一种氧化酶及其应用的制作方法

本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。

背景技术：

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)

目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)

本发明首次从分散泛菌(Pantoea dispersa)中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。

技术实现要素：

本发明从分散泛菌(Pantoea dispersa)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。

本发明的技术方案如下：

1、菌株

本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Pantoea dispersa ATCC 14593，购自美国ATCC菌种库。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Pantoea dispersa ATCC 14593菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。

3、D-乳酸氧化酶表达与纯化

将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。

4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析

以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。

酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯

拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。

产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：

对映体过量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_S+S_R)]×100％

(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(S_S/S₀)×100％

式中S_R为反应后(R)-对映体的峰面积，S_S为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S₀为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。

产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。

所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。

所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本发表明的有益之处：从Pantoea dispersa ATCC 14593中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。

具体实施方式

实施例1

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。

1、Pantoea dispersa ATCC 14593DNA的提取

将Pantoea dispersa ATCC 14593菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。

2、大肠杆菌感受态制备

(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。

(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约0.6(约2～3h)。

(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。

(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。

(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。

3、D-乳酸氧化酶基因的克隆

(1)引物设计

设计引物序列为：

引物1：5'GCCGGGATCCATGAATAACAACACCTCACACCCTG 3'

引物2：5'GCCGTCTAGATTTCACCGCCCAGCCTTTG 3'

(2)PCR扩增

用以上合成的两条引物，以Pantoea dispersa ATCC 14593的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

本步骤中扩增体系为：

扩增程序为：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环

72℃，10min

PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)双酶切和连接

将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4 DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。

(4)转化

步骤：

1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。

2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。

5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。

6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。

实施例2

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。

1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。

实施例3

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适温度。以D-乳酸为底物，将底物与pH为4.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定D-乳酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为40℃。

实施例4

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适pH值。以D-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，40℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 4.0条件下D-乳酸氧化酶酶活最高。

实施例5

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶与不同底物的反应特性，列于表2中。

表2 D-乳酸氧化酶对不同底物的活性

实施例6

根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：

表3拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果

由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(S)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种氧化酶及其应用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1710

<212> DNA

<213> Pantoea dispersa ATCC14593

<400> 1

atgaataaca acacctcaca ccctgccctg ctgtccgagc tgcgccgtct ggtcggcgcg 60

tcacagctgc tgaccgacgc agagcaaacc gcgcgctatc gtaagggttt ccgttccggc 120

gagggcgatg cgctggcggt ggttttcccc ggctcgctgc tggagctatg gcgcgtactg 180

caggcgctgg tacaggccga tgccatcgtg ctgatgcagg ccgccaatac cggcctgacc 240

gaaggttcaa cgcccaacgg caacgattac gatcgcccgg tggtgatcat cagtaccctg 300

cgtctcgaca aactgcagct gatcgacggc ggcaggcaga ttctcgcctt ccccggcagc 360

acgctgtatc agctggagaa aacccttaaa ccgctcgggc gcgagccgca ctcggtgatt 420

ggctcctcgt gcatcggcgc ctcggtgctg ggcggcatct gcaataactc cggcggctcg 480

ctgatcaaac gcggcccggc ctacagcgaa atggcgctgt ttgcacaggt ggacgccgac 540

ggcaagctcc ggctggtcaa ccatctgggc attgacctcg gtcattcgcc ggaagagatt 600

ctcggccggc tggacgatga gcgctggcag ccggatgatg tacgctggga tgcgcgccac 660

gcgtccgacc acgaatacgc cgagcgggtg cgggacattc atgccgatac gccggcgcgt 720

ttcaacgccg accagcggcg cctgtttgag gcgtcaggct gcgccggcaa actggcggtg 780

tttgccgtgc ggctcgacac cttccccacc gagccgaagc agcaggtgtt ttacattggc 840

accaacgacc cggcgacgct cggcgagctg cgtcgccaca tactggcgga gtttacccat 900

ttaccggtcg ccggtgagta catgcaccgc gatattttcg acatcgccga ggtctacggc 960

aaagacacct ttgtgatgat tgataaactc ggcaccgaca agatgccact gtttttcacc 1020

ctcaaaggcc gggtggatgc ctggctcagc aagctgagct tcgttaagcc gcacctgacc 1080

gatcgcctgc tgcaacgcat cagccgctgg ttcccggcgc acctgccgaa gcgcctgaag 1140

cagtatcgtg acaaatacga gcaccacctg atgctgaaga tgtctggcga cggcgtggcc 1200

gaagcgcagg cgtatctgca ggagtatttc cgcgaaggcg gtggtgagtt ctttgcctgc 1260

gacgccaaag agggcgcgca cgcctttttg catcgttttg ccgcagccgg tgccgccgtg 1320

cgctatcacg cggtgcacgc tgacgaagtg gaggatattc tggcgctgga cattgcgctg 1380

cgccgcaacg atcaggagtg gtttgagcgc ctgccgccgg agtttgataa cgatctgatt 1440

catcgccttt actacggcca cttcttctgc catgtgttcc atcaggatta cattgtgaag 1500

aaaggcgtag atgcccatgc gctgaaggag aagatgctgg cgatcctcgc ggcgcgcggc 1560

gcggagtatc cggcagagca taacgttggc catctgtatg cggccaaacc gcagctgcag 1620

gcgttttacc gccagctcga tccgaccaat acctttaacc cgggcatcgg gaaaaccagt 1680

aagcacaaag gctgggcggt gaaagcctga 1710

<210> 2

<211> 569

<212> PRT

<213> Pantoea dispersa ATCC14593

<400> 2

Met Asn Asn Asn Thr Ser His Pro Ala Leu Leu Ser Glu Leu Arg Arg

1 5 10 15

Leu Val Gly Ala Ser Gln Leu Leu Thr Asp Ala Glu Gln Thr Ala Arg

20 25 30

Tyr Arg Lys Gly Phe Arg Ser Gly Glu Gly Asp Ala Leu Ala Val Val

35 40 45

Phe Pro Gly Ser Leu Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Gln Ala Leu Val

50 55 60

Gln Ala Asp Ala Ile Val Leu Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly Leu Thr

65 70 75 80

Glu Gly Ser Thr Pro Asn Gly Asn Asp Tyr Asp Arg Pro Val Val Ile

85 90 95

Ile Ser Thr Leu Arg Leu Asp Lys Leu Gln Leu Ile Asp Gly Gly Arg

100 105 110

Gln Ile Leu Ala Phe Pro Gly Ser Thr Leu Tyr Gln Leu Glu Lys Thr

115 120 125

Leu Lys Pro Leu Gly Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser Ser Cys

130 135 140

Ile Gly Ala Ser Val Leu Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly Gly Ser

145 150 155 160

Leu Ile Lys Arg Gly Pro Ala Tyr Ser Glu Met Ala Leu Phe Ala Gln

165 170 175

Val Asp Ala Asp Gly Lys Leu Arg Leu Val Asn His Leu Gly Ile Asp

180 185 190

Leu Gly His Ser Pro Glu Glu Ile Leu Gly Arg Leu Asp Asp Glu Arg

195 200 205

Trp Gln Pro Asp Asp Val Arg Trp Asp Ala Arg His Ala Ser Asp His

210 215 220

Glu Tyr Ala Glu Arg Val Arg Asp Ile His Ala Asp Thr Pro Ala Arg

225 230 235 240

Phe Asn Ala Asp Gln Arg Arg Leu Phe Glu Ala Ser Gly Cys Ala Gly

245 250 255

Lys Leu Ala Val Phe Ala Val Arg Leu Asp Thr Phe Pro Thr Glu Pro

260 265 270

Lys Gln Gln Val Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Asp Pro Ala Thr Leu Gly

275 280 285

Glu Leu Arg Arg His Ile Leu Ala Glu Phe Thr His Leu Pro Val Ala

290 295 300

Gly Glu Tyr Met His Arg Asp Ile Phe Asp Ile Ala Glu Val Tyr Gly

305 310 315 320

Lys Asp Thr Phe Val Met Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys Met Pro

325 330 335

Leu Phe Phe Thr Leu Lys Gly Arg Val Asp Ala Trp Leu Ser Lys Leu

340 345 350

Ser Phe Val Lys Pro His Leu Thr Asp Arg Leu Leu Gln Arg Ile Ser

355 360 365

Arg Trp Phe Pro Ala His Leu Pro Lys Arg Leu Lys Gln Tyr Arg Asp

370 375 380

Lys Tyr Glu His His Leu Met Leu Lys Met Ser Gly Asp Gly Val Ala

385 390 395 400

Glu Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Glu Tyr Phe Arg Glu Gly Gly Gly Glu

405 410 415

Phe Phe Ala Cys Asp Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Phe Leu His Arg

420 425 430

Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ala Val Arg Tyr His Ala Val His Ala Asp

435 440 445

Glu Val Glu Asp Ile Leu Ala Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg Asn Asp

450 455 460

Gln Glu Trp Phe Glu Arg Leu Pro Pro Glu Phe Asp Asn Asp Leu Ile

465 470 475 480

His Arg Leu Tyr Tyr Gly His Phe Phe Cys His Val Phe His Gln Asp

485 490 495

Tyr Ile Val Lys Lys Gly Val Asp Ala His Ala Leu Lys Glu Lys Met

500 505 510

Leu Ala Ile Leu Ala Ala Arg Gly Ala Glu Tyr Pro Ala Glu His Asn

515 520 525

Val Gly His Leu Tyr Ala Ala Lys Pro Gln Leu Gln Ala Phe Tyr Arg

530 535 540

Gln Leu Asp Pro Thr Asn Thr Phe Asn Pro Gly Ile Gly Lys Thr Ser

545 550 555 560

Lys His Lys Gly Trp Ala Val Lys Ala

565