一种制备自噬小体型瘤苗的培养基添加剂及其制备方法与流程

本发明涉及医药技术领域，尤其是一种用于制备自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗的细胞培养基添加剂冻干粉及其制备方法。

背景技术：

肿瘤细胞代谢产生的蛋白可分为长寿命蛋白和短寿命蛋白两大类，前者平均半衰期长，结构稳定，主要通过自噬-溶酶体途径降解；后者平均半衰期短，主要通过泛素-蛋白酶体途径降解。研究表明，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽有80％以上来源于短寿命蛋白，而短寿命蛋白由于其半衰期极短难以保存下来。对肿瘤细胞应用蛋白酶体抑制剂阻断肿瘤短寿命蛋白的降解，促使其进入自噬途径，同时采用自噬诱导剂促进自噬小体形成，并以弱碱性药物抑制溶酶体功能，阻止溶酶体对自噬小体中蛋白的降解。在此基础上，收集富含短寿命蛋白信息的自噬小体，可作为肿瘤疫苗，即自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗。

蛋白酶体抑制剂的代表药物为硼替佐米，其通过结合蛋白酶体20S催化亚单位的不同位点，能选择性地抑制一些特定蛋白的降解，使得细胞周期不能有序地进行。硼替佐米对蛋白酶体的抑制作用是可逆的，在经过72小时处理后大多数蛋白酶体的活性都可以恢复正常。泛素化的靶蛋白(包括错误翻译、错误折叠、突变或变性的蛋白等)除能够通过泛素-蛋白酶体途径得以降解外，还能与p62蛋白C端的的泛素相关结构域发生结合，并通过p62蛋白N端的Bem 1结构域发生自我聚集；该聚集体能通过p62蛋白上的LRS/LIR结构域与LC3结合并形成复合物、并由LC3介导形成自噬小体，最后自噬小体与溶酶体融合完成蛋白的降解。

弱碱性药物氯化铵(Ammonium chloride)、氯喹(Chloroquine，CQ)、羟氯喹(Hydroxychloroquine，HCQ)等可靶向浓集于溶酶体，通过上调溶酶体内pH值，抑制溶酶体相关酸性水解酶的活性，阻断溶酶体对自噬体的代谢。巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)是液泡型H+-ATPase(Vacular H+-ATPase，V-ATPase)抑制剂，通过抑制溶酶体膜上的V-ATPase活性，阻止H+由细胞质向溶酶体内的跨膜转运，影响溶酶体的酸化，抑制溶酶体的功能，阻断溶酶体对自噬体的胞内消化作用。氯喹口服后，肠道吸收快而充分，服药后l-2小时血药浓度达峰值，约55％的药物在血中与血浆成分结合，血药浓度维持较久，半衰期为2.5-10天。氯喹在肝、脾、肾、肺中的浓度高于血浆浓度达200-700倍。溶酶体内的pH为酸性，有利于弱碱性药物氯喹的浓集，浓集的氯喹消耗了溶酶体内的H+，因此可提高溶酶体内的pH，抑制溶酶体内酸性水解酶的活性，而自噬体和溶酶体的融合及融合后被溶酶体内的酸性水解酶降解是自噬代谢途径的关建环节，因此氯喹具有靶向抑制自噬的作用。

自噬(Autophagy)，又称Ⅱ型程序性细胞死亡，是广泛存在于真核细胞中的生命现象，包括大自噬(Macroautophagy)、小自噬(Microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy)三种形式。自噬参与调控细胞的发育、分化、成分更新及组织重塑等生理过程，对维持蛋白质代谢平衡及细胞内环境稳定具有重要意义。自噬表现为细胞质中出现大量包裹着细胞质和细胞器的双层膜囊泡结构，即自噬体(Autophagosome)，其与溶酶体融合形成自噬溶酶体，通过溶酶体水解酶降解囊泡内的物质和内层膜而发挥自噬作用。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associatedprotein 1 light chain 3，MAP1-LC3，LC3)是目前观察自噬现象是否存在、研究自噬活性较为可靠的生物学标志物。细胞自噬未发生时，LC3经过加工成为胞浆可溶性LC3Ⅰ。细胞发生自噬时，细胞内LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化均明显增加。因此LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例与自噬泡的数量呈正相关，在某种程度上反映了细胞的自噬活性。

细胞内有两条信号通路与自噬调控有关：

1、依赖mTOR途径的信号通路

丝氨酸-苏氨酸激酶(mTOR)是主要的自噬负性调节器。mTOR的活性取决于多种上游信号的输入，这些上游信号包括能量状态、营养状态、氨基酸和生长因子等。当营养缺乏、生长因子信号减弱以及ATP浓度减少时，mTOR都会被抑制。因此在饥饿时，mTOR被抑制，其抑制自噬体形成的作用也解除了，因此自噬体的生产就会增多。自噬诱导剂雷帕霉素是一种亲脂的大环内酯类抗生素，可通过抑制mTOR的活性来诱导自噬。

2、非mTOR依赖的信号通路

情绪稳定剂锂剂可通过非mTOR依赖的信号通路诱导自噬，通过抑制肌醇单磷酸酶来诱导自噬。抑制此酶的活性可以阻止肌醇回收再利用，这就导致了细胞肌醇耗竭，并抑制了磷酸肌醇循环。丙戊酸钠和卡马西平是精神稳定药物，可以通过抑制肌醇合成来降低细胞内肌醇三磷酸IP3的水平，从而影响细胞自噬水平。

海藻糖也能够激活细胞自噬，是一种新的非mTOR依赖的自噬诱导剂，其具体作用于哪个信号通路目前尚不明楚。由于海藻糖具有无毒性和高溶解度的特点，是一种很有前途的细胞自噬诱导剂，且海藻糖诱导自噬的作用能与雷帕霉素(依赖mTOR信号通路的自噬激活剂)的药理作用产生明显的叠加或累积效应。因此，同时联合应用两种自噬诱导药物，其中一种调节依赖mTOR途径的自噬通路，一个调节不依赖mTOR的信号通路，可以更好的起到调控自噬的作用，降低单用一种药物的剂量。

中国发明专利CN 102499983 B公开了HepG2.2.15细胞自噬小体在制备HBV治疗性疫苗中的应用；中国发明专利CN 102430118 B公开了H22肝癌细胞自噬小体DRibbles在制备肝癌治疗性疫苗中的应用；中国发明专利申请公布说明书CN 103463631 A公开了一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗及其制备方法。三者所描述的细胞处理方法是待肿瘤细胞生长良好后，加入雷帕霉素、万珂、和氯化铵，三者的加入量分别为100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干预16小时，诱导细胞自噬小体。考虑到雷帕霉素的靶点mTOR在生物体内有许多复杂的重要功能，如调节核糖体发生和蛋白质的翻译等，在诱导肿瘤细胞发生自噬的同时可能不利于细胞内某些肿瘤抗原的合成，最终影响到自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗的质量，加之雷帕霉素对机体还有免疫抑制的不良影响，所以有必要开发新型无雷帕霉素影响的、专门用于制备自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗的细胞培养基添加剂组合物。目前，尚没有专门用于制备自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗的细胞培养基添加剂组合物冻干粉制剂的公开报道。

前述的相关领域的实例及其局限性意在说明的目的，并不排除存在其它实例及局限性。本领域技术人员在阅读本说明书和研究附图后，会明悉相关领域的其它局限性。

附图说明

图1为V-ATPase抑制剂和弱碱性药物抑制溶酶功能模式图。

图2为激光扫描共聚焦显微镜观察自噬诱导培养添加剂对HepG2细胞的自噬诱导作用。

图3为Western blot检测自噬诱导培养添加剂对A549细胞的自噬诱导作用。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种制备自噬小体型瘤苗的培养基添加剂及其制备方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。

为解决上述问题，本发明的技术方案为：一种制备自噬小体型瘤苗的培养基添加剂，其创新点在于：冻干粉制剂包含一组组合物；组合物包含蛋白酶体抑制剂、自噬诱导剂、溶酶体腔碱化剂、赋形剂和抗氧化剂；蛋白酶体抑制剂是硼替佐米、MG132、乳胞素、2-aminobenzylstatine、Ritonavir、Aclacinomycin、Eponemycin、MLN-519、CEP-1612、CVT-634、TMC-95A、TMC-95B、TMC-95C、TMC-95D、金雀异黄素中的任意一种；自噬诱导剂包括mTOR依赖的信号通路的自噬诱导剂和不依赖mTOR的自噬途径的自噬诱导剂,以及纳米材料自噬诱导剂；mTOR依赖的信号通路的自噬诱导剂为雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、Torkinib、Torin 1中的任意一种；不依赖mTOR的自噬途径的自噬诱导剂是锂剂、海藻糖等中的一种；纳米材料自噬诱导剂是Fe₂O₃纳米晶体、Fe₃O₄纳米晶体、MnO纳米晶体等中的一种；自噬诱导剂还包括具有自噬诱导作用的三氧化二砷中的任意一种；溶酶体腔碱化剂是氯化铵、氯喹、羟氯喹等弱碱性药物中的一种；赋形剂是指海藻糖、甘露糖中的一种；抗氧化剂是亚硫酸钠中的一种。

在一些实施方式中，锂剂是丙戊酸钠、卡马西平等中的一种。

在一些实施方式中，硼替佐米，使每份自噬诱导培养添加剂加入总量为500ml的肿瘤细胞培养体系后，硼替佐米的工作浓度为150-200nmol/L。

在一些实施方式中，海藻糖，使每份自噬诱导培养添加剂加入总量为500ml的肿瘤细胞培养体系后，海藻糖的工作浓度为50-100mmol/L。

在一些实施方式中，所述氯喹，使每份自噬诱导培养添加剂加入总量为500ml的肿瘤细胞培养体系后，氯喹的工作浓度为20-80μmol/L。

一种制备自噬小体型瘤苗的培养基添加剂的制备方法，其创新点在于：包括如下步骤：

a.称取33.0mg硼替佐米、12.0g海藻糖、8.0mg氯喹，混合后，加50ml注射用水，搅拌直至完全溶解。

b.药液经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，灌装于50ml西林瓶中，半加胶塞，放入冻干机中冻干。

c.先将温度降至－8℃并保温90分钟，之后迅速降温至－40℃保温180分钟，冷阱降温至－40℃后开始抽真空，缓慢提高搁板温度至－10℃，保温18小时，再次提高搁板温度至25℃，真空度维持在25Pa，直至制品水分合格后冻干结束，冻干箱回填氮气至常压。全压塞出箱，轧盖、包装即得，制得的每份自噬诱导培养添加剂冻干粉可用于总量为500ml的肿瘤细胞培养体系。

本发明具有如下突出的优点：

1、本发明所述的添加剂组合物中含有蛋白酶体抑制剂、溶酶体腔碱化剂、自噬诱导剂，三者协同，一方面，可同时抑制肿瘤细胞的蛋白酶体降解途径和自噬溶酶体降解途径，使肿瘤抗原得以保存；另一方面，诱导自噬小体形成，使大量肿瘤抗原保存在自噬小体中，通过提取这些自噬小体，即可制备自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗；

2、本发明所述的添加剂组合物中含有硼替佐米，为蛋白酶体抑制剂；

3、本发明所述的添加剂组合物中含有氯喹，发挥抑制溶酶体活性的作用；

4、本发明所述的添加剂组合物中含有海藻糖，其一，海藻糖作为不依赖mTOR自噬途径的自噬诱导剂可促进肿瘤细胞自噬；其二，海藻糖作为蛋白质保护剂可在自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗制备过程中可稳定自噬小体膜、保护肿瘤抗原蛋白；其三，海藻糖可作为本发明所述冻干粉制剂的赋形剂；

5、本发明将用于制备自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗的细胞培养基专用添加剂组合制备成冻干制剂，容易保存，使用方便，便于质控，解决了多种药物配置复杂、配置所需时间长，环节多，容易污染的弊端，可显著提高自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗的制备效率，降低工作人员劳动强度。

具体实施方式

下面结合说明书附图，对本发明进行进一步详细的说明。

实施例1：制备自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗的细胞培养基添加剂冻干粉制剂，称取33.0mg硼替佐米、12.0g海藻糖、8.0mg氯喹，混合后，加50ml注射用水，搅拌直至完全溶解。药液经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，灌装于50ml西林瓶中，半加胶塞，放入冻干机中冻干；先将温度降至－8℃并保温90分钟，之后迅速降温至－40℃保温180分钟，冷阱降温至－40℃后开始抽真空，缓慢提高搁板温度至－10℃，保温18小时，再次提高搁板温度至25℃，真空度维持在25Pa，直至制品水分合格后冻干结束，冻干箱回填氮气至常压。全压塞出箱，轧盖、包装即得。

实施例2：自噬诱导培养基添加剂冻干粉的复溶

根据制备自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗所用肿瘤细胞的特性，选用合适的双无培养液50ml用于对自噬诱导培养添加剂冻干粉的复溶，轻轻振荡直至完全溶解，即为10×自噬诱导培养添加剂母液。按比例加入肿瘤细胞培养体系，使硼替佐米终浓度为172nmol/L，海藻糖终浓度为70mmol/L，氯喹终浓度为50μmol/L，即可用于制备自噬小体型亚细胞肿瘤疫苗。

实施例3：激光扫描共聚焦显微镜观察自噬诱导培养添加剂对HepG2细胞的自噬诱导作用

实验方法：pEGFP-LC3质粒的转染：将5μg pEGFP-LC3质粒稀释于250μlPBS中，轻轻混匀，将5μl GenEscort试剂稀释于250μl PBS中，充分混匀。然后将稀释好的250μl GenEscort试剂加入稀释过的250μl pEGFP-LC3质粒溶液中混合均匀，室温放置15分钟，获得500μl转染复合物。然后将500μl转染复合物平均加入预先铺满HepG2细胞的六孔板中。待细胞生长5个小时后，用滴管吸出液体，每孔加入4ml培养基继续培养24小时。将转染成功的细胞转入激光共聚焦专用培养皿，待细胞贴壁后，更换新鲜培养液，对照组不做处理，药物诱导组按比例加入复溶的自噬诱导培养基添加剂，诱导培养18h后置激光扫描共聚焦显微镜下检测肿瘤细胞的自噬情况。

实验结果：本实验中将转染了pEGFP-LC3的HepG2细胞用添加了自噬诱导培养基添加剂的培养基诱导培养18小时，然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察胞浆内自噬泡数量的变化。结果发现，自噬诱导培养基添加剂药物诱导18小时后，实验组细胞的胞浆内较对照组出现了较多EGFP-LC3标记阳性的、呈绿色荧光的自噬泡。

实施例4：Western blot检测LC3Ⅱ的表达，观察自噬诱导培养添加剂对A549细胞的自噬诱导作用

实验方法：将A549细胞接种于6孔培养板，待细胞生长至90％密合度后，更换新鲜培养液，对照组不做处理，药物诱导组按比例加入复溶的自噬诱导培养基添加剂，诱导培养18h后，RIPA裂解法提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转至PVDF膜，室温封闭2小时，鼠抗人LC3一抗4℃孵育过夜；洗膜3次，每次10分钟，加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，室温孵育2小时；洗膜3次，每次10分钟，ECL法显色，扫描观察LC3反应条带。

实验结果：本实验结果显示，对于A549细胞，经添加了自噬诱导培养基添加剂的培养基诱导培养18小时后，LC3-Ⅱ的表达量较对照组明显升高，代表细胞具有较高的自噬水平。

以上所述仅是本发明的优选方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干相似的变形和改进，这些也应视为本发明的保护范围之内。