一种检测水稻粒宽等位基因的特异性PCR分子标记和方法与流程

本发明属于水稻基因型检测
技术领域：
，具体涉及一种检测水稻粒宽等位基因的特异性pcr分子标记和方法。
背景技术：
：粒宽是影响水稻产量的主要因素之一。籽粒宽度与籽粒的长宽比、籽粒重量和稻米品质具有一定相关性，在实际育种应用上常被作为一个重要表型指标。在常规育种中，育种家们为了改良水稻籽粒宽度，主要是通过观察水稻成熟后籽粒的外观表型来进行多世代系选。由于水稻的生长周期较长，以及生长环境对粒型的影响，这种通过肉眼观察的方法太耗时间，且准确度有限。现有粒宽常规表型检测技术的缺点是：(1)费时。为了确定目标水稻材料粒宽，一般需要种植一个生长季节，待完全灌浆成熟后，从植株上取样(一般≥50粒)进行测量。测量工具主要是游标卡尺，测量要求是先对籽粒进行饱满程度筛选，然后逐粒考察，最后取平均值。(2)环境影响大。水稻的粒型性状(包括粒宽、粒长等)受种植地点的环境影响(如光照时间、温度)较大，品种之间的粒型差异随种植地点的不同而发生变化。由于存在以上缺点，急需出现一种快速筛选水稻籽粒宽度的工具和方法。技术实现要素：为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种检测水稻粒宽等位基因的特异性pcr分子标记和方法。gw5/qsw5是一个目前已知的控制水稻籽粒宽度的主要基因，在我国广泛分布的栽培稻中，该基因位点上主要有3种等位变异，分别为gw5k、gw5n和gw5z，其中gw5n对应的籽粒宽度最高。也就是说，直接对水稻的基因型进行检测，并根据检测结果直接筛选出具有理想籽粒宽度的基因型水稻材料进行育种，不但能够缩短育种周期，并且因为基因型不受栽培环境影响，也大大提高了育种效率。为了对gw5/qsw5位点变异进行检测，发明人仔细研究并测序了一些当前主要的水稻育种亲本，并对它们的gw5/qsw5基因进行了测序和序列对比，发现与gw5k型相比，gw5z型主要存在一处650bp的缺失，gw5n型主要存在一处1211bp的缺失。根据这些差异，进而设计出了一种检测水稻粒宽等位基因的特异性pcr分子标记和方法。本发明所采用的技术方案为：一种检测水稻粒宽等位基因的特异性pcr分子标记，包括引物p5和引物p9，引物p5的上游引物的序列如seqidno：1所示，引物p5的下游引物的序列如seqidno：2所示，引物p9的上游引物的序列如seqidno：3所示，引物p9的下游引物的序列如seqidno：4所示。其中，seqidno：1为5'-ttttcaagctagcgttggtc-3'；seqidno：2为5'-cagccggcaacttgc-3'；seqidno：3为5'-acacctgcaagtttaaattccc-3'；seqidno：4为5'-tcgatccctactcttgtgcat-3'。所述引物p5和引物p9的扩增片段长度分别为441bp和214bp。在设计所述特异性pcr分子标记时，首先对黄华占、珍汕97b、特青、日本晴、松粳6号、密阳46、9311、协青早b和kasalath这九个水稻品种的gw5/qsw5基因的主要编码区段的序列进行了测序，基于这九个水稻品种的gw5/qsw5基因序列设计了所述特异性pcr分子标记；而在现有技术中，大部分水稻品种的gw5/qsw5基因序列还不属于现有技术，有些已经公开的gw5/qsw5基因序列的水稻品种数目很少，差异区间分布广泛，如果直接全基因扩增，片段长度太大且等不容易区分主要的等位基因类型。本发明中，发明人使用的九个水稻品种的gw5/qsw5基因主要编码区段的序列如下：9311水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：5所示；kasalath水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：6所示；黄华占水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：7所示；密阳46水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：8所示；日本晴水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：9所示；松粳6号水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：10所示；特青水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：11所示；协青早b水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：12所示；珍汕97b水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：13所示；基于以上自测的gw5/qsw5基因序列，发明人设计得到了所述特异性pcr分子标记。如图1所示，根据不同gw5/qsw5基因序列，申请人设计了所述特异性pcr分子标记，以实现将不同基因型分别检出的目的。本发明还提供了一种使用所述特异性pcr分子标记的检测水稻gw5/qsw5位点变异的方法，包括以下步骤：a、dna提取：提取被测水稻的dna；b、pcr扩增：以提取的被测水稻的dna为模板，分别使用引物p5和引物p9进行pcr扩增；c、结果分析：当被测水稻没有引物p5和引物p9的扩增产物时，被测水稻的基因型为gw5n；当被测水稻同时有引物p5和引物p9的扩增产物时，被测水稻的基因型为gw5k；当被测水稻只有引物p5的扩增产物没有引物p9的扩增产物时，被测水稻的基因型为gw5z。使用所述检测方法，无需等待一整个生长季节即可对水稻gw5/qsw5基因型进行检测，进而从基因型即可得到该水稻幼苗的粒宽和粒重等重要信息，极大的缩短了育种周期，并且因为基因型不受环境影响，也大大提高了育种的效率。本发明以基因型检测为手段，针对gw5/qsw5这一控制水稻粒宽和粒重的主要基因位点，发明得到一种特异性pcr分子标记。利用所述特异性pcr分子标记可以在水稻苗期检测检测出gw5/qsw5的基因型，即是否具有较大的粒宽和千粒重(高产潜力的主要表现内容)，为水稻育种特别是高产育种提供了一个快速筛选的工具。并且，整个检测过程操作简单且准确性高。一般来说，在水稻的幼苗期即可进行dna的提取，具体提取方法为：步骤a中，将被测水稻的种子，在25-35℃下培养，发芽5-10天后，从幼苗中提取dna。进一步地，将被测水稻的种子，在30℃下培养，发芽7天后，从幼苗中提取dna。步骤b中，pcr扩增的扩增体系为：总体积为20μl，包括tris-hcl33.5mm、(nh4)2so48.0mm、mgcl21.5mm、tween-200.05％、dntps0.2mm、上游引物和下游引物各3.3ng/μl、taqdna聚合酶2.0单位和模版dna50ng。其中，tween-20的0.05％为体积百分数。所述tris-hcl缓冲液的ph值为8.8。步骤b中，使用的pcr扩增程序为：在94℃温度下预变性2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成pcr扩增程序。采用以上pcr扩增体系和扩增程序，能够保证pcr扩增的顺利进行，以得到尽可能多的扩增产物，有利于下一步的检测。为方便观测扩增结果，优选的技术方案是，步骤c中，取4μl扩增产物上样于2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。为方便观察，进一步地，在120v恒定电压下电泳2小时后，使用dured核酸染料漂染。本申请中，被测水稻品种包括但不限于黄华占、镇籼241、协青早b、珍汕97b、特青、特籼占13、密阳46、楚粳香1号和kasalath。本发明的有益效果为：本发明提供了一种检测水稻粒宽等位基因的特异性pcr分子标记和方法，利用所述特异性pcr分子标记可以在水稻苗期检测检测出gw5/qsw5的基因型，即是否具有较大的粒宽和千粒重(高产潜力的主要表现内容)，为水稻育种特别是高产育种提供了一个快速筛选的工具。并且，整个检测过程操作简单且准确性高。附图说明图1为本发明中特异性pcr分子标记与不同水稻品种等位变异情况的关系图；图2为实施例3中九个水稻品种引物p5的扩增产物的电泳图；图3为实施例3中九个水稻品种引物p9的扩增产物的电泳图；图4为实施例4中47个水稻品种引物p5的扩增产物的电泳图；图5为实施例4中47个水稻品种引物p9的扩增产物的电泳图。具体实施方式下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例1一种检测水稻粒宽等位基因的特异性pcr分子标记，包括引物p5和引物p9，引物p5的上游引物的序列如seqidno：1所示，引物p5的下游引物的序列如seqidno：2所示，引物p9的上游引物的序列如seqidno：3所示，引物p9的下游引物的序列如seqidno：4所示。其中，seqidno：1为5'-ttttcaagctagcgttggtc-3'；seqidno：2为5'-cagccggcaacttgc-3'；seqidno：3为5'-acacctgcaagtttaaattccc-3'；seqidno：4为5'-tcgatccctactcttgtgcat-3'。实施例2一种使用实施例1所述特异性pcr分子标记的检测水稻gw5/qsw5位点变异的方法，包括以下步骤：a、dna提取：将被测水稻的种子，在30℃下培养，发芽7天后，从幼苗中提取dna；b、pcr扩增：以提取的被测水稻的dna为模板，分别使用引物p5和引物p9进行pcr扩增；pcr扩增的扩增体系为：总体积为20μl，包括tris-hcl(ph值＝8.8)33.5mm、(nh4)2so48.0mm、mgcl21.5mm、tween-200.05％、dntps0.2mm、上游引物和下游引物各3.3ng/μl、taqdna聚合酶2.0单位和模版dna50ng；使用的pcr扩增程序为：在94℃温度下预变性2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成pcr扩增程序；c、结果分析：取4μl扩增产物加入加样缓冲液后上样于2％琼脂糖凝胶电泳；接通电极，在120v恒定电压下电泳2小时，关闭电源；取下凝胶，经dured核酸染料漂染后于凝胶成像仪检测；当被测水稻没有引物p5和引物p9的扩增产物时，被测水稻的基因型为gw5n；当被测水稻同时有引物p5和引物p9的扩增产物时，被测水稻的基因型为gw5k；当被测水稻只有引物p5的扩增产物没有引物p9的扩增产物时，被测水稻的基因型为gw5z。实施例3本实施例为对九个不同品种的水稻进行的测试实验。本实施例选取了九个水稻品种，分别为：黄华占、镇籼241、协青早b、珍汕97b、特青、特籼占13、密阳46、楚粳香1号和kasalath；使用实施例2所述的检测方法，进行gw5/qsw5的突变情况检测，结果如图2、图3和表1所示：表1：九个水稻品种的检测结果表水稻品种p5产物p9产物gw5/qsw5的基因型黄华占有有k镇籼241有有k协青早b有无z珍汕97b有无z特青有无z特籼占13有有k密阳46无无n楚粳香1号无无nkasalath有有k结果显示，黄华占、镇籼241、特籼占13和kasalath呈现k型，协青早b、珍汕97b和特青呈现z型，密阳46和楚粳香1号呈现n型。与实际基因型相一致，说明本发明的检测方法准确性较好。实施例4本实施例为47份水稻样品的验证实验。本实施例从全国征集了47份水稻品种的种子，粒型表现具有明显差异。将每份种子分为两部分，一部分用于田间种植和粒型表型考察，另一部分用实施例所述的检测方法，进行gw5/qsw5的突变情况检测。gw5/qsw5的突变情况检测结果如图4、图5和表2所示：表2：47份水稻品种的基因型检测结果表序号p5产物p9产物gw5/qsw5的基因型序号p5产物p9产物gw5/qsw5的基因型序号p5产物p9产物gw5/qsw5的基因型1有无z17无无n33有有k2无无n18无无n34有有k3无无n19无无n35有有k4无无n20无无n36有有k5无无n21有有k37有有k6无无n22有有k38有有k7有有k23有有k39有有k8无无n24有有k40有有k9无无n25有有k41有有k10有有k26有有k42有有k11无无n27有有k43有无z12有无z28有有k44有有k13无无n29有有k45无无n14无无n30有有k46有有k15无无n31有有k47有无z16无无n32有有k47份水稻品种经田间种植和粒型表型考察后，测得的表型结果以及实际基因型如表3所示：表3：47份水稻品种的粒型表型及实际基因型表序号名称长均值(mm)宽均值(mm)千粒重(g)基因型序号名称长均值(mm)宽均值(mm)千粒重(g)基因型序号名称长均值(mm)宽均值(mm)千粒重(g)基因型1晋稻9号7.343.2924.72z17辽农99118.043.0829.04n33新山软占9.691.9118.60k2晋稻10号7.103.0324.82n18辽粳92-347.133.3626.82n34华航一号8.412.0216.40k3宁粳29号7.743.1725.35n19沈农7026.973.2225.12n35胜巴丝苗9.082.1521.27k4宁香稻2号7.822.9827.40n20沈农97416.973.4225.85n36华航丝苗8.542.1820.52k5宁粳36号7.343.0123.87n21沈稻4号8.542.1017.27k37金航丝苗8.612.1920.73k6九稻196.933.1324.57n22辽粳288.832.0817.72k38野籼占6号10.011.9219.20k7宁粳21号7.552.9024.03k23沈9888.272.2320.10k39泰四占10.702.3126.58k8通357.153.2525.93n24丹粳128.172.0215.50k40粤泰丝苗8.872.4823.37k9津原95407.013.2026.23n25普粘8号8.401.9915.62k41粤秀占8.202.7426.60k10津原177.482.9421.77k26龙盾1038.901.9617.42k42广超5219.062.3222.27k11津原246.933.2024.37n27龙盾1048.312.2921.47k43广超丝苗8.302.8226.15z12津原117.273.2026.17z28龙盾1058.392.1818.68k44象牙香占8.572.6426.45k13津原277.173.1926.15n29三江1号8.562.1319.45k45巴太香占8.162.8226.67n14津粳杂四7.123.1825.30n30北稻1号8.972.1920.78k46黄莉占7.392.9825.62k15津稻5号7.493.2827.83n31北糯1号8.672.3323.13k47丰粤占8.172.6925.22z16中津1号6.783.1924.72n32籼油占8.472.2821.88k结合基因型和表型，发明人对47份水稻样品的粒型表型和基因型进行了统计学分析，具体结果如表4-6所示：表4：47份水稻样品长均值和基因型统计表表5：47份水稻样品宽均值和基因型统计表表6：47份水稻样品千粒重均值和基因型统计表从表4-6能够看出，不同基因型的粒型表型有着较为显著的统计学差异，证明本发明的检测结果能够直接应用于育种领域，本发明为水稻育种特别是高产育种提供了一个快速筛选的工具和方法。最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>中国水稻研究所<120>一种检测水稻粒宽等位基因的特异性pcr分子标记和方法<130>2010<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>1ttttcaagctagcgttggtc20<210>2<211>15<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>2cagccggcaacttgc15<210>3<211>22<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>3acacctgcaagtttaaattccc22<210>4<211>21<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>4tcgatccctactcttgtgcat21<210>5<211>1864<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>5gttggtgatgttatggagtattgcttcatttttaaatgaaaggcaccatcttagattttt60tttcctttagttgattggttgtagtactatattttctaagttattataaaataaatatgc120gatatatatttgattgccattatcgagttagtatatcttcactctgtttatattttaaag180ctgtgtactcctagctatagcactaaagaccgaacttagtatggactaattacagcgata240accatcggtaattgctactactccatgcagtacttggtttccatatttttgcatgcgtcg300gtcgttggaggcaagcaagcaagctgcagcgtcgtcagaggtagacgcatcgatgttgtt360cttccatgtccttcgaatcttcatgattgccgctctctgcttaattactgttctcttcac420gcacaccgtccaaatcccatccatctatccatccgtccacacacctgcaagtttaaattc480ccatgcagttactacatgaacagtactgctgtcaagtttaattaatttctactacacacg540aattgaattcaaatggtactaggtacaagtactccactagtacgaccatgatgtttccca600cctgaaagcaacacagaatacgttcgtacgtacacgtacagtaaaccacaataatgcaca660agagtagggatcgatggagagtacatgcaattgctcatcacttgtcaccatcactggttc720aaatttgcctactctagatctcgatcgtggtactgcttctaaccataatgatcggtacat780gttcaaattcgaaactcaaaaaatgtgtgtacaatacggccgggagagatgaacatatat840acagtactcataattattaaccatgcatgggcattaataaaagtagtactccgtatatag900cttccaagcaaggctacatactagaatcatactgtatcttgattgccagaggtgcaatca960tgcatagacatacttaagatcagggctagctagttcaggtgatgaacacatgctttgtac1020cccttgtaggatgcatggcaccaagtcgacattggagtacacacaccctggccatgctgc1080acgtgtagataagagtaccacctatcatcatcaatcacgcaatatggtctactgtgtctc1140tttgattgggtgtaatataatatcggccactgtaaaaatttaaaatttaaaacttagtaa1200ttttaatttcgaagttgattttatgatatgctcaacgtatctcttttttttcaagctagc1260gttggtctttaaaagtgcgtttgtttataaggttagggtgagacttttagcttgtgtttg1320gttagtgggatatggaatgagatgggttaggtcgatcctatttttcgagctgtttgggta1380gagggatgtgtaggacgggatgatcctagatgggaatattcttcccagatccaggacgag1440gtggtccgccaaaatcggctggactaatccatcccactttgatggagcgaatggcattag1500ctccttccgcctcctgctcggctccgccactggccgcccgttcctcctcctccgtctgct1560ccctcccacggcgtccgtccctcctcctcttcctgctccctcccccgatgccgctccgtc1620ctcctccgcctgctccctcccccggcgcccgtccctcctcctctgcccgctcgccaagtt1680gccggctgcaccgcccgctcgtgcagctcctcctgccatccgcgccgccggtcgctgatc1740gcgccgctcctccttctgcctactccctccccggcaccgctcctccttctgcctactccc1800tcccccggcaccactccgtcctcctccgcttgctccctcccccggcgccgctcctcccca1860gcgc1864<210>6<211>11150<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>6aattcaaatggtactaggtacaagtactccactagtacgaccatgatgtttcccacctga60aagcaacacagaatacgttcgtacgtacacgtacagtaaaccacaataatgcacaagagt120agggatcgatggagagtacatgcaattgctcatcacttgtcaccatcacttggttcaaat180ttgcctactctagatctcgatcgtggtactgcttctaaccataatgatcggtacatgttc240aaattcgaaactcaaaaaatgtgtgtacaatacggccgggagagatgaacatatatacag300tactcataattattaaccatgcatgggcattaataaaagtagtactccgtatatagcttc360caagcaaggctacatactagaatcatactgtatcttgattgccagaggtgcaatcatgca420tagacatacttaagatcagggctagctagttcaggtgatgaacacatgctttgtacccct480tgtaggatgcatggcaccaagtcgacattggagtacacacaccctggccctgctgcacgt540gtagataagagtaccacctatcatcatcaatcacgcaatatggtctactgtgtctctttg600attgggtgtaatataatatcggccactgtaaaaatttaaaatttaaaacttagtaatttt660aattttgaagttgattttatgatatgctcaacgtatctcttttttttcaagctagcgttg720gtctttaaaagtgcgtttgtttataaggttagggtgagacttttagcttgtgtttggttg780gtgggatatggaatggaatgggttgggtcgatcccatttttcaagctatttgggtagagg840gatgtgtaggacgggatgatcctagatgggaatattcttcccagatccaggacgaggtgg900tccgccaaaatcggctggactaatccatcccactttgatggagcgaatggcgtt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