12微米)或循环肿瘤细胞(～15微米)。因此，可以调整微柱和/或微柱阵列的形状、间距和尺寸，以优化装置根据生物流体样品的类型将目标颗粒与不希望的颗粒分离的能力。
在一些实施方案中，样品流体可以是乳液的形式，并且乳液分离可以期望与颗粒分离同时进行。因此，在某些实施方案中，微柱可能由疏水材料制成或涂覆有疏水材料以至于能够吸引并保持样品流体中的油相。可用于制造或涂覆微柱阵列的疏水材料可包括本领域技术人员已知的疏水性聚合物或低聚物。正如本领域技术人员所理解的，微柱阵列的设计和结构应考虑到油的保留，以便同时过滤油相和从样品流体中分离出目标颗粒。
在本发明的另一个实施方案中，多个微流体颗粒分离器可以串联放置在单个装置上，如一个卡盒，以便将目标颗粒输送到流动单元。例如，参照图11，提供了卡盒1100的顶部平面视图，包括流动池1128、多个颗粒分离器1104、1114、1122和多个以流体连接的端口1102、1104、1112、1120、1108。第一颗粒分离器1104可以配置为类似于图10所示的分离器。含有目标颗粒的样品流体可通过入口1102引入并输送到包括含有微柱阵列(未示出)的微通道的第一分离器1104。例如，靶粒子可以是如上所述的具有附着引物的微点或微珠。微柱的结构可以允许目标颗粒与样品流体分离，并进入通过缓冲端口1104引入到第一分离器1104的缓冲流体中。当引入进口1102的样品流体为乳液形式，并且希望从样品流体中过滤油相时，第一分离器1104中的微柱阵列可以由疏水材料制造或涂覆。样品流体和废液(包括任何油相)中的不希望的颗粒可以通过与废物端口1108流体连接的出口通道1106而离开第一分离器1104。
然后，将含有目标颗粒的缓冲液输送到含有用于捕获目标颗粒的固体基底的第二分离器1114。目标颗粒可以通过生物素-链霉亲和素键、共价键、静电相互作用、范德华力等结合到固体基底上。目标颗粒可以被第二分离器1114捕获，而运载缓冲液通过出口通道1116排出到废物端口1108。一旦捕获到目标颗粒，可以通过释放缓冲液端口1112引入释放缓冲液，例如naoh，并将其输送到第二分离器1114，以提取所收集的目标颗粒。
携带目标颗粒的释放缓冲液通过入口通道1118到第三分离器1112。第三分离器1122可以配置为类似于第一分离器1104，由于其包括微柱阵列，以引起目标颗粒的碰撞流动，并引起目标颗粒从释放缓冲液扩散到流动单元加样缓冲液，也即是同时地通过流动单元加样缓冲液端口1120引入到第三分离器1122中。释放缓冲液可以通过出口通道1124排出到废物端口1108，且携带目标颗粒的流动单元加样缓冲液可以通过通道1126转移到流动单元1128。为捕获目标颗粒，流动单元1128可以根据先前描述的本发明实施方案来配置。
正如本领域技术人员所理解的那样，分离器可选地在其入口和/或出口处配置微阀，以控制适当类型的缓冲液流体的引入，并防止缓冲流体进入不正确的入口或出口通道。在其它实施方案中，分离器和流动单元可以配置在单独的卡盒上，但是，为了方便，优选地在单个卡盒上设置分离器和流动单元。正如本领域技术人员所能理解的那样，单个卡盒可以设置多于或少于三个分离器。
本发明描述了多个可以单独使用或一起使用的新的、有用的和不明显的特征和/或特征组合。虽然这里描述了某些特征和优点，但可以理解，所描述的特征和优点不可能存在于每个实施方案中。本文中所描述的实施方案都是示范性的，并不旨在限制发明的范围。可以理解的是，本文所描述的发明可以以各种和等效的方式进行修改和调整，并且所有这些修改和调整被包括在本发明和附加的权利要求的范围中。