一种发酵提取剑麻皂素的方法与流程

本发明涉及一种采用发酵从剑麻中提取剑麻皂素的方法。

背景技术：

剑麻又名凤尾兰，是生产硬质纤维的主要经济作物，由于剑麻叶片中纤维的含量仅占其本身的3％～5％，因此在剑麻纤维的加工过程中将产生大量的废弃物，如抽取纤维后产生的麻渣、麻汁等。这些废弃物中含有丰富的皂苷。若将其直接排放或堆放，不仅导致大量资源的浪费，而且会对环境造成严重污染。剑麻皂苷元，素有“医药黄金”和“激素之母”之称，是合成甾体激素类药物的医药中间体，可用于合成哺乳动物信息素、皮质激素药物、促进蛋白同化与心血管疾病的甾体药物以及抗心律失常药等药物。剑麻皂苷元在剑麻中以皂苷的形式存在，甾体皂苷的C3位和C26位通过皂苷键与糖链相连，因此，要制备剑麻皂苷元，必须水解皂苷键，将剑麻皂苷降解为不溶于水的皂苷元，然后再提取、分离及纯化。

传统工艺是以浓硫酸或浓盐酸作催化剂进行水解反应，使剑麻麻膏中皂苷降解成皂苷元后，过滤，用水洗至pH＝5-7，滤饼干燥后即为水解物产品。传统方法提取剑麻皂苷元过程使用大量的酸，不仅破坏了皂苷元的结构，造成皂苷元提取率低，还产生大量废水、废渣，对环境污染极其严重，同时，强酸的使用对设备和管道有腐蚀，且反应过程需要加热甚至加压，反应条件比较苛刻。近年来，很多研究者提出采用微生物转化法等对其直接酸解法进行改进。采用不同的微生物进行发酵，其机理不尽相同，导致提取率也不同。现有的微生物发酵提取剑麻皂素提取率并不是很理想。

技术实现要素：

为了解决现有的提取剑麻皂素和海柯吉宁的方法所存在的产品收率低，需要用到强酸、强碱或者有机溶剂不仅污染环境而且毒性大，工艺复杂，成本高等问题，本发明提供了一种发酵法提取剑麻皂素的方法。

本发明的技术方案为：一种发酵提取剑麻皂素的方法，包括：

将嗜乙醇假丝酵母接种到包括剑麻抽取纤维后产生的麻渣和/或麻汁的液体发酵培养基进行发酵得到发酵液，然后从中提取剑麻皂素；

所述液体发酵培养基包括：KNO₃ 1.5～3g/L、K₂HPO₄ 0.8～1.5g/L、KCl 0.4～0.8g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4～0.8g/L、FeSO₄·7H₂O 0.008～0.015g/L。

在一个具体实施方式中，先将嗜乙醇假丝酵母菌种接种到液体复壮培养基中培养后再用于发酵。

在一个具体实施方式中，嗜乙醇假丝酵母接种量为8～15％。

在一个具体实施方式中，35～38℃下发酵。

在一个具体实施方式中，搅拌发酵，搅拌速率150～200rpm.

在一个具体实施方式中，发酵时间2～3天。

在一个具体实施方式中，将发酵液离心，弃上清得到沉淀物，提取沉淀中的剑麻皂素。

在一个具体实施方式中，沉淀物烘干后，加入甲醇超声波浸提。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.现有的提取剑麻皂素和海柯吉宁的方法产品收率和纯度低，需要用到强酸、强碱或者有机溶剂不仅污染环境而且毒性大，工艺复杂，成本高，本发明所用的为生物菌种发酵法，节能环保，产量高。

2.相比于其他菌种，例如黑曲霉，剑麻皂素含量显著提高。

3.传统发酵，菌种杂乱，发酵周期长，本发明所用单一菌种嗜乙醇假丝酵母发酵，将发酵周期大大缩短，极大地提高了发酵效率。

4.直接通过菌发酵，一步到位，省时省力。

附图说明

附图1为剑麻皂苷测定的标准曲线图，按照比色法绘制标准曲线，剑麻皂苷质量为0.1mg-0.7mg，曲线方程为y＝1.7686x+0.1133,R²＝0.9938,相关性较好，可以用来测定发酵液中皂苷质量。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

为选择更适合用于本发明提取剑麻皂素的菌种，本发明人从自然发酵剑麻渣水中分离纯化得到一株纯菌种，通过鉴定，确定该菌种为嗜乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)。进而发现，采用嗜乙醇假丝酵母进行发酵提取剑麻皂素可以使得剑麻皂素含量显著提高。

本发明所用嗜乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)可市购。也可以从自然发酵剑麻渣水中分离纯化得到，先进行复壮培养。

制作剑麻皂苷标准曲线方法如下：精密称量剑麻皂苷标准品4mg，用甲醇定容至5ml，分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0..6、0.7ml剑麻皂苷溶液于25ml具塞试管中，以空白管做对照，在70℃下烘干后冷却至室温，依次在各管中加入0.2ml5％香草醛冰醋酸溶液，0.8ml高氯酸，摇匀后置于70℃烘箱加热15分钟，取出后迅速用冷水冷却至室温，再分别加入5ml冰醋酸，摇匀，于450nm处测定吸光值，以质量为横坐标，吸光度为纵坐标制备标准曲线。标准曲线为y＝1.768x+0.113，R²＝0.993，相关性良好，如图1。

实施例1

在本实施例中，从剑麻中提取剑麻皂素的方法包括：

(1)将剑麻渣水制成液体发酵培养基。

将剑麻抽取纤维后产生的麻渣加水，搅拌充分后得剑麻渣水，高温灭菌后备用；

液体发酵培养基组分为：KNO₃ 2g；K₂HPO₄ 1g；KCl 0.5g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；FeSO₄·7H₂O0.01g；剑麻渣水(灭菌)1000ml；pH自然。

(2)将嗜乙醇假丝酵母菌种接种到液体复壮培养基中培养。

培养条件具体为：180rpm，28℃恒温培养；

液体复壮培养基组分为：马铃薯200g(切碎、煮沸煮烂、过滤留下滤液，蒸馏水补足至1000ml)；葡萄糖20g；KH₂PO₄ 3.0g；MgSO₄·7H₂O 1.5g；Vitamin B₁ 0.1g；

(3)用复壮后的嗜乙醇假丝酵母液体菌种接种发酵液体培养基进行发酵。

接种量为10％(嗜乙醇假丝酵母液体菌种和液体发酵培养基以1:10的体积比)，在180rpm，37℃下进行搅拌发酵3天得到发酵液。

(4)从发酵液中提取沉淀。

取发酵液，离心，弃上清，得到沉淀物；

具体的，从接种开始，每隔24小时取一次发酵液，共取3次；每次45mL；离心条件为4500r/min、4℃；

(5)提取沉淀中的剑麻皂素。

沉淀物烘干，称取质量，加入甲醇超声波浸提，测定提取物中皂苷含量；

具体的，烘干条件为：75℃，2h；甲醇加入量为：20ml/g(即1g沉淀干重加入20ml甲醇)；超声浸提时间为：60min。

测定提取物中皂苷含量方法具体为：取上清液0.5ml置于25ml具塞试管中，以空白管对照，在70℃下烘干后冷却至室温，依次加入5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀后置于70℃烘箱中加热15min，取出后迅速流水冷却至室温，再分别加入5ml冰醋酸，在450nm处测定吸光度。

实施例2

具体步骤和参数与实施例1相同，所不同的是：

液体发酵培养基：KNO₃ 1.5g/L、K₂HPO₄ 0.8g/L、KCl 0.4g/L、MgSO₄·7H₂O 0.8g/L、FeSO₄·7H₂O 0.015g/L；

接种量为8％；35℃下发酵；发酵时间1-3天；

烘干条件为：65℃℃，3h，超声浸提时间为：90min。

实施例3

具体步骤和参数与实施例1相同，所不同的是：

液体发酵培养基：KNO₃ 3g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、KCl 0.8g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、FeSO₄·7H₂O 0.008g/L；

接种量为15％；38℃下发酵；发酵时间1-3天。

本发明实验结果对比如下表：

经结果分析对比，在自然条件下不做任何处理发酵剑麻渣水与摇匀振荡发酵剑麻渣水所产生剑麻皂素含量均偏低，且发酵周期偏长。而本发明用纯化的嗜乙醇假丝酵母发酵法发酵剑麻渣水同比，发酵周期短(24-72h)且产量高。并且，嗜乙醇假丝酵母菌发酵效果明显优于黑曲霉。