一株苯酚降解菌及其应用的制作方法

本发明涉及苯酚降解微生物及其应用，具体的说，本发明涉及一种能降解苯酚的海洋芽孢杆菌及其应用的技术领域。

背景技术：

随着科学技术的不断发展和人们生活水平的不断提高，环境污染问题也日益突出，全球性水体污染日趋严重，严重威胁着社会经济乃至人类自身的可持续发展。我国的水污染主要来自工业污染源废水排放。从工业污染源调查和环境监测着手，我国确定了水中诸控制污染物“黑名单”，其中，酚类物质赫然在列。苯酚是重要的化工原料, 被广泛应用于酚醛树脂、炼油、焦碳、染料、纺织、杀虫剂、农药和医药的生产中，并成为这些工业废水中的主要污染物之一。

含酚废水中的酚类化合物是一种原型质毒物，对生物体具有毒害作用，而且很难被降解。可通过皮肤、黏膜的接触不经肝脏解毒直接进入血液循环，致使细胞破坏并失去活力，也可以通过口腔侵入人体，造成细胞的损伤。水中酚含量达到5~10mg/L时，会引起鱼类大量死亡。此外，用含酚废水灌溉农田，也会使农作物减产或枯死。因此，含酚废水的排放不仅对环境造成严重的污染，也危害人类健康及生物的生长繁殖。

目前对含酚废水的处理方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法常用吸附、过滤、萃取、沉淀等，其优点是处理方法简单、维护费用少，但采用该方法处理时间长，且往往很难达到国家的排放要求，故一般只能用作污水的预处理。化学法常用氧化还原、中和反应、化学沉淀等，其优点是处理时间短，效率高，但设备投资与维护费用高，且可能存在二次污染。而生物法主要是利用自然界中能利用酚类物质作为碳源生长的微生物降解污水中的酚类污染物，其整个过程基本是在微生物酶参与下发生的生物化学反应，具有适应性广，能耗少，处理效率高，二次污染少，投资少等优点，是目前废水处理领域中较为先进和重要的方法。

近年来，国内外已分离鉴定的苯酚降解微生物主要包括细菌和真菌两大类。细菌主要包括假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、产碱菌属（Alcaligens sp.）和红球菌属（Rhodococcus sp.）；真菌主要包括酵母菌属（Saccharomyces sp.）、假丝酵母属（Candida sp.）和不动杆菌属（Acinetobacter sp.）。降解活性多在300-1000mg/L，但在高盐条件下，其降解活性会大幅降低。盐度对微生物降解的影响较大，高盐度会使微生物的生长速率和降解速率迅速下降。然而，纺织、皮革化工、和农药等化工产业的生产过程中会产生高盐废水，这些高盐度污水会极大地抑制微生物的活性，限制大多数微生物在污水处理中的应用。因此，筛选出既能耐受高盐度条件，又具有高效降解苯酚能力的微生物意义重大。

技术实现要素：

针对国内外有关苯酚降解菌的研究现状，本发明提供一种新的苯酚降解微生物。所述的苯酚降解菌具有氧化酶、过氧化氢酶、淀粉水解酶、脂酶、脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等酶活性，且具有快速降解苯酚的能力。

本发明提供一株海洋芽孢杆菌Oceanobacillus sp. LCB-20。

本发明通过以不同盐浓度、苯酚浓度和培养基筛选为富集条件，从新疆盐碱土壤中取样，分离纯化得到多株菌，经过多级筛选确定了一株高效苯酚降解菌（Oceanobacillus sp. LCB-20），命名为海洋芽孢杆菌LCB-20。该菌株已于日前申请保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间分别为2016年12月5号，保藏号为CGMCC No.13422，CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编是100101。

对该菌株Oceanobacillus sp. LCB-20的形态观察、生理生化及培养特性均参照《放线菌系统学——方法、原理与实践》进行。该菌为好氧菌，革兰氏阳性，运动性，呈短杆状，细胞大小为0.2-0.4μm×1.0-1.5μm，菌落颜色为奶油色。氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，具有硝酸盐还原能力，能水解淀粉。具有脂酶、脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等酶活性。

对该菌株Oceanobacillus sp. LCB-20的苯酚降解能力，将菌种LCB-20接至TSB培养基中，添加不同浓度的NaCl，调节pH至8.0，30^oC、200rpm震荡培养，24h后分别加入不同初始浓度200、500、700、1000和1200mg/L的苯酚，取样检测苯酚含量。每24h取样检测菌体生长状况及残余苯酚含量。菌体生长状况检测方法：取样，用紫外分光光度计检测菌悬液在600nm时的吸光度。残余苯酚含量检测方法：取样，12000rpm离心10min，采用0.22μm滤膜过滤，样品使用HPLC检测。实验重复三次，结果取平均值。实验结果显示，LCB-20在不同浓度 NaCl条件下，均能降解苯酚，且NaCl浓度较低时，苯酚的降解效率更高，同时，苯酚初始浓度越低，降解效率越高。LCB-20在5%NaCl条件下，在96h内能完全降解1200mg/L的苯酚，在10%NaCl条件下，在216h内能完全降解1000mg/L的苯酚。

通过实施本发明的具体技术指标，可达到以下预期效果。

本发明的Oceanobacillus sp. LCB-20为好氧菌，革兰氏阳性，菌落呈奶油色。氧化酶和过氧化氢酶阳性。pH生长范围为6.5至11，NaCl浓度生长范围为3%至20%。该菌具有淀粉水解酶、脂酶、脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等酶活性，同时具有高效降解高浓度苯酚的能力，可广泛地应用在苯酚降解酶的开发和含苯酚工业废水的处理中。

附图说明：图1是菌株Oceanobacillus sp. LCB-20在TSB+5%NaCl条件下，对不同初始浓度苯酚的降解过程。图2是采用HPLC对苯酚标准品所做标准曲线图。

下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。

具体实施方法

实施例一：Oceanobacillus sp. LCB-20的筛选和分离

土壤样品采集自新疆维吾尔族自治区莎车县。称取1g土壤样品加入装有50ml无菌水的摇瓶中，震荡培养。将富集液用无菌水作10倍梯度稀释，取200μl 10^-1-10^-5倍数稀释液分别涂布到不同盐浓度、不同苯酚浓度的TSB、牛肉膏蛋白胨、高氏一号培养基上培养，30^oC生化培养箱中培养7 d。观察生长状况与形态特征，将长出的菌落转接至苯酚浓度为200 mg/L的TSB琼脂平板上，经多次划线，再挑取单菌落转接至TSB斜面培养基，置4^oC作保藏备用。最后筛选到一株能耐受高浓度苯酚的菌株，命名为LCB-20。

实施例二：不同盐浓度对Oceanobacillus sp. LCB-20生长的影响

不同NaCl浓度对菌株LCB-20生长的影响实验，配置NaCl浓度分别为0%、3%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%的TSB液体培养基，调节pH至8.0，将新鲜菌液接种到摇瓶中，30^oC、200rpm下震荡培养24h。使用紫外分光光度计在600nm下检测其吸光值。结果显示，LCB-20的NaCl浓度为1-20%，最适NaCl生长浓度为7-10%。

实施例三：Oceanobacillus sp. LCB-20的酶学特性

氧化酶实验：将1%二甲基对苯二胺盐酸盐滴加到培养好的菌落上，若菌落立即变为粉红色，接着变成深红色，则为氧化酶阳性；若无明显颜色变化或60s后出现蓝色则为氧化酶阴性。过氧化氢酶实验：挑取少量培养至对数生长期的菌体于滤纸片上，滴加3%浓度的过氧化氢溶液，若30s内出现大量气泡，则为过氧化氢酶阳性，反之，则为阴性。菌株LCB-20的其他酶学特性采用API ZYM试剂条鉴定。实验结果显示，菌株LCB-20具有以下酶活性：氧化酶、过氧化氢酶、淀粉水解酶、脂酶、脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶。

实施例四：5% NaCl条件下Oceanobacillus sp. LCB-20对苯酚的降解实验

将菌种LCB-20接至TSB培养基中，添加5%（质量分数）的NaCl，调节pH至8.0，30^oC、200rpm培养，第二天同一时间加入不同初始浓度200、500、700、1000和1200mg/L的苯酚，取样检测苯酚含量。每24h取样检测菌体生长状况及残余苯酚含量。菌体生长状况检测方法：取样，用紫外分光光度计测菌悬液在600nm时的吸光度。残余苯酚含量检测方法：取样，12000rpm离心10min，过0.22μm滤膜，样品使用HPLC检测。实验重复三次，结果取平均值。结果显示，LCB-20在5% NaCl条件下，能在96h内将浓度1200mg/L的苯酚完全降解。

实施例五：10% NaCl条件下Oceanobacillus sp. LCB-20对苯酚的降解实验

将菌种LCB-20接至TSB培养基中，添加10%（质量分数）的NaCl，调节pH至8.0，30^oC、200rpm培养，第二天同一时间加入不同初始浓度200、500、700、1000和1200mg/L的苯酚，取样检测苯酚含量。每24h取样检测菌体生长状况及残余苯酚含量。菌体生长状况检测方法：取样，用紫外分光光度计测菌悬液在600nm时的吸光度。残余苯酚含量检测方法：取样，12000rpm离心10min，过0.22μm滤膜，样品使用HPLC检测。实验重复三次，结果取平均值。结果显示，LCB-20在10% NaCl条件下，能在216h内将浓度为1000mg/L的苯酚完全降解。