一种酪蛋白来源的降胆固醇肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种功能因子及其制备方法，具体涉及一种酪蛋白来源的降胆固醇肽及其制备方法和应用。

背景技术：

血液中胆固醇含量过高，尤其是低密度脂蛋白含量过高，可能会增加患心血管疾病的风险，并且，胆固醇在动脉壁上聚集会导致动脉粥样硬化等疾病的发生。目前，用于临床治疗的降胆固醇药物多属于化学类药物，会给患者带来不同程度的毒副作用。例如，考来烯胺、考来替泊等胆酸整合剂，以及他汀类药物，对患者的身体健康有一定风险，不适合长期服用。而食源性活性肽是功能性食品，临床副作用小，市场前景良好。

目前，对降胆固醇肽的降胆固醇作用机理曾提出一种假设，既食品蛋白源降胆固醇肽可作用于胆固醇肠肝循环途径，通过这些肽的较强结合胆汁酸的能力来抑制内源胆固醇的重吸收，从而达到降低血清胆固醇水平的功效。胆固醇活性肽降胆固醇作用的另一途径是通过减少外源胆固醇的吸收来达到降低血清胆固醇的目的。外源胆固醇被小肠吸收后，大部分在小肠粘膜细胞滑面内质网上被酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(acyl coezyme A:cholesterol acyltransferase,ACAT)重新酯化，形成胆固醇酯，与粗面内质网上合成的载脂蛋白构成新生的乳糜微粒(包括甘油三酯、胆固醇酯和磷脂等)，经高尔基复合体分泌到细胞外，进入淋巴循环最终进入血液循环。乳糜微粒中胆固醇溶解度的降低可导致外源胆固醇吸收量的减少从而引起血液胆固醇水平的降低。目前国内外针对大豆蛋白和乳清蛋白的降胆固醇肽有一些报导，但对牛乳中酪蛋白源的降胆固醇肽缺乏系统性的研究报导。酪蛋白在乳中的比例接近总体蛋白质含量的80％，来源丰富，因此，酪蛋白源降胆固醇生物活性肽的开发极具应用潜力和价值。

技术实现要素：

解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，弥补牛乳中酪蛋白源的降胆固醇肽研究的空白，获得一种新来源的的降胆固醇肽，并通过人工合成的方法制备抑制外源性胆固醇吸收的降胆固醇肽，本发明提供了一种酪蛋白来源的降胆固醇肽及其制备方法和应用。

技术方案：一种酪蛋白来源的降胆固醇肽，所述降胆固醇肽包含下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

一种酪蛋白来源的降胆固醇肽的制备方法，包含以下步骤：

(1)制备酪蛋白酶解液：配制40～60mg/mL的酪蛋白溶液，加入蛋白酶，蛋白酶的终浓度为50～70mg/mL，酶解pH为6.0～8.0，酶解温度为45～50℃，酶解时间为3～4h，加热灭活，离心取上清；

(2)制备酪蛋白肽超滤液：将步骤(1)收集的上清液进行超滤，超滤膜压力为0.1～0.4MPa，流速为5～10mL/min；所述超滤采用的超滤膜截留分子量为10000Da；

(3)制备降胆固醇粗肽：采用凝胶色谱分离纯化步骤(2)制备获得的酪蛋白肽超滤液，220nm检测出峰位置，收集各吸收峰，以胆固醇胶束溶解度抑制率为评价指标测定降胆固醇活性，具有降胆固醇活性的组分进行冷冻干燥；

(4)降胆固醇肽序列分析：采用超高效液相-质谱联用分析降胆固醇粗肽的氨基酸序列；

(5)降胆固醇肽合成：根据步骤(4)的氨基酸序列分析结果合成降胆固醇肽，收集具有降胆固醇活性的多肽。

优选的，步骤(1)中所述酪蛋白溶液浓度为50mg/mL，蛋白酶的终浓度为60mg/mL，酶解pH为7.0，酶解温度为47.5℃，酶解时间为3.5h。

优选的，步骤(1)中所述蛋白酶为中性蛋白酶。

优选的，步骤(2)中所述超滤膜压力为0.25MPa，流速为7.5mL/min。

优选的，步骤(3)中所述凝胶色谱采用的过滤介质为Sephadex G-10凝胶，蒸馏水平衡，上样量为1～2％凝胶色谱柱体积，洗脱速度为2.5～3.5mL/min。

优选的，步骤(4)所述超高效液相-质谱联用分析中液相色谱分析柱采用的是ACQUITY UPLC BEH130C18柱，规格为2.1×150nm，1.7μm，质谱仪采用的是WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS。

所述的酪蛋白来源的降胆固醇肽在功能食品中的应用。

有益效果：(1)本发明所述的酪蛋白来源的降胆固醇肽来源于牛乳，其中酪蛋白含量占总蛋白含量的80％左右，因而来源丰富；(2)本发明所述方法采用中性蛋白酶酶解酪蛋白，无特异性酶切位点，因而能够获得广泛的降胆固醇肽，酶切效率高；(3)本发明所述方法的凝胶过滤层析获得的降胆固醇粗肽无需进行液相色谱分离，直接采用超高效液相质谱联用UPLC-MS分析降胆固醇肽的氨基酸序列，并且合成降胆固醇肽进一步验证降胆固醇活性，确定降胆固醇肽序列，提高了效率；(4)本发明所述酪蛋白来源的降胆固醇肽能够用于制备功能性食品，从而抑制外源胆固醇的吸收。

附图说明

图1是本发明所述酪蛋白来源的降胆固醇肽制备方法的工艺流程图；

图2是中性蛋白酶酶解乳清蛋白的酶解物G-10凝胶层析分离图；

图3是蒸馏水的UPLC-MS总离子流图；

图4是中性蛋白酶酶解乳清蛋白的酶解物经G-10凝胶层析分离后获得降胆固醇粗肽的UPLC-MS总离子流图；

图5是多肽TDVEN(Thr-Asp-Val-Glu-Asn)的MS/MS图；

图6是多肽LQPE(Leu-Gln-Pro-Glu)的MS/MS图；

图7是多肽VLPVPQ(Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln)的MS/MS图；

图8是多肽VAPFPE(Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu)的MS/MS图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

本发明所述实施例中采用的实验测定方法如下：

1.酪蛋白水解度的测定

在酪蛋白水解过程中每隔一定时间测定溶液pH，加入一定浓度的NaOH溶液使之维持在恒定的pH值，在酶解过程中记录消耗的NaOH量，用于计算水解度。

其中，B：NaOH的体积(mL)；

N_b：NaOH的浓度(mol/L)；

α：α-氨基的平均解离度，在pH 7.0，50℃的实验条件下，对于酪蛋白，1/α为2.26；

M_p：底物中蛋白质总含量(g)；

h_tot:每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，在pH值为7.0和50℃的实验条件下，对于酪蛋白而言，该值取8.2mmol/g。

2.多肽含量的测定

双缩脲试剂的制备：称取1.5g硫酸铜，6.0g酒石酸钾钠，溶于500mL蒸馏水，在溶解搅拌过程中加入300mL10％(W/V)的NaOH溶液，用蒸馏水定容至1L。

多肽含量标准曲线的制备：取10个10mL的容量瓶，用5％(W/V)的TCA(三氯乙酸)水溶液依次配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，然后分别取6.0mL标准溶液，加入4.0mL双缩脲试剂，混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm测定OD值(以第一管做空白对照)。以肽的浓度为横坐标X(mg/mL)，吸光度(OD值)为纵坐标Y，制作标准曲线。

样品多肽含量的测定：取2.5mL样品溶液，加入2.5mL 10％TCA(三氯乙酸)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min后，4000r/min离心15min，将上清液全部转移到50mL容量瓶中，并用5％TCA(三氯乙酸)定容至刻度，摇匀。取6.0mL上述溶液置另一试管中，加入4.0mL双缩脲试剂，混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/mL)，进而可求得样品中多肽含量。

3.降胆固醇肽降胆固醇活性测定

制备模拟胆汁胆固醇胶束溶液，其中10mL胶束溶液含0.15g牛磺胆酸钠、0.03g胆固醇、50μL油酸、0.2g NaCl。样品组在胆固醇胶束溶液中添加30mg酪蛋白肽，超声波乳化均匀后，37℃恒温孵育24h。空白组不添加粗肽，用10mL的PBS缓冲液代替肽液。常温下离心10000r/min，15min，取上清液30uL，用总胆固醇试剂盒测定胆固醇含量。计算酪蛋白肽对模拟胆汁胶束溶液中的胆固醇溶解度的抑制率，每组三次平行。

胆固醇抑制率计算公式如下：

实施例1

一种酪蛋白来源的降胆固醇肽，所述降胆固醇肽包含下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

一种酪蛋白来源的降胆固醇肽的制备方法，包含以下步骤：

(1)制备酪蛋白酶解液：配制50mg/mL的酪蛋白溶液，加入50U/mg中性蛋白酶，蛋白酶的终浓度为60mg/mL；采用1mol/L NaOH和0.5mol/L HCl溶液调节酶解pH为7.0，酶解温度为47.5℃，酶解过程中不断加入1mol/L NaOH维持溶液pH恒定，酶解时间为3.5h；将反应体系90℃加热20min灭酶活，4500r/min离心20min取上清；

(2)制备酪蛋白肽超滤液：将步骤(1)收集的上清液进行超滤，超滤膜压力为0.25MPa，流速为7.5mL/min；所述超滤采用的超滤膜截留分子量为10000Da；收集分子量10000Da以下的酪蛋白肽超滤液，超滤液通过真空冷冻干燥浓缩；

(3)制备降胆固醇粗肽：将上述酪蛋白肽超滤液通过凝胶色谱进行分离纯化，称取一定量的Sephadex G-10固体，用沸水浴溶胀2h；在层析柱(￠1.6cm×50cm)中加入少量蒸馏水以排除层析柱底部的空气；摇匀溶胀好的Sephadex G-10凝胶，用一根玻璃棒小心将凝胶导入层析柱，柱子装完后用蒸馏水平衡充分；超滤后冷冻干燥的酪蛋白肽超滤液用蒸馏水溶解，质量浓度为80mg/mL，上样量为1.5％凝胶色谱柱体积，洗脱速度为3.0mL/min，紫外检测器波长为220nm，收集各组分，冷冻干燥，测定胆固醇胶束溶解度抑制率。如图2所示，峰A、峰B的胆固醇胶束溶解度抑制率(％)分别为24.2±0.24，4.3±0.16，收集峰A为降胆固醇粗肽。

(4)降胆固醇肽序列分析：选择Sephadex G-10分离后的酪蛋白肽胆固醇溶解度抑制率高的样品(峰A)通过超高效液相质谱联用UPLC-MS分析所含肽序列，UPLC-MS分析条件如下：

液相色谱分析柱：ACQUITY UPLC BEH130C18柱(2.1×150nm，1.7μm)(Waters，美国)；流动相A：100％乙腈；流动相B：0.1％甲酸水溶液；柱温：45℃；检测波长：204nm；流速：0.3mL/min；进样量：8μL；洗脱程序：0～1min，流动相A 2％，流动相B 95％；1～10min,流动相A 30％，流动相B 60％；10～17min，流动相A100％，流动相B 0％；17～22min，流动相A 2％，流动相B 95％；

质谱仪采用美国WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS(Waters，美国)，干燥气和雾化气均为N₂；离子方式：ESI+；毛细管电压：3.5kVolts；锥孔电压：30Volts；脱溶剂气体温度：300℃；离子源温度：100℃；脱溶剂气体流量：500lit/hr；锥孔气体流量(L/Hr)：50lit/hr；碰撞能量：6/35Volts；质量范围：100～1500m/z；检测电压：1600～1700Volts；利用软件Masslynx4.1进行酪蛋白肽氨基酸序列分析与手动计算肽的氨基酸序列相结合，确定降胆固醇肽序列；

图3为蒸馏水的总离子流图，图4为中性蛋白酶酶解酪蛋白水解物经G-10分离后简单的总离子流图，采用GPMAW软件、Masslynx软件进行多肽氨基酸序列解析，分别解析了四种多肽的氨基酸序列：TDVEN(Thr-Asp-Val-Glu-Asn)、LQPE(Leu-Gln-Pro-Glu)、VLPVPQ(Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln)和VLPVPQ(Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln)，见表1；图5为多肽TDVEN(Thr-Asp-Val-Glu-Asn)的MS/MS图，图6为LQPE(Leu-Gln-Pro-Glu)的MS/MS图，图7为VLPVPQ(Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln)的MS/MS图，图8为VAPFPE(Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu)的MS/MS图。

表1降胆固醇粗肽经UPLC-MS解析的四种多肽氨基酸序列及来源

(5)降胆固醇肽合成：合成TDVEN、LQPE、VLPVPQ和VAPFPE四种肽，纯度为95％，测定降胆固醇活性，TDVEN、LQPE具有降胆固醇活性，胆固醇胶束溶解度抑制率分别为48.37％±4.42％，43.07％±3.09％，因此，确定TDVEN和LQPE为降胆固醇肽。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于步骤(1)制备酪蛋白酶解液：配制40mg/mL的酪蛋白溶液，加入中性蛋白酶的终浓度为50mg/mL，酶解pH为6.0，酶解温度为45℃，酶解时间为4h，加热灭活，离心取上清。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于步骤(1)制备酪蛋白酶解液：配制70mg/mL的酪蛋白。加入中性蛋白酶的终浓度为70mg/mL，酶解pH为8.0，酶解温度为50℃，酶解时间为3h，加热灭活，离心取上清。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于步骤(2)制备酪蛋白肽超滤液：超滤膜压力为0.1MPa，流速为5mL/min。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于步骤(2)制备酪蛋白肽超滤液：超滤膜压力为0.4MPa，流速为10mL/min。

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于步骤(3)制备降胆固醇粗肽：酪蛋白肽超滤液通过凝胶色谱进行分离纯化时，上样量为1％凝胶色谱柱体积，洗脱速度为2.5mL/min。

实施例7

本实施例与实施例1的区别在于步骤(3)制备降胆固醇粗肽：酪蛋白肽超滤液通过凝胶色谱进行分离纯化时，上样量为2％凝胶色谱柱体积，洗脱速度为3.5mL/min。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京师范大学

<120> 一种酪蛋白来源的降胆固醇肽及其制备方法和应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Thr Asp Val Glu Asn

1 5

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Gln Pro Glu

1

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Leu Pro Val Pro Gln

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<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

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1 5