斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用与流程

文档序号:11145299阅读:来源:国知局

技术特征:

1.斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的编码蛋白,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.用于扩增权利要求1所述权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的特异性PCR引物,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。

4.权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因在检测和防治家畜斯氏副柔线虫感染过程中的应用。

5.斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤1、引物设计

根据Pj_CPI的基因序列,用Oligo6.0设计引物,分别在上游引物和下游引物中插入限制性内切酶EcoR I、Xho I酶切位点,引物的合成由华大基因有限公司完成;

步骤2、斯氏副柔线虫总RNA的提取

按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取试剂说明书提取斯氏副柔线虫总RNA,具体步骤如下:

21)样品的研磨和匀浆:将液氮中保存的斯氏副柔线虫样品迅速转移至液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状;然后,向研钵中加入适量的RNAiso Plus,反复吹打,至均一透明;然后,将匀浆液转移至离心管中,室温15-30℃静置5min;12000g 4℃离心5min;小心吸取上清液,移入新的离心管中;

22)总RNA的提取:向上述匀浆裂解液中加入氯仿,RNAiso Plus的1/5体积量,盖紧离心管盖,混合至溶液乳化呈乳白色;室温静置5min;12000g 4℃离心15min;从离心机中小心取出离心管吸取上清液转移至另一新的离心管中;向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,室温下静置10min;12000g 4℃离心10min;

23)RNA沉淀的清洗:小心弃去上清液;加入与RNAiso Plus等量的75%乙醇,轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,7500g 4℃离心5min后小心弃去上清液;

24)RNA的溶解:打开离心管盖,室温干燥沉淀数分钟;沉淀干燥后,加入适量的RNase-free水溶解沉淀;

步骤3、Pj_CPI基因RT-PCR扩增

以提取的斯氏副柔线虫总RNA为模板反转录为cDNA,然后以cDNA为模板,用上述设计的特异性引物PCR扩增Pj_CPI基因并对其特有性进行验证;PCR扩增反应条件为:预变性94℃5min;变性94℃30sec,退火57℃1min,延伸72℃1.5min,35个循环;再延伸72℃10min;PCR扩增结束后,进行琼脂糖凝胶电泳检测;

步骤4、PCR产物回收

按照Axygen PCR产物回收试剂盒说明书操作,回收Pj_CPI基因PCR产物;

步骤5、PCR回收产物与pMD19-T Simple载体的连接

取200μL离心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收产物和5μL Solution Ⅰ,离心混匀,16℃过夜连接;

步骤6、重组质粒的转化

按照北京全式金生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作,将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中,涂布于含抗生素Amp的固体LB培养基上,37℃培养过夜;

步骤7、重组克隆菌PCR鉴定

挑取阳性菌落,接种到含抗生素的液体LB培养基中培养过夜,以培养物做PCR扩增鉴定;

步骤8、重组克隆质粒的双酶切鉴定

按照Axygen质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR Ⅰ对重组质粒进行双酶切和电泳检测;

步骤9、重组克隆菌测序

经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组克隆菌,送北京华大基因公司进行双向测序;

步骤10、目的基因与表达载体pET30a的回收

将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌株分别接种于LB培养基中培养过夜,分别提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I对重组克隆质粒和pET30a质粒进行双酶切和电泳检测,胶回收目的基因片段和pET30a片段;

步骤11、目的基因与表达载体pET30a的连接

取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表达载体片段、1μL T4 DNA连接酶和1μL buffer,16℃连接过夜;构建重组表达质粒pETCPI如SEQ ID NO:2所示;

步骤12、重组表达质粒转化感受态细胞

按照北京全式金生物技术有限公司E.coli BL21感受态细胞使用说明书操作,将连接产物转化于E.coli BL21感受态细胞中,涂布于含抗生素的固体LB培养基上37℃培养过夜;

步骤13、重组表达菌的鉴定

对构建的重组表达菌E.coli BL21,进行PCR鉴定和双酶切鉴定,经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组表达菌,送北京华大基因公司进行双向测序;具体步骤如步骤7、步骤8和步骤9所述;

步骤14、重组表达菌诱导表达条件的优化

分别对重组表达菌诱导表达时间、诱导剂IPTG浓度以及培养温度进行优化,确定最佳诱导表达条件;

步骤15、重组蛋白表达形式的检测

确定重组蛋白最佳诱导条件后,诱导表达500mL重组菌,离心收集菌体,将菌体沉淀用PBS洗3遍后,用PBS重悬沉淀,加入溶菌酶,常温放置1h,-20℃反复冻融,冰浴超声破碎15min,12000g离心10min,收集沉淀和上清,加入蛋白上样缓冲液煮沸10min,12%SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式;

步骤16、重组蛋白包涵体溶解及重组蛋白纯化

按最佳诱导条件诱导重组表达菌1L,12000g离心10min收集菌体,按上述方法裂解重组表达菌,离心收集裂解物沉淀,将沉淀用8M尿素溶解,12000g低温离心10min,收集上清液,用0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化试剂盒操作步骤纯化重组蛋白;

步骤17、重组蛋白western blotting检测将纯化出的重组Pj_CPI蛋白rCPI进行SDS-PAGE电泳,从制胶板上将蛋白质胶取出,在夹子上放置滤纸、PVDF膜、蛋白胶、滤纸,按顺序放好夹住,100V 40min转膜;转膜后取出PVDF膜TBST洗涤4min,重复3~4遍,用现配的5%脱脂乳封闭液常温微摇封闭2h;取出PVDF膜TBST洗涤4min,重复3~4遍,将PVDF膜在1:2000稀释的感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中4℃孵育过夜;取出PVDF膜TBST洗4min,重复3~4遍,将PVDF膜在辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼多克隆抗体中常温微摇孵育1h;取出PVDF膜TBST洗涤4min,重复3~4遍,用ECL显色后照相。

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