本发明涉及用于发酵微生物的发酵过程。具体而言，本发明涉及具有改善的生物质产量和增加的微生物(例如细菌菌株，例如甲烷营养细菌菌株)生长速率的发酵过程。
发明背景
已知许多微生物例如细菌通过发酵来利用甲烷气体。通常，甲烷营养细菌消耗甲烷作为唯一碳源和能源。在这个过程中，甲烷可以直接供给或从天然气供给，为此目的，需要纯的或共同培养的细菌共生体来支持连续培养中较长时期的生长。
传统上，在连续培养开始前5-6天的初始启动时间的条件下，由天然气或甲烷的单细胞蛋白(scp)的生产或发酵使用单一碳源，即甲烷。传统上，以干物质计，在稳定状态下达到的生物质产量约为1.5-2.5g/l。为了提高传统发酵过程的发酵效率，用于scp生产的甲烷利用过程应该非常有效。
在传统发酵过程中，如涉及甲烷营养细菌菌株的发酵过程，微生物产生释放到发酵液中的二氧化碳(co2)。因此，传统上认为co2是废气。因此，为了改善发酵过程的生产率，传统过程教导了要从发酵罐中去除co2，例如，从u型环管反应器的顶部空间去除co2，以改善生产率。
此外，用于生产发酵蛋白质来源例如用于动物饲料的建设成本和运营成本是相当高的，同时对质量、标准和法规以及每公斤蛋白质的低价格的需求和要求越来越高。因此，要建立有利润的业务是个挑战，甚至效率的小的改善或者降低生产成本可能会对生产者的收入产生重大影响。
因此，对于改善的发酵过程，该行业存在需求和利益。具体而言，在该行业中需要更有效的发酵过程，其将导致改善的生物质产量和增加的微生物生长速率而不损害行业的要求和需求，所述微生物例如细菌菌株，例如甲烷营养细菌菌株。
发明概述
因此，本发明的目的涉及用于发酵微生物的发酵过程。
具体而言，本发明的目的是提供具有改善的生物质产量和增加的微生物生长速率的发酵过程，所述微生物例如细菌菌株，例如甲烷营养细菌菌株。
因此，本发明的一个方面涉及用于改善发酵过程中生物质产量和/或微生物生长速率的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供一种或多种微生物；
(ii)提供适于发酵所述一种或多种微生物的发酵底物；
(iii)混合所述一种或多种微生物和所述发酵底物，提供发酵液；
(iv)将发酵液加至发酵罐；
(v)将至少一种气体底物注入发酵液中；
(vi)运行发酵过程持续至少1小时的发酵时间；
其中所述至少一种气体底物包含一种或多种温室气体，例如二氧化碳(co2)。
本发明的另一方面涉及用于改善发酵过程中生物质产量和/或微生物生长速率的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供一种或多种微生物；
(ii)提供适于发酵所述一种或多种微生物的发酵底物；
(iii)混合所述一种或多种微生物和所述发酵底物，提供发酵液；
(iv)将发酵液加至发酵罐；
(v)将至少一种气体底物注入发酵液中；
(vi)运行发酵过程持续至少1小时的发酵时间；
其中所述至少一种气体底物包含两种或更多种碳源的组合。
本发明的又一方面涉及发酵罐，其包括用于将至少一种气体底物注入发酵罐中的入口，其中所述至少一种气体底物包含二氧化碳(co2)。
本发明的另一方面涉及通过根据本发明的方法可获得的包含一种或多种微生物的组合物。
附图简述
图1显示在1l发酵罐中(a)使用传统方法使用甲烷(图1a)或使用甲烷和co2的组合作为碳源生长的荚膜甲基球菌(m.capsulatus)。在使用0.05h-1的稀释速率分批生长最少4-5天，通常平均7-8天之后开始连续培养。干燥细胞重量(空心方块)和在550nm培养物的光学密度(空心密度)(od550)测量结果显示最大约0.04h-1并且平均为0.025的比生长速率(specificgrowthrate)。稳定状态下的生物质浓度平均为1.5-2.5g/l，数据未显示，和(b)使用根据本发明的发酵过程。仅1天后开始连续培养，这是由于高的比生长速率(约0.16h-1；-基于干燥细胞重量和od550数据)，并且使用0.05h-1的稀释速率。稳定状态生物质浓度至少为4g/l，数据未显示。
现在将在下面更详细地描述本发明。
本发明的详细描述
因此，本发明涉及已经开发用于微生物发酵的发酵方法，所述微生物例如细菌菌株，例如甲基球菌(methylococcaceae)科或甲基孢囊菌(methylocystaceae)科的甲烷营养细菌菌株，其在含有碳源、氮源和无机盐的发酵罐中培养。该方法可以是半需氧过程(sap)。发酵方法可能导致与传统发酵过程相比至少4倍的更高生长速率和/或至少1.5倍的更高生物质产量。本发明的发明人令人惊讶地发现二氧化碳对本发明获得的改善的生物质产量和增加的生长速率具有显著的影响。因此，本发明的过程不仅显示出用于近期未来食物要求的蛋白质产量的显著改善(由改善的生物质产量和增加的生长速率证明)，而且本发明还证明其本身对减少环境污染有效，因为发酵过程涉及温室气体(如co2)的消耗。
因此，本发明的优选实施方案涉及用于改善发酵过程中生物质产量和/或微生物生长速率的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供一种或多种微生物；
(ii)提供适于发酵所述一种或多种微生物的发酵底物；
(iii)混合所述一种或多种微生物和所述发酵底物，提供发酵液；
(iv)将发酵液加至发酵罐；
(v)将至少一种气体底物注入发酵液中；
(vi)运行发酵过程持续至少1小时的发酵时间；
其中所述至少一种气体底物包含一种或多种温室气体，例如二氧化碳(co2)。
在本发明的实施方案中，所述气体底物还包含烷烃，优选所述烷烃为c1化合物。
本发明进一步优选的实施方案涉及用于改善发酵过程中生物质产量和/或微生物生长速率的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供一种或多种微生物；
(ii)提供适于发酵所述一种或多种微生物的发酵底物；
(iii)混合所述一种或多种微生物和所述发酵底物，提供发酵液；
(iv)将发酵液加至发酵罐；
(v)将至少一种气体底物注入发酵液中；
(vi)运行发酵过程持续至少1小时的发酵时间；
其中所述至少一种气体底物包含两种或更多种碳源的组合。
在本发明的实施方案中，所述至少一种气体底物可以包含一种或多种温室气体，例如二氧化碳(co2)。
在本发明的另一个实施方案中，气体底物包含至少0.05%二氧化碳，例如至少0.075%二氧化碳，例如至少0.1%二氧化碳，例如至少0.2%二氧化碳，例如至少0.3%二氧化碳，例如至少0.4%二氧化碳，例如至少0.5%二氧化碳，例如至少0.6%二氧化碳，例如至少0.7%二氧化碳，例如至少0.8%二氧化碳，例如至少0.9%二氧化碳，例如至少1.0%二氧化碳，例如至少1.25%二氧化碳，例如至少1.5%二氧化碳，例如至少1.75%二氧化碳，例如至少2.0%二氧化碳，例如至少2.5%二氧化碳，例如至少3.0%二氧化碳，例如至少3.5%二氧化碳，例如至少4.0%二氧化碳，例如至少4.5%二氧化碳，例如至少5.5%二氧化碳，例如至少6.0%二氧化碳，例如至少6.5%二氧化碳，例如至少7.0%二氧化碳，例如至少7.5%二氧化碳，例如至少8.0%二氧化碳。
气体底物和温室气体例如co2可被注入发酵液中。优选地，注入发酵液中的气体底物和温室气体例如co2的量为至少0.001l/min/l发酵液，例如至少0.005l/min/l发酵液，例如至少0.01l/min/l发酵液，例如至少0.05l/min/l发酵液，例如至少0.1l/min/l发酵液，例如至少0.13l/min/l发酵液，例如至少0.15l/min/l发酵液，例如至少0.2l/min/l发酵液，例如至少0.25l/min/l发酵液，例如至少0.3l/min/l发酵液，例如至少0.4l/min/l发酵液，例如至少0.5l/min/l发酵液，例如至少0.60l/min/l发酵液，例如至少0.7l/min/l发酵液，例如至少0.75l/min/l发酵液。
在本发明的另一个实施方案中，两种或更多种碳源的组合包含一种或多种温室气体例如二氧化碳(co2)与一种或多种烷烃的组合。
该烷烃可以优选为c1化合物和/或c1烷烃。优选地，c1化合物和/或c1烷烃可以是甲烷、甲醇、天然气、生物气、合成气或其任何组合。甚至更优选地，c1化合物和/或c1烷烃可以是甲烷。
在本发明的实施方案中，气体底物包含二氧化碳和烷烃，以重量:重量计，二氧化碳和烷烃的比率为1份二氧化碳比约1份烷烃，例如1份二氧化碳比约1.5份烷烃，1份二氧化碳比约2份烷烃，1份二氧化碳比约2.5份烷烃，1份二氧化碳比约3份烷烃。
气体底物还包含至少一种氮源。优选至少一种氮源可以选自氨、硝酸盐、分子氮及其组合。优选地，氮源是氨和硝酸盐的组合。
气体底物可以进一步包含氧气。优选地，氧气可以作为大气空气、纯氧或富含氧气的空气提供。
在本发明的实施方案中，气体底物可以具有的氧气优选大气空气含量在以下范围内：c1烷烃优选甲烷含量的2-15倍高(vol/vol)；例如3-12倍高(vol/vol)；例如4-10倍高(vol/vol)；例如5-9倍高(vol/vol)；例如6-8倍高(vol/vol)。
在本发明的另一个实施方案中，气体底物可以具有的氧气优选大气空气含量在以下范围内：温室气体优选二氧化碳含量的5-25倍高(vol/vol)；例如7-20倍高(vol/vol)；例如9-15倍高(vol/vol)；例如10-14倍高(vol/vol)；例如11-13倍高(vol/vol)。
在本上下文中，术语“发酵底物”涉及包含微生物生长所需的可溶性组分的液体介质，优选水性介质。
在发酵过程中，碳源、氮源和/或氧源被提供在气体底物中。为了使碳源、氮源和/或氧源对于微生物而言在发酵过程中变得容易获得，应使气体底物可溶于发酵液中。
液体中的气泡倾向于融合在一起形成较大的气泡(聚结)，为了避免气泡的聚结，可以提供混合器，例如静态气体混合器或挡板，用于气体在发酵液中的再分散。
可有利地分散在液体中的气体的量可取决于静液压。因此在高反应器的情况下，在降液部分具有数个用于引入气体的位置将是有利的。优选地，至少一个静态混合元件可以放置在每个入口一定距离处或紧接在每个入口之后以将气体分散到发酵液中。
所述一种或多种微生物与发酵底物混合提供发酵液可以在发酵罐的外部或在发酵罐的内部完成。在本发明的实施方案中，所述一种或多种微生物与发酵底物混合提供发酵液可以在发酵罐中完成。
在本发明的实施方案中，发酵过程可以是分批发酵、分批进料或连续发酵过程。优选地，发酵过程可以是连续发酵过程。
在本发明的另一个实施方案中，连续发酵过程可以以恒化(chemostat)、恒ph(ph-stat)、恒产出(productstat)或其它连续发酵过程模式进行。
在本发明的优选实施方案中，发酵过程在气升式反应器(发酵罐为气升式反应器)，环管反应器(发酵罐为环管反应器)，u型反应器(发酵罐为u形反应器)和/或搅拌釜反应器(发酵罐为搅拌釜反应器)中进行。
在实施方案中，发酵液可以经受混合。优选地，发酵罐包含一个或多个适用于混合发酵液的混合器。在本发明的实施方案中，发酵罐包含至少一个与用于引入气体底物的气体入口紧密连接，优选在其下游的混合器。
增加气体底物在发酵液中溶解度的一种方法是增加静液压。在本发明的实施方案中，发酵液和气体底物的压力增加至相对于发酵罐外部的压力至少1.5巴；例如至少1.75巴；例如至少2.0巴；例如至少2.5巴；例如至少3.0巴；例如至少3.5巴；例如至少4.0巴；例如至少4.5巴；例如至少5.0巴；例如至少5.5巴；例如至少6.0巴；例如至少7.0巴；例如至少8.0巴；例如至少9.0巴；例如至少10.0巴的过压。
各种发酵条件的组合取决于微生物在发酵罐中的生长。
微生物选自细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞或动物细胞。优选地，微生物可以是细菌细胞。
在本发明的实施方案中，细菌细胞可以是甲烷营养细菌细胞。
在本发明的又一个实施方案中，细菌细胞可以是选自甲基球菌(methylococcus)菌株的甲烷营养细菌细胞。
在本发明的另一个实施方案中，甲基球菌菌株可以是荚膜甲基球菌(methylococcuscapsulatus)。
在本发明的另一个实施方案中，细菌细胞(优选地，当在天然气存在下生长时)选自荚膜甲基球菌；alcaligenacidovorans(优选ncimb13287)；强固芽胞杆菌(bacillusfirmus)(优选ncimb13280)；和/或aneurobacillusdanicus(优选ncimb13288)。优选地，细菌细胞是荚膜甲基球菌、alcaligenacidovorans(优选ncimb13287)、强固芽胞杆菌(bacillusfirmus)(优选ncimb13280)和aneurobacillusdanicus(优选ncimb13288)的组合。
在本发明的优选实施方案中，发酵可以使用二氧化碳(co2)和(a)甲烷营养细菌和甲烷或(b)甲烷营养细菌，alcaligenacidovorans(优选ncimb13287)、强固芽胞杆菌(bacillusfirmus)(优选ncimb13280)；和/或aneurobacillusdanicus(优选ncimb13288)和天然气的组合开始。在该起始程序之后，发酵可以作为稳定状态的发酵而继续，其中碳源是天然气，添加alcaligenacidovorans(优选ncimb13287)；强固芽胞杆菌(bacillusfirmus)(优选ncimb13280)；和/或aneurobacillusdanicus(优选ncimb13288)(如果没有在早先添加)，不另外添加co2。
如前所述，根据本发明的方法导致改善的生物质产量和增加的微生物生长速率，所述微生物例如细菌菌株，例如甲烷营养细菌菌株。
在本发明的优选实施方案中，本发明的方法提供了发酵过程期间以下所述的微生物生长速率：至少0.04h-1，例如至少0.05h-1，例如至少0.06h-1，例如至少0.08h-1，例如至少0.10h-1，例如至少0.12h-1，例如至少0.14h-1，例如至少0.15h-1，例如至少0.16h-1，例如至少0.17h-1，例如至少0.18h-1，例如至少0.19h-1，例如至少0.20h-1，例如至少0.22h-1，例如至少0.25h-1，例如至少0.27h-1，例如至少0.30h-1，例如至少0.32h-1，例如至少0.35h-1，例如至少0.37h-1。
在本发明的另一个优选实施方案中，可以提供以干物质计至少2.5g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少2.6g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少2.7g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少2.8g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少2.9g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少3.0g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少3.5g/l的生物质产量，例如提供以干物质计至少4.0g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少4.5g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少5.0g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少5.5g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少6.0g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少6.5g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少7.0g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少7.5g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少10.0g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少12.5g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少15.0g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少17.5g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少20.0g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少22.5g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少25.0g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少27.5g/l的生物质产量，例如可以提供以干物质计至少30.0g/l的生物质产量。
本发明的发明人发现，除了改善的生物质产量和增加的生长速率之外，高生物质产量(或最大生物质产量(基于干物质以g/l计)可以比传统方法显著更快地获得。因此，在本发明的实施方案中，高生物质产量(或最大生物质产量(基于干物质以g/l计)可以在小于5天，例如在小于4天，例如在小于3天，例如在小于2天，例如在小于24小时，例如在小于20小时，例如在小于16小时，例如在小于14小时，例如在小于12小时，例如在小于10小时，例如在小于8小时内获得。
在本发明的实施方案中，以干物质计至少3.5g/l的生物质产量在小于24小时内提供，例如以干物质计至少4.0g/l的生物质产量在小于20小时内提供，例如以干物质计至少4.5g/l的生物质产量在小于14小时内提供，例如以干物质计至少5.0g/l的生物质产量在小于10小时内提供，例如以干物质计至少5.5g/l的生物质产量在小于8小时内提供。
为了提供根据本发明的新方法，开发了新的发酵罐。因此，在本发明的优选实施方案中，提供了发酵罐。发酵罐包括用于将至少一种气体底物注入发酵罐中的入口，其中所述至少一种气体底物包含二氧化碳(co2)。
在本发明的优选实施方案中，发酵罐是气升式反应器、环管反应器、u型反应器或搅拌釜反应器。
为了改善溶解的气体(溶解的气体底物)的量，根据本发明的发酵罐可以进一步包括一个或多个混合装置。优选地，所述一个或多个混合装置可以是静态混合装置，或挡板和/或主动混合装置。
为了进一步改善发酵过程，发酵罐可以进一步包括一个或多个传感器。所述传感器可适用于测定气体(如co2、甲烷、氧气等)、营养、矿物质、ph等。
在本发明的实施方案中，所述一个或多个传感器包括co2传感器。
在本发明的另一个实施方案中，所述一个或多个传感器包括用于测定溶解的co2的传感器。
根据本发明，该方法可以用于在培养基中将诸如co2的温室气体转化成生物质和/或蛋白质，和/或用于减少温室气体例如co2的含量。
应该注意的是，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其它方面。
现在将在下面的非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1
实施例1的目的是证明本发明获得的改善的生物质产量和增加的生长速率。与传统过程相比，使用半需氧过程以分批发酵和连续培养下的稳定状态进行发酵。
材料和方法：
提供甲烷营养细菌菌株(荚膜甲基球菌)。该菌株(ncimb11132)由ncimb(nationalcollectionofindustrial,foodandmarinebacteria,aberdeen,scotland)提供，并且在本发明全部工作中用于根据本发明的发酵过程和传统的发酵过程两者。还提供了三种其它菌株alcaligenacidovorans(ncimb13287)、强固芽胞杆菌(bacillusfirmus)(ncimb13280)和aneurobacillusdanicus(ncimb13288)，当天然气用作碳源时与荚膜甲基球菌一起用于本研究。
对于根据本发明的方法，可以将菌株直接加入发酵过程(作为甘油储备添加)，并且可以在分批发酵仅1天后开始连续培养，而使用相同接种量的传统发酵在分批阶段培养至少5-7天，然后将模式转换为连续培养。
使用的碳源是甲烷(实验1a)、甲烷和co2(实验1b)或天然气和co2(实验1c)。
所用实验中使用的氮源是硝酸盐、氨或硝酸铵。
在实验(根据本发明的方法和传统方法)中进行的培养在具有1l工作体积的基本培养基的分批发酵罐中以三个生物学重复样品进行，开始连续培养。发酵罐(发酵罐)与部分基本培养基成分高压灭菌。在添加单独高压灭菌的其它部分基本培养基后，用5%洗涤的预培养物接种发酵罐。通气速率是1.5空气体积/培养悬浮液体积/分钟(vvm)。传统实验1a的甲烷流量为0.36l/min，实验1b的甲烷流量为0.23l/min，实验1c具有0.29l/min的天然气流量，用于根据本发明的方法。对于根据本发明的方法，为实验1c注入0.145l/min的co2，为实验1b注入0.13l/min的co2。通过自动加入2nnaoh或2nh2so4将培养基的ph保持在6.8，并且整个培养期间的温度始终保持在42℃。通过用空气和n2充气进行溶解氧校准。搅拌速度保持在600转/分钟(rpm)。连续培养期间的稀释速率为0.05h-1。
结果
该表说明了单独使用荚膜甲基球菌的生物学培养或荚膜甲基球菌与alcaligenacidovorans(ncimb13287)、强固芽胞杆菌(bacillusfirmus)(ncimb13280)和aneurobacillusdanicus(ncimb13288)组合的三份培养的实验值。ss意指稳定状态发酵。分批意指分批发酵。字母a、b、c、d和e涉及相应化合物的化学计量系数，以摩尔/摩尔甲烷消耗计。字母“μ”涉及比生长速率。
讨论
发酵期间提供的化学转化的理论化学计量可以书写如下：
ch4+ao2+bnano3/nh3/nh4no3+cco2->dch1.8o0.5n0.2+eco2+fh2o
ch4是甲烷；o2是氧气；nano3是硝酸钠；nh3是氨；nh4no3是硝酸铵；co2是二氧化碳；ch1.8o0.5n0.2是生物质；h2o是水。
字母a、b、c、d、e和f涉及相应化合物的化学计量系数，以摩尔/摩尔甲烷消耗计。
已经对于在不同氮源下有或没有二氧化碳(co2)的过程进行了理论化学计量衡算。
该表说明了基于不同碳源和氮源的不同化学计量的理论值：
*假设相对于甲烷消耗的生物质产率-产率系数(d)为0.52(mol/mol)。
在2种不同条件下(具有co2(本发明的方法)或没有co2(传统方法))用不同类型的氮源(硝酸盐、氨或硝酸铵)在特定的基本培养基中，使荚膜甲基球菌单独生长或与3种其它细菌菌株(alcaligenacidovorans(ncimb13287)、强固芽胞杆菌(bacillusfirmus)(ncimb13280)和aneurobacillusdanicus(ncimb13288))一起生长。在本发明的方法中，在分批阶段每2-3小时监测生物质的光学密度和干燥细胞重量以及甲烷和二氧化碳(co2)的消耗。由于生长较慢，对于没有co2的传统过程，取样频率较低。在没有使用co2的情况下，从该过程获得的生长速率没有显示出改善，并且花费了至少6天生长(未显示)，而使用碳源如天然气与co2一起导致明显更快的生长，最大的比生长速率为0.16h-1(见结果表格)。从100l工作体积的u型环管发酵罐也获得了同样的结果。
图1显示在1l发酵罐中(a)使用传统方法使用甲烷作为唯一碳源的荚膜甲基球菌生长。在使用0.05h-1的稀释速率分批生长4-5天之后开始连续培养。干燥细胞重量和培养物在550nm的光学密度(od550)测量结果显示约0.04h-1的比生长速率。稳定状态下的生物质浓度为2-2.5g/l，数据未显示，且(b)使用根据本发明的发酵过程。仅1天后开始连续培养，这是由于高的比生长速率(约0.16h-1；基于干燥细胞重量和od550数据)，并且使用0.05h-1的稀释速率。稳定状态生物质浓度为4g/l，数据未显示。
结果清楚地表明，与传统的发酵过程相比，根据本发明在加入co2的情况下微生物如甲烷营养细菌(甲基球菌)，例如荚膜甲基球菌的培养可显著改善，并且每克蛋白质的生产成本可显著降低。