本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种快速筛查脆性x综合征致病基因fmr1的cgg重复序列的方法及试剂盒。
背景技术：
：脆性x综合征(fragilexsyndrome，fxs)是引起遗传性智力低下和孤独症谱系障碍最常见的单基因病，95％以上的脆性x综合征患者是由于fmr1基因5’非编码区cgg重复序列扩增导致fmrp表达沉默所致。cgg重复在人群中具有高度多态性，正常重复次数为6-44，fmr1基因表达正常，无明显临床表现。中间重复次数为45-54，子代可扩增为前突变，无明显临床表现。cgg重复数突变至55-200的个体称为前突变携带者(premutation，pm)，在世代传递中前突变cgg重复序列极不稳定，cgg数目大于100的女性前突变携带者生育cgg数目超过200的全突变患儿(fullmutation，fm)风险达94-100％。全突变重复次数大于200，常伴随cpg岛异常甲基化，fmr1基因失活，导致fmrp表达减少或缺失。fmrp的主要生物学功能是负性调控自身靶mrna的翻译。fmrp缺失引起神经元靶mrna过度翻译，破坏正常的突触可塑性，从而导致脆性x综合征的发生引起不同程度的临床症状。脆性x综合征在男性患病率约1/7000，女性患病率约为1/11,000。不同种族、不同民族其患病率有所差异。在高加索人群中脆性x综合征男性患病率为1/3,717-1/8,918，女性前突变的发生率为1/130-1/260；非洲裔美国男性脆性x综合征的患病率为1/2,545；在亚洲地区，韩国对5470名育龄妇女进行脆性x综合征的筛查，发现7例前突变携带者，发生率为1/781。中国台湾对1002名育龄妇女进行脆性x综合征的筛查，未发现前突变携带者。我们对我国汉族1113例样本进行分析仅发现1例前突变女性携带者，在我国大陆地区尚无大规模的流行病学调查。早在1977年sutherland等首次用g显带技术发现并证明在xq27.3带处存在一个脆性位点(fraxa)，在fmr1基因发现以前，诊断该病的主要方法是应用细胞遗传学方法对此脆性位点进行检测。该方法费时费力，假阳性率高，检出率低，且只能对部分患者作出诊断，无法对前突变携带者作出诊断，容易造成误诊、漏诊。1991年verkerk克隆出fmr1基因后，分子诊断技术迅速发展起来，逐步取代细胞遗传学检查。欧美国家制定的检测规范要求采用pcr和southern-blot相结合的模式对脆性x综合征进行临床诊断。我国第一例脆性x家系是在1983年，由中国科学院遗传研究所许碧珍、周宪庭等人报道。脆性x综合征在我国的临床分子诊断和科研工作开展较少。由于高gc序列扩增的困难性，普通实验室难以进行脆性x检测，易发生误诊或漏诊。虽然目前也有国际公司推出pcr为基础的检测试剂盒，但由于检测所需仪器比较昂贵，试剂盒价格高，脆性x检测结果比较复杂需要经验丰富的检测人员进行解析等问题限制了试剂盒的广泛应用。southernblot分析方法能确定较大cgg重复序列的数目并能评估fmr1基因甲基化程度，但一次实验需要10微克高质量dna，且对扩增次数较少前突变携带者或者嵌合体可能漏诊或误诊，无法准确读取cgg尺寸，并存在实验技术复杂、成本高、周期长等问题。技术实现要素：本发明提供一种用于检测脆性x综合征致病基因fmr1的cgg重复数目的试剂盒。为了实现发明目的，我们采用了以下技术方案：设计一高cg含量pcr扩增体系，包括选择热启动的超高热稳定性的dna聚合酶，设计特异引物，优化出独特的pcr体系增强剂，增加45、55、100个cgg重复的标准品对照以准确确定样本的尺寸范围。本发明提供了用于检测脆性x综合征致病基因fmr1的cgg重复数目的pcr试剂盒，包括dna聚合酶、反应溶液、增强剂、dntps、特异引物和标准品对照。本发明的引物包括：用于检测cgg重复数目pcr系统i反应体系的引物fmr1-f1、fmr1-r1，及用于检测扩增的cgg重复的pcr系统ii反应体系引物fmr1-t1、fmr1-cgg7、fmr1-r2、fmr1-f2、fmr1-t2和fmr1-ccg7。所述pcr系统i反应体系上游引物fmr1-f1核苷酸序列为seqidno：1，下游引物fmr1-r1的核苷酸序列为seqidno：2。所述pcr系统ii反应体系中，针对cgg重复序列的上游引物为fmr1-t1和fmr1-cgg7，引物fmr1-t1为一段与人类基因组无关的序列，其核苷酸序列为seqidno：3，引物fmr1-cgg7包含5’端的与fmr1-t1相同的序列和7个cgg三核苷酸重复，其核苷酸序列为seqidno：4；下游引物fmr1-r2核苷酸序列为seqidno：5。所述pcr系统ii反应体系中，针对ccg重复序列的上游引物为fmr1-f2，其核苷酸序列为seqidno：6；下游引物为fmr1-t2和fmr1-ccg7，fmr1-t2为一段与人类基因组无关的序列，其核苷酸序列为seqidno：7，引物fmr1-ccg7包含5’端的与fmr1-t2相同的序列和7个ccg三核苷酸重复，其核苷酸序列为seqidno：8。以上引物信息详见下表表1：表1引物序列信息seqidno：1fmr1-f1aggttcggcctcagtcaggcgctcagseqidno：2fmr1-r1agctcctccatcttctcttcagcseqidno：3fmr1-t1caggaaacagctatgaccgtgccgseqidno：4fmr1-cgg7caggaaacagctatgaccgtgccgcggcggcggcggcggcggcggseqidno：5fmr1-r2cattggagccccgcacttccaccacseqidno：6fmr1-f2ttcggtttcacttccggtggaseqidno：7fmr1-t2atggctatgcgtagggtctttgtcseqidno：8fmr1-ccg7atggctatgcgtagggtctttgtcccgccgccgccgccgccgccg本发明还提出了一种针对高cg含量pcr体系的增强剂，其成分包括bsa、1，2-丙二醇、海藻糖、环丁砜、以及甜菜碱和dmso中的三种。本发明采用的检测设备需要区分样本的尺寸范围，可为琼脂糖凝胶电泳，毛细管电泳abi3130、3500、3730系列均可，或者安捷伦2100生物分析仪。pcr体系中高热稳定性的dna聚合酶可以是：taqdnapolymerase(thermofisher公司)、phusionhigh-fidelitydnapolymerase(thermofisher公司)、iprooftmhighfidelitydnapolymerase(bio-rad公司)、deepdnapolymerase(newenglandbiolabs公司)和masteramptmdnapolymerase(epicentre公司)等，但不限制在以上种类的高热稳定性dna聚合酶。扩增后的产物进行荧光扫描，读取产物尺寸，利用公式，计算重复次数。本发明通过高cg含量pcr体系，高热稳定性dna聚合酶扩增cgg重复经荧光扫描后，与标准品比较可准确确定待测样品的cgg重复所在区间。本发明所需生物样本可以来源于人的血液、体液和各种组织或细胞系。用来检测脆性x综合征位点cgg重复数目的dna可选择以上来源的样本提取的gdna。产前诊断的绒毛细胞、羊水、脐血也同样适用。本发明优选荧光扫描的方法来分离核酸片段大小，在临界位置的样本确定范围时，进一步参考标准品尺寸，即可准确确定cgg重复所在的范畴。本试剂盒用于大规模高通量人群筛选，在使用96孔板或384孔板时，加入55、100个cgg重复的标准品，板间可进行平行比较，同时可确定试剂盒的准确性和检测精确度。本发明的试剂盒用于大样本量包括男性和女性快速筛查脆性x综合征位点fmr1的cgg重复数目，确定重复数目属于正常、过渡区间还是脆性x前突变或全突变范围，筛查出脆性x致病基因的携带者，该方法可应用于脆性x遗传检测、产前诊断和胚胎移入前诊断。试剂盒具有快速、高通量、样本量少、价格低的特点。附图说明图1：cgg重复序列两侧引物示意图。图2：脆性x综合征位点快速筛查流程图。图3：pcr系统i筛查前突变女性结果图。图4：pcr系统ii筛查单峰女性结果图。具体实施方式以下通过实施例来进一步阐述本发明。但是应该理解，所述实施例只是用于举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。实施例1：制备脆性x综合征快速筛查试剂盒1、引物设计在fmr1基因cgg重复序列上游5’端和下游3’端200bp内设计一对pcr系统i特异上游引物fmr1-f1和下游引物fmr1-r1，扩增目的基因组包括cgg重复区、5’侧翼区和3’侧翼区。5’侧翼区为141bp，3’侧翼区为80bp，扩增片段长度为(221+3xn)bp，n代表cgg重复数。计算cgg重复数的公式为：cgg重复数＝(pcr产物长度-221)/3。在fmr1基因cgg重复区设计与cgg重复序列特异结合上游引物fmr1-cgg7，并在其5’端添加人类基因组无关序列caggaaacagctatgaccgtgccg，引物fmr1-t1序列为该添加序列caggaaacagctatgaccgtgccg；在fmr1基因cgg重复序列3’端侧翼区200bp内设计特异下游引物fmr1-r2；fmr1-cgg7、fmr1-t1和fmr1-r2扩增片段长度为(130+3×n)bp，n代表cgg重复数。在fmr1基因cgg重复序列5’端侧翼区200bp内设计特异上游引物fmr1-f2；在fmr1基因cgg重复区设计与cgg重复序列互补结合的下游引物fmr1-ccg7，并在其5’端添加人类基因组无关序列atggctatgcgtagggtctttgtc，引物fmr1-t2序列为该添加序列atggctatgcgtagggtctttgtc；fmr1-f2、fmr1--ccg7和fmr1-t2扩增片段长度为(133+3×n)bp，n代表cgg重复数。2、准备2×pcr增强剂2×pcr增强剂组分如下：甜菜碱溶液；dmso；bsa、1，2-丙二醇、海藻糖、环丁砜中的三种。2×pcr增强剂各组分终浓度如下：甜菜碱为4mol/l；dmso为2％；bsa为10μg/ml；1，2-丙二醇为0.8mol/l、海藻糖为0.1mol/l、环丁砜为0.2mol/l。3、准备pcr反应液pcr系统i反应液组分如下：10×pcr缓冲液，缓冲液包括浓度为100mmol/l、ph值为8.3的tris-hcl和500mmol/lkcl；浓度为25mmol/l的mgcl2；浓度为10mmol/l的dntp；浓度为10μmol/l的上游引物fmr1-f1；浓度为10μmol/l的下游引物fmr1-r1；活性为5u/μl的dna聚合酶taqdnapolymerase(thermofisher公司)；2×pcr增强剂(4mol/l甜菜碱；10μg/mlbsa；0.8mol/l1，2-丙二醇)；双蒸水。pcr系统ii反应液组分如下：10×pcr缓冲液，缓冲液包括浓度为100mmol/l、ph值为8.3的tris-hcl和500mmol/lkcl；浓度为25mmol/l的mgcl2；浓度为10mmol/l的dntp；活性为5u/μl的dna聚合酶deepdnapolymerase(newenglandbiolabs公司)；2×pcr增强剂(2％dmso；0.1mol/l海藻糖、0.2mol/l环丁砜)；双蒸水；引物组可单独使用引物组①或引物组②。引物组①(浓度为10μmol/l的目的dna序列上游引物fmr1-cgg7，浓度为10μmol/l的目的dna序列下游引物fmr1-r2，浓度为0.1μmol/l的fmr1-t1)；引物组②(浓度为10μmol/l的目的dna序列上游引物fmr1-f2，浓度为10μmol/l的目的dna序列下游引物fmr1-ccg7，浓度为0.1μmol/l的fmr1-t2)。实施例2：女性前突变用市售基因组dna提取试剂盒，提取女性样本外周血基因组dna，浓度至少为50ng/μl，260/230值大于2.0，260/280值大于1.8。使用实施例1的试剂盒准备的pcr系统i反应体系：在200μlpcr薄壁管中配制20μlpcr体系。pcr反应体系如下：其中引物fmr1-f1和fmr1-r1序列分别为：seqidno：1和seqidno：2。pcr扩增程序：98℃预变性10分钟；97℃35秒→64℃35秒→68℃4分钟，40个循环；68℃延伸10分钟。反应结束后，取1μlpcr产物，与10μl去离子甲酰胺和1μldna分子内标rox-500混合，95℃变性5分钟，冰上冷却。混合物用abi3730进行毛细管电泳，进样电压为2.5kv，20秒，电泳时间为4000秒。pcr产物毛细管电泳图如图3所示。结果显示，左边是毛细管电泳检测结果，两例前突变女性除有一正常范围内300bp左右的峰簇外，分别还有一前突变范围内470bp和630bp左右的峰簇，而正常女性300bp和330bp左右的两簇均在正常范围内；按照cgg重复数公式推算出两例前突变女性cgg重复数分别为cgg29/cgg87和cgg29/cgg140，正常女性cgg重复数为cgg29/cgg40。右边是上下分别前突变和正常女性的southernblot验证结果，箭头指示为正常等位基因2.8kb和5.2kb条带，前突变女性除正常等位基因2.8kb和5.2kb条带外，还有一大于2.8kb的前突变条带。实施例3：女性单峰按实施例2使用pcr系统i检测为单峰的女性，进行实施例3检测。使用实施例1的试剂盒准备pcr系统ii反应体系：在200μlpcr薄壁管中配制20μlpcr体系。pcr反应体系如下：其中引物fmr1-f2序列为：seqidno：6；fmr1-r2序列为：seqidno：5；fmr1-cgg7序列为seqidno：4；fmr1-ccg7序列为seqidno：8；fmr1-t1序列为seqidno：3；fmr1-t2序列为seqidno：7。pcr扩增程序：98℃预变性10分钟；97℃45秒→60℃45秒→68℃8分钟，10个循环；68℃延伸10分钟。反应结束后，取1μlpcr产物，与10μl去离子甲酰胺和1μldna分子内标rox-500混合，95℃变性5分钟，冰上冷却。混合物用abi3730进行毛细管电泳，进样电压为2.5kv，20秒，电泳时间为4000秒。pcr产物毛细管电泳图如图4所示。结果显示，左边是毛细管电泳检测结果，全突变女性(cgg29/cgg＞200)在pcr系统i筛查中与正常单峰女性(cgg36/cgg36)一样，只有一正常范围内的峰簇。pcr系统ii进一步检测显示全突变女性除有代表正常等位基因agg插入位点的3个峰簇外，还有一代表全突变或前突变等位基因特异的梯形峰群，而正常单峰女性仅有一代表正常等位基因agg插入位点的4个峰簇；右边是上下分别全突变和正常单峰女性的southernblot验证结果。箭头指示为正常等位基因2.8kb和5.2kb条带，全突变女性除正常等位基因2.8kb和5.2kb条带外，还有一大于5.2kb的全突变条带。当前第1页12