本发明涉及生物技术领域，尤其涉及脂肪间充质干细胞的无血清培养基。
背景技术：
干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。间充质干细胞(MSC, mesenchymal stem cells)是干细胞的一个研究分支，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。若间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供脂肪间充质干细胞的无血清培养基，采用本发明的脂肪间充质干细胞的无血清培养基进行细胞培养，具有细胞增殖能力强，细胞均一性好，纯度高的特点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
脂肪间充质干细胞的无血清培养基，由DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物5-10％ (v/v)
维生素C 30- 100ng/ml
干细胞生长因子0.5-10ng/ml
L-谷氨酰胺1-5mmol/ml
表皮生长因子1-25ng/ml
转化生长因子0.5-8ng/ml
成纤维细胞生长因子1-35ng/ml
葡萄糖 1.25-15μM
2- 巯基乙醇50-150μM。
维生素C是大部分生物的必需营养，是一种抗氧化剂，保护细胞组织免于自由基的威胁。
干细胞生长因子是一种具有刺激自体内源性干细胞生长的高效蛋白质、酶组合，可以快速激活休眠的干细胞并促使其生长，同时可以调节机体内微环境，为干细胞提供有利的生长条件。
L-谷氨酰胺在细胞培养时起到很重要的作用。脱掉氨基后，L- 谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢；在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
表皮生长因子是一种小肽，由53 个氨基酸残基组成，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。
转化生长因子是细胞质内由氨基酸组成的蛋白质，是指两类多肽类生长因子,转化生长因子-α和转化生长因子-β。转化生长因子-α是由巨噬细胞,脑细胞和表皮细胞产生,可诱导上皮发育。转化生长因子-β是一多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。转化生长因子-β属于转化生长因子-β超家族蛋白。转化生长因子-β可以结合到细胞表面的转化生长因子-β受体结合而激活其受体。
成纤维细胞生长因子含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，具有广泛的生物学作用，对多种细胞的生长、分化及功能有影响，可促进细胞组织修复及再生。
葡萄糖是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。
2- 巯基乙醇是一种有机化合物，其化学式为HOCH2CH2SH，它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能团，通常用于二硫键的还原，保护二硫键，从而使蛋白质不被氧化掉而失活。
本发明的有益效果在于：维生素C和2- 巯基乙醇构建了一个较好的脂肪间充质干细胞分裂环境，防止脂肪间充质干细胞在生长的过程中干细胞的组分被氧化而失掉活性，使表皮生长因子、干细胞生长因子、转化生长因子及成纤维细胞生长因子得以在具有活性环境的支持下促进脂肪间充质干细胞的分裂生长，维生素C、L-谷氨酰胺及葡萄糖为脂肪间充质干细胞的生长提供足够的能量，使新生的细胞具有活性；本发明的脂肪间充质干细胞的无血清培养基对脂肪干细胞的增殖起到很好的促进作用，脂肪间充质干细胞在本发明的无血清培养基中存放72h后，脂肪间充质干细胞的杂细胞少，纯度高，存活率高，且活性佳。
优选的，添加成份及其含量如下：
血清替代物6-9％ (v/v)
维生素C 40-85ng/ml
干细胞生长因子1-6ng/ml
L-谷氨酰胺2-4mmol/ml
表皮生长因子5-20ng/ml
转化生长因子 1-6ng/ml
成纤维细胞生长因子 3-30ng/ml
葡萄糖 2-12μM
2- 巯基乙醇70-120μM。
优选的，添加成份及其含量如下：
血清替代物6-8％ (v/v)
维生素C 35-80ng/ml
干细胞生长因子1-8ng/ml
L-谷氨酰胺2-4.5mmol/ml
表皮生长因子1.5-22ng/ml
转化生长因子 1-6ng/ml
成纤维细胞生长因子 5-30ng/ml
葡萄糖 2-15μM
2-巯基乙醇50-150μM。
优选的，添加成份及其含量如下：
血清替代物6％ (v/v)
维生素C 40ng/ml
干细胞生长因子1ng/ml
L-谷氨酰胺2mmol/ml
表皮生长因子5ng/ml
转化生长因子1ng/ml
成纤维细胞生长因子3ng/ml
葡萄糖 2μM
2- 巯基乙醇70μM。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本实施例的脂肪间充质干细胞的无血清培养基由DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物5％ (v/v)
维生素C 30ng/ml
干细胞生长因子0.5ng/ml
L-谷氨酰胺1mmol/ml
表皮生长因子1ng/ml
转化生长因子0.5ng/ml
成纤维细胞生长因子1ng/ml
葡萄糖 1.25μM
2- 巯基乙醇50μM。
实施例2
本实施例的脂肪间充质干细胞的无血清培养基由DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物6％ (v/v)
维生素C 40ng/ml
干细胞生长因子1ng/ml
L-谷氨酰胺2mmol/ml
表皮生长因子5ng/ml
转化生长因子1ng/ml
成纤维细胞生长因子3ng/ml
葡萄糖 2μM
2- 巯基乙醇70μM。
实施例3
本实施例的脂肪间充质干细胞的无血清培养基由DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物7％ (v/v)
维生素C 50ng/ml
干细胞生长因子2.5ng/ml
L-谷氨酰胺3mmol/ml
表皮生长因子10ng/ml
转化生长因子4ng/ml
成纤维细胞生长因子20ng/ml
葡萄糖 8μM
2- 巯基乙醇100μM。
实施例4
本实施例的脂肪间充质干细胞的无血清培养基由DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物9％ (v/v)
维生素C 85ng/ml
干细胞生长因子6ng/ml
L-谷氨酰胺4mmol/ml
表皮生长因子20ng/ml
转化生长因子6ng/ml
成纤维细胞生长因子30ng/ml
葡萄糖 12μM
2- 巯基乙醇120μM。
实施例5
本实施例的脂肪间充质干细胞的无血清培养基由DMEM 基础培养基和添加成份组成，所述添加成份及其含量如下：
血清替代物10％ (v/v)
维生素C 100ng/ml
干细胞生长因子10ng/ml
L-谷氨酰胺5mmol/ml
表皮生长因子25ng/ml
转化生长因子8ng/ml
成纤维细胞生长因子35ng/ml
葡萄糖15μM
2- 巯基乙醇150μM。
对照试验
取将脂肪间充质干细胞群重悬浮，将脂肪间充质干细胞群重悬液置于培养瓶，加入实施例1至5的脂肪间充质干细胞的无血清培养基，以后每24小时更换培养液一次，更换三次，使脂肪间充质干细胞群获得足够养分充分生长，传代3代，待干细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化获得培养后的脂肪间充质干细胞。
以普通脂肪间充质干细胞的无血清培养基采用上述方法培养脂肪间充质干细胞，并与采用实施例1至5脂肪间充质干细胞培养基培养的脂肪间充质干细胞进行对照，结果如表1。
表1普通脂肪间充质干细胞的无血清培养基与实施例1至5脂肪间充质干细胞培养基培养的脂肪间充质干细胞进行对照
由上述对照试验可知，实施例1至5脂肪间充质干细胞的无血清培养基得到的脂肪间充质干细胞比普通无血清培养基得到的脂肪间充质干细胞生长速度快，纯度高，增殖能力强。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。