斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用与制造工艺

文档序号:11145299
斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用与制造工艺
本发明属于生物技术领域,具体地说,涉及斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用。

背景技术:
斯氏副柔线虫病由斯氏副柔线虫(Parabronemaskrjabini)寄生于骆驼、羊、牛等反刍动物真胃引起,尤以骆驼感染较为严重。大量虫体寄生可导致患畜真胃发生炎症、出血、溃疡,严重者造成骆驼死亡,对养驼业危害极大,是危害我国养驼业的一种主要寄生虫病,长期以来,给农牧民带来了巨大的经济损失。因此,今后对斯氏副柔线虫病的监测和防制是骆驼等反刍动物寄生虫病防治中的重点。由于世界上绝大多数骆驼都分布在第三世界国家的落后地区,所以时至今日,国内外关于斯氏副柔线虫病的研究报道较少。严重危害我国骆驼养殖业的斯氏副柔线虫病的相关研究滞后,在斯氏副柔线虫病的防治上,目前存在的主要问题是缺少针对该病的基础理论研究、缺乏有效的生前诊断方法和防治的新方法。适用于许多寄生性线虫的粪便虫卵检查法用于该病的诊断,检出率非常低,很难用于临床实践。该病的诊断主要依靠死后剖检(在真胃查找虫体),此类诊断方法不能为早期治疗提供参考。在实际的生产中,往往是在没有诊断依据的情况下盲目地给药驱虫,造成经济损失的同时也带来了诸如毒副作用、出现耐药虫株和畜产品药物残留超标等诸多弊端。当前,在生产实践中亟待研究斯氏副柔线虫病的生前诊断方法,为该病的防制提供科学依据,使该病的防制更有针对性,提高防制效果,避免不必要的经济投入,同时为该病的监测提供科学的技术手段。

技术实现要素:
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷,提供斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用。该方法通过斯氏副柔线虫转录组测序预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析,找出斯氏副柔线虫特有基因并进行功能注释,用RT-PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPI,克隆测序后,构建到原核表达载体pET30a中,转化至E.coliBL21(DE3),进行诱导表达,用western-bloting法验证Pj_CPI重组蛋白的免疫原性。其具体技术方案为:斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因,其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的编码蛋白,其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。用于扩增权利要求1所述权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的特异性PCR引物,其核苷酸序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示。本发明所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因在检测和防治家畜斯氏副柔线虫感染过程中的应用。斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的克隆、重组表达方法,包括以下步骤:步骤1、引物设计根据Pj_CPI的基因序列,用Oligo6.0设计引物,分别在上游引物和下游引物中插入限制性内切酶EcoRI、XhoI酶切位点,引物的合成由华大基因有限公司完成。步骤2、斯氏副柔线虫总RNA的提取按照TaKaRaRNAisoPlusRNA提取试剂说明书提取斯氏副柔线虫总RNA,具体步骤如下:1.样品的研磨和匀浆:将液氮中保存的斯氏副柔线虫样品迅速转移至液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状。然后,向研钵中加入适量的RNAisoPlus,反复吹打,至均一透明;然后,将匀浆液转移至离心管中,室温(15-30℃)静置5min;12000g4℃离心5min;小心吸取上清液,移入新的离心管中。2.总RNA的提取:向上述匀浆裂解液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5体积量),盖紧离心管盖,混合至溶液乳化呈乳白色;室温静置5min;12000g4℃离心15min;从离心机中小心取出离心管(此时匀浆液分为三层,即:无色含RNA的上清液、中间白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。)吸取上清液转移至另一新的离心管中;向上清中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,室温下静置10min;12000g4℃离心10min。3.RNA沉淀的清洗:小心弃去上清液。加入与RNAisoPlus等量的75%乙醇,轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,7500g4℃离心5min后小心弃去上清液。4.RNA的溶解:打开离心管盖,室温干燥沉淀数分钟;沉淀干燥后,加入适量的RNase-free水溶解沉淀。步骤3、Pj_CPI基因RT-PCR扩增以提取的斯氏副柔线虫总RNA为模板反转录为cDNA,然后以cDNA为模板,用上述设计的特异性引物PCR扩增Pj_CPI基因并对其特有性进行验证。PCR扩增反应条件为:预变性94℃5min;变性94℃30sec,退火57℃1min,延伸72℃1.5min,35个循环;再延伸72℃10min。PCR扩增结束后,进行琼脂糖凝胶电泳检测。步骤4、PCR产物回收按照AxygenPCR产物回收试剂盒说明书操作,回收Pj_CPI基因PCR产物。步骤5、PCR回收产物与pMD19-TSimple载体的连接取200μL离心管加1μLpMD19-TSimpleVector、4μLPCR回收产物和5μLSolutionⅠ,离心混匀,16℃过夜连接。步骤6、重组质粒的转化按照北京全式金生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作,将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中,涂布于含抗生素(Amp)的固体LB培养基上,37℃培养过夜。步骤7、重组克隆菌PCR鉴定挑取阳性菌落,接种到含抗生素的液体LB培养基中培养过夜,以培养物做PCR扩增鉴定。步骤8、重组克隆质粒的双酶切鉴定按照Axygen质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒,用限制性内切酶XhoI和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切和电泳检测。步骤9、重组克隆菌测序经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组克隆菌,送北京华大基因公司进行双向测序。步骤10、目的基因与表达载体pET30a的回收将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌株分别接种于LB培养基中培养过夜,分别提取质粒,用限制性内切酶XhoI和EcoRⅠ对重组克隆质粒和pET30a质粒进行双酶切和电泳检测,胶回收目的基因片段和pET30a片段。步骤11、目的基因与表达载体pET30a的连接取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μLpET30a表达载体片段、1μLT4DNA连接酶和1μLbuffer,16℃连接过夜;构建重组表达质粒(pET30a-Pj_CPI,以下简称为pETCPI)如SEQIDNO:2所示。步骤12、重组表达质粒转化感受态细胞按照北京全式金(TransGenBiotech)生物技术有限公司E.coliBL21(DE3)感受态细胞使用说明书操作,将连接产物转化于E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,涂布于含抗生素的固体LB培养基上37℃培养过夜。步骤13、重组表达菌的鉴定对构建的重组表达菌E.coliBL21(pETCPI),以下简称BL21(pETCPI)进行PCR鉴定和双酶切鉴定,经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组表达菌,送北京华大基因公司进行双向测序,具体步骤如步骤7、步骤8和步骤9所述。步骤14、重组表达菌诱导表达条件的优化分别对重组表达菌诱导表达时间、诱导剂IPTG浓度以及培养温度进行优化,确定最佳诱导表达条件。步骤15、重组蛋白表达形式的检测确定重组蛋白最佳诱导条件后,诱导表达500mL重组菌,离心收集菌体,将菌体沉淀用PBS洗3遍后,用PBS重悬沉淀,加入溶菌酶,常温放置1h,-20℃反复冻融,冰浴超声破碎15min,12000g离心10min,收集沉淀和上清,加入蛋白上样缓冲液煮沸10min,12%SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式。步骤16、重组蛋白包涵体溶解及重组蛋白纯化按最佳诱导条件诱导重组表达菌1L,12000g离心10min收集菌体,按上述方法裂解重组表达菌,离心收集裂解物沉淀,将沉淀用8M尿素溶解,12000g低温离心10min,收集上清液,用0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化试剂盒操作步骤纯化重组蛋白。步骤17、重组蛋白westernblotting检测将纯化出的重组Pj_CPI蛋白(以下简称rCPI)进行SDS-PAGE电泳,从制胶板上将蛋白质胶取出,在夹子上放置滤纸、PVDF膜、蛋白胶、滤纸,按顺序放好夹住,100V40min转膜;转膜后取出PVDF膜TBST洗涤4min,重复3~4遍,用现配的5%脱脂乳封闭液常温微摇封闭2h;取出PVDF膜TBST洗涤4min,重复3~4遍,将PVDF膜在1:2000稀释的感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中4℃孵育过夜;取出PVDF膜TBST洗4min,重复3~4遍,将PVDF膜在辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼多克隆抗体中常温微摇孵育1h;取出PVDF膜TBST洗涤4min,重复3~4遍,用ECL显色后照相。与现有技术相比,本发明的优势所在:本发明通过斯氏副柔线虫转录组测序,预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析,找出斯氏副柔线虫特有基因,用RT-PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPI,克隆测序后,构建到原核表达载体pET30a中,转化至E.coliBL21(DE3),进行诱导表达,用western-bloting法验证Pj_CPI重组蛋白的免疫原性。本发明所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因及其编码产物在检测家畜斯氏副柔线虫感染过程中的应用,能诊断斯氏副柔线虫的感染,且该方法具有较高的特异性、敏感性和较好的重复性。附图说明图1是本发明实施例1中斯氏副柔线虫特有基因Pj_CPI的PCR检测结果;其中,M为DNAMarkerDL10000;1为捻转血矛线虫;2为斯氏副柔线虫;3为秀丽隐杆线虫;4为盘尾丝虫。图2为本发明实施例1中基因Pj_CPI的PCR扩增电泳图;其中,M为DNAMarkerDL10000;1-2为基因Pj_CPI;3为空白对照。图3为本发明实施例1中重组克隆质粒双酶切鉴定结果;其中,M为DNAMarkerDL2000;1-3为Pj_CPI基因克隆质粒。图4为本发明实施例1中重组表达质粒pETCPI双酶切鉴定结果;其中,M1为DNAMarkerDL2000;M2为DNAMarkerDL10000;1-3为重组表达质粒pETCPI。图5为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETCPI)最佳诱导表达SDS-PAGE电泳结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21(DE3)空菌;2为BL21(pET30)诱导前;3为BL21(pET30)诱导后;4为BL21(pETCPI)诱导前表达菌;5-6为BL21(pETCPI)在25℃,1mMIPTG浓度,诱导4h后,诱导表达菌。图6为本发明实施例1中重组蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳检测结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21(pETCPI)菌体裂解物上清;2为BL21(pETCPI)菌体裂解物沉淀。图7为本发明实施例1中重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳检测结果;其中,M1为蛋白质marker(10kDa-170kDa);M2为蛋白质marker(14.9kDa-97.2kDa);1-2为纯化的重组蛋白rCPI。图8为本发明实施例1中重组蛋白His标签Western-bloting检测结果;其中,M为蛋白质marker;1-2为纯化重组蛋白rCPI。图9为本发明实施例1中纯化重组蛋白rCPI与感染斯氏副柔线...
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