本发明涉及一种具有内涵体逃逸功能的壳聚糖衍生物及其制备方法和应用，属于生物药用材料
技术领域：
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背景技术：
：癌症在全球范围内已成为严重威胁人类生命健康的多发病和常见病。目前癌症临床治疗方式有药物治疗、放射治疗和手术治疗，其中化疗在癌症治疗中占主导地位。但因化学药物选择性不强，在发挥杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长繁殖作用时对正常组织器官及细胞也起同样作用，由此产生了严重的不良反应，甚至导致化疗失败。近年来研究的纳米给药系统虽具有肿瘤组织靶向性，可通过胞饮途径进入细胞，但不可避免会被吞噬为内涵体，最终形成溶酶体而被降解，从而削弱了药物的生物学活性。因此，研制能将药物输送至靶细胞并具有的内涵体逃逸功能的载体迫在眉睫。壳聚糖(Chitosan)是甲壳质脱乙酰基的产物，是自然界唯一大量存在的高分子碱性氨基多糖，其荷正电的特性使其能与细胞表面荷负电的蛋白聚糖相互作用，促进细胞内吞摄取。与合成高分子材料相比，具有来源广泛、价格低廉、性质稳定、无刺激、无致敏、无致突变、良好的生物相容性和生物可降解性、低免疫原性和无生物活性等优点，这使得壳聚糖在医药领域有着广泛的应用。壳聚糖分子链上带有大量活性氨基和羟基，易于化学修饰。控制不同的合成条件和方法，可制备具有不同特性的壳聚糖衍生物。在壳聚糖分子的伯氨基上易于接枝各种亲油性小分子，引入了疏水基团，即形成带有疏水长链的两亲性壳聚糖衍生物，在水中可以自发形成纳米胶束，其具有上述聚合物胶束增溶作用、结构稳定、长循环和靶向等特点。但如前所述，载药物的壳聚糖胶束靶向进入细胞内并不能保证稳定发挥药效，还需经历内涵体的吞噬进而被降解。因此为使药物能完整进入细胞质，应使抗肿瘤药物载体具备内涵体逃逸功能。内涵体逃逸的机制有四种：pH缓冲效应(质子海绵效应)，内涵体膜的致孔效应，内涵体膜融合效应以及内涵体膜的光化学断裂。其中内涵体膜致孔效应是由于某些多肽类物质与内涵体膜上的孔隙具有高亲和力，如阳离子两亲性多肽与脂质双分子层结合，使孔内的张力增大，扩增孔洞从而实现从内涵体逃逸。膜融合是通过融合蛋白引发的内涵体膜结构紊乱而产生内涵体逃逸，如凝血素可在内涵体酸性pH条件下由阴离子亲水核转变为疏水螺旋状构象，有利于膜融合。光化学断裂源于内涵体和溶酶体膜上存在光敏感物质，其在光照下诱导形成氧自由基从而破坏膜结构。质子海绵效应是由能在质子化条件下具有高缓冲能力且易于膨胀的试剂介导产生，其中富含组氨酸的分子由于组氨酸上的咪唑环质子化后表现出缓冲效应，可引发内涵体膜破裂。又如PAMAM聚合物结构中存在质子化胺基亦产生了高缓冲效应，提高了内涵体的渗透压，导致内涵体膜破裂。在以上四种方式中，质子化海绵效应方式相对较易实现，方便使用，成本相对较低，易于与靶配体结合，便于大规模生产。目前，现有内涵体逃逸功能化合物的研究众多，但是也存在一些问题，如效应差，载药效果差等。技术实现要素：发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种具有内涵体逃逸功能的壳聚糖衍生物及其制备方法和应用。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明公开了一种具有内涵体逃逸功能的壳聚糖衍生物，其特征在于，其化学结构式如下式I所示：其中，n表示壳聚糖的聚合度，m/n表示咪唑甲基取代度，k/n表示单元糖环上的氨基未被羟乙基的取代的比例。50kDa壳聚糖的n大约在250左右，100kDa壳聚糖的n大约在500左右；当采用50kDa或100kDa壳聚糖时，k/n反映了一步合成反应未接枝到羟乙基的氨基取代情况，根据实验结果k/n大约是在0.831～1之间，即k可能范围是207～250或415～500；m/n反映了咪唑取代度，根据实验结果是0.189～0.205，则m的范围是47～52，或94～104。本发明还提供了所述壳聚糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：(1)壳聚糖衍生化制成两亲性壳聚糖--羟乙基壳聚糖(MHC)；(2)N-(4-咪唑甲基)-羟乙基壳聚糖(MHC)的合成；反应步骤如下：优选，所述步骤(1)的方法如下：将壳聚糖溶于10％的醋酸溶液中，搅拌至完全溶解后加入50％的氢氧化钠，升温至20-50℃反应6-12小时，再加冰降温至0-4℃后加入环氧乙烷2.5-10ml，升温至40-60℃反应12-18小时，冷却至室温，加入5mol/L的HCl调pH至中性，所得产物经3000rpm离心10min，0.8μm微孔滤膜过滤，透析冻干即得。优选，所述壳聚糖的分子量为50kDa或者100kDa。优选，所述步骤(2)的方法如下：取步骤(1)所得产物加水完全溶解，加适量6％HAc调至PH＝5加入4-咪唑甲醛，并升温至80℃反应12～24h，冷却后加适量4mol/LNaOH至中性，并加入10％的NaBH4，5mol/LHCl调至中性，离心后经0.8μm微孔滤膜过滤，滤液透析冻干即得。本发明提供了所述壳聚糖衍生物在制备载药胶束中的应用。优选，所述载药胶束中的药物为槲皮素或香豆素。优选，制备载药胶束时采用直接溶解法、旋转蒸发法、透析法或者乳化法。技术效果：相对于现有技术，本发明采用简单的合成手段制备出两亲性壳聚糖衍生物，通过质子海绵效应实现内涵体逃逸。所得载体材料具有一定的载药能力，帮助药物实现内涵体逃逸功能。具体实施方式实施例1材料合成材料表征方法如下：通过1HNMR、有机元素分析分别进行咪唑甲基和羟乙基的取代度测定。采用芘荧光光谱法测定MHC的临界胶束浓度1、羟乙基壳聚糖(HE-Cs)的合成：称取1克壳聚糖(50KDa100KDa)，加入10ml2％的HAc，搅拌至完全溶解后加入50％的NaOH10ml。之后升温至40℃反应12小时，再加冰降温后加入环氧乙烷10ml，升温至50℃反应18h。冷却至室温加入5mol/LHCl调pH至中性。所得产物经3000rpm离心10min，0.8μm微孔滤膜过滤，透析冻干即得。元素分析可知不同环氧乙烷投料量，可得不同羟乙基取代度。表1：羟乙基壳聚糖取代度与环氧乙烷投料量的关系环氧乙烷投料量羟乙基取代度2.5mL0.294～0.3725.0mL0.523～0.65410.0mL0.946～1.1692、N-(4-咪唑甲基)-羟乙基壳聚糖(MHC)的合成：取上述产物0.6g加72ml水完全溶解，加适量6％HAc调至PH＝5加入0.14g4-咪唑甲醛，并升温至80℃反应24h。冷却后加适量4mol/LNaOH至中性，并加入10％的NaBH4，5mol/LHCl调至中性，离心后经0.8μm微孔滤膜过滤，滤液透析冻干即得。通过1H-NMR可知咪唑甲基取代度0.189～0.205。3、采取芘荧光光谱法测定MHC的临界胶束浓度，配制浓度为6×10-6mol/L的芘的丙酮溶液，精密量取1mL置于一系列10mL容量瓶中，通氮气流挥去丙酮，分别加入MHC的水溶液适量，并加水稀释至刻度使MHC浓度分别为0.2、0.4、1.0、4.0、10.0、20.0、50.0、100.0、250.0、500.0、1000.0、2000.0、5000.0μg/mL。上述溶液超声30min，置于65℃水浴中孵育1h，取出，室温下暗处放置过夜。采用荧光光度计绘制芘的激发光谱，λem＝390nm，激发和发射狭缝宽度均为3.0nm。记录各溶液激发光谱的I338/I333，以I338/I333对MHC的对数浓度作图，计算CMC。表2投料量为10.0mL环氧乙烷不同分子量羟乙基壳聚糖的临界胶束浓度分子量CMCHE-Cs(50KDa)242.66μg/mlHE-Cs(100KDa)380.19μg/ml实施例2载药工艺优化以槲皮素为模型药物，比较了直接溶解法、旋转蒸发法、透析法、乳化法制备胶束载药量不同。采用单因素考察法比较槲皮素的不同溶媒(乙醇、二甲基亚砜、甲醇)、载体浓度(1％、0.67％、0.5％)以及药物和载体投料比(1:25、1:10、1:5)对载药量的影响，以载药量为指标进行工艺优化，制成达到一定浓度的载药胶束。结果如下表3和表4所示。表3不同制备方法所得载药胶束载药量表4单因素考察工艺优化结果实施例3细胞摄取及细胞内内涵体逃逸以香豆素-6(C6)为疏水性药物的荧光探针，包载于胶束中，采用激光共聚焦进行观察和评价。为便于显微观察，MDA-MB-231细胞用DMEM在24孔平板中培养24h，用胶束孵育4h后，细胞用PBS冲洗三次，4％多聚甲醛固定。在荧光拍照前细胞核用Hoechst33258染色，胶束的细胞摄取采用荧光显微镜观察。CLSM用于观察接下来的胶束的内化和内涵体逃逸过程。MDA-MB-231细胞在玻璃底的培养皿中培养24h，分别于加入C6-MHC胶束后2h，4h，12h，用PBS进行清洗三次，再用LysoTrackerTMRed染色，4％多聚甲醛固定，CLSM观察。结果表明采用疏水性荧光探针C6载入胶束内，观察MDA-MB-231细胞内吞情况。C6胶束体外实验表明24h内释放量低于1％，说明在细胞内能观察到的C6大部分都来自于C6胶束摄取，而不是游离的C6。激光共聚焦实验进一步证实了胶束从内涵体逃逸的效率。在MDA-MB-231细胞与C6胶束(绿色荧光)孵育后，内涵体采用LysoTrackerTMRed(红色荧光)染色。进入内涵体胶束用黄色表示。2h孵育后，明显观察到细胞内的黄色像素，表明细胞摄取后大多数的胶束都传递进入内涵体。然而，黄色荧光信号在4h时明显减少了，表明内涵体逃逸出胶束。12h观察到最弱的红色和绿色荧光，表明C6胶束高效地从内涵体逃逸出来。染色内涵体的红色荧光在逐渐衰减。这与阳离子材料对内涵体的酸性环境的破坏有关。实施例4细胞毒性通过MTT法在MDA-MB-231细胞上进行空白胶束、载药胶束的细胞毒性试验。生物材料MTT分析，将MDA-MB-231细胞孵育于96孔板上，空白胶束浓度从0.005到1000μg/mL，孵育72h。载药胶束的MTT试验，是将药物的浓度从0.001-10μg/mL孵育72h。每孔加入20uLMTT(溶于PBS中浓度为5mg/mL)孵育4h，加入100uLDMSO以溶解formazan结晶，570nm下酶标仪测定吸收度，以未处理组为标准进行数据处理。MTT法结果表明，空白胶束组没有观察到明显的细胞凋亡，说明空白的胶束没有细胞毒性。载药胶束的IC50较低，说明胶束更有效地传递药物产生细胞毒性，发挥有效的抗肿瘤作用。当前第1页1 2 3