本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种制备l-苹果酸的方法。
背景技术：
苹果酸,又名羟基丁二酸、羟基琥珀酸或1-羟基乙烷二羧酸,分子式为c4h6o5，分子量134.09，结构式为hoocchohch2cooh。苹果酸具有右旋（d-型）和左旋（l-型）两种旋光异构体及dl-型外消旋体三种型式产品。其中l-苹果酸，广泛存在于生物体中，作为三羧酸循环的一员参与细胞代谢；d-苹果酸人体不易代谢，吸入或吞咽其对人体有害，作为手性合成的手性源，可以合成许多重要的有机化合物。
l-苹果酸的生产最初是在培养黄曲霉时有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。后来，由糖类物质发酵来生产l-苹果酸，但是传统的发酵法生产l-苹果酸培养时间长、能耗大、产酸率低，糖的利用率不高，很难实现工业化生产。随着氨基酸行业逐步发展，发酵法生产技术l-苹果酸也有了长足的进步，但是l-苹果酸的工业平均转化率为70%-80%，尚有20%-30%富马酸残留，反应液中l-苹果酸的含量较低，大约为100g/l左右，目前国内尚无规模化的l-苹果酸生产方法。申请人之前的发明专利“一种直接发酵法生产l-苹果酸的方法”以及“一种l-苹果酸提取新工艺”通过优化工艺以及菌株合理配伍，大幅度提高了苹果酸的产量以及糖酸转化率，但是黄曲霉会产生一定量的黄曲霉素，产品中会残留黄曲霉毒素，后续分离步骤繁琐，增加了企业成本。
技术实现要素：
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种制备l-苹果酸的方法。
本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：
一种制备l-苹果酸的方法，其包括如下步骤：
按照混合种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例将混合种子液转入发酵罐中培养，温度33℃，培养3d，然后添加碳酸钙，维持碳酸钙的浓度在80g/l，继续发酵3d，停止发酵，得到苹果酸发酵液。
具体地，所述混合种子液按照如下工艺制备而得：
1）将米曲霉菌液按照8％的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养16小时得到种子液a；所述种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，ph值6.0；
2）将寄生曲霉菌液按照6％的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为32℃，摇床转速为200r/min，培养24小时得到种子液b；所述种子罐的培养基组分为：木糖10g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，ph值6.5；
3）将种子液a和种子液b按照2:1的体积比混匀得到混合种子液。
优选地，所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米浆12g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，ph值6.2。
优选地，所述米曲霉为米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584，所述寄生曲霉为寄生曲霉(aspergillusparasiticus)cicc40365。
优选地，所述米曲霉菌液和寄生曲霉菌液的浓度均为1×108cfu/ml。
本发明的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：
针对现有技术的缺陷，本发明经过多次尝试，采用米曲霉和寄生曲霉按照一定比例混合，二者之间具备一定的协同作用，比常规的米曲霉发酵方法，能够提高苹果酸的产量，而且大大降低了黄曲霉毒素的产生，简化了后续分离步骤，降低了企业成本。本发明采用两种不同菌株独立增殖制备种子液的步骤，避免了相同培养工艺造成的菌株增殖效率慢，菌株活性低等缺陷；本发明发酵工艺中添加碳酸钙来维持碳酸钙浓度，提高了发酵效率。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种制备l-苹果酸的方法，其包括如下步骤：
将米曲霉(aspergillusoryzae)菌液（浓度为1×108cfu/ml)按照8％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养16小时得到种子液a，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，ph值6.0；
将寄生曲霉(aspergillusparasiticus)菌液（浓度为1×108cfu/ml)按照6％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为32℃，摇床转速为200r/min，培养24小时得到种子液b，其中，种子罐的培养基组分为：木糖10g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，ph值6.5；
将种子液a和种子液b按照2:1的体积比混匀得到混合种子液，然后按照混合种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养3d，然后添加碳酸钙，维持碳酸钙的浓度在80g/l，继续发酵3d，停止发酵，得到苹果酸发酵液；
所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米浆12g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，ph值6.2；
所述米曲霉为米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584，所述寄生曲霉为寄生曲霉(aspergillusparasiticus)cicc40365（可见微生物学通报2014年，41（6）吴悦等）。
l-苹果酸的测定：采用2,7—萘二酚显色法，取样品溶液1.0ml，加入6.0ml分析纯的浓硫酸，再加入0.1ml2,7—萘二酚溶液，接着在100℃水浴中加热20min，取出待冷却至室温后，于385nm下进行比色测定，以蒸馏水作对照校正仪器零点。用标准样品先作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，385nm处吸收值即od385为纵坐标，通过未知样品在385nm处的od值，则可在标准曲线上查得相应的苹果酸含量。检测l-苹果酸产量为159.4g/l，且残糖含量为1.1g/l。
实施例2
一种制备l-苹果酸的方法，其包括如下步骤：
将米曲霉(aspergillusoryzae)菌液（浓度为1×108cfu/ml)按照8％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养16小时得到种子液，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，ph值6.0；
按照种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养3d，然后添加碳酸钙，维持碳酸钙的浓度在80g/l，继续发酵3d，停止发酵，得到苹果酸发酵液；
所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/l，葡萄糖80g/l，玉米浆12g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，ph值6.2；
所述米曲霉为米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。
l-苹果酸的测定方法同实施例1。检测l-苹果酸产量为97.8g/l，且残糖含量为4.6g/l。
实施例3
本发明检测了碳酸钙对生产l-苹果酸产量的影响。发酵第三天不添加碳酸钙，其他同实施例1，经过检测，l-苹果酸产量为146.7g/l，残糖含量为1.8g/l。
本发明还检测了采用申请人之前的专利技术“一种直接发酵法生产l-苹果酸的方法”制得发酵液中黄曲霉毒素含量为12.69ug/l；而本申请实施例1制得发酵液中黄曲霉毒素含量小于0.5ug/l。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。