一种灰霉病菌实验室材料的常备形态及其制备与应用方法与流程

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种灰霉病菌实验室材料的常备形态及其制备与应用方法。

背景技术：

作物灰霉病是葡萄、番茄、黄瓜等作物的重要病害，发病严重时可给生产造成重大经济损失。防病控害的有关研究，通常都要使用灰霉病菌(Botrytis cinerea)材料。灰霉病菌在普通培养基上容易生长，菌丝体发达；在实验室工作中，通常用试管斜面培养基将灰霉病菌培养成斜面菌落，并以菌落的菌丝体材料作为日常工作的常备材料。有关研究工作的出发点均以菌丝体材料为起始，通过移植常备材料菌丝体，进行扩大培养或进入具体项目的研究工作。这种以菌丝体作为日常工作材料的常备形态，通常较简单方便，不过也存在某些不足，如下：

在与生长速率(或生长量)测定有关的研究工作(如生长发育的影响因素测定，药物的抑制作用测定等)中，往往需要菌丝体的定量移植，而移植培养基中的菌丝体却很难做到准确定量，至今的常规方法是需要先移植菌丝体到培养平板上扩大培养，然后用打孔器在扩大培养的平板菌落上打取等同直径的菌丝块，以此菌丝块进行定量移植；这种定量方式不仅要增加一段扩大培养的程序环节，而且由于培养平板的厚薄不一致，以及菌落不同部位菌丝体的密集程度、生理状态等也有差异，造成不同菌丝块之间难以达到较高的一致性。

许多研究工作(如孢子萌发的影响因素，病害接种等)，使用的直接材料通常是分生孢子，同样要将常备材料(菌丝体)移植到合适的培养基，先行孢子制备培养工作，获得孢子后才能实施相关工作。这相当于相关工作进程需要延后，不能及时开展。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种灰霉病菌实验室材料的常备形态及其制备与应用方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种灰霉病菌实验室材料的常备形态，是用灰霉病菌的分生孢子作日常工作的常备形态；分生孢子纯净无污染；分生孢子存放于无菌水中；分生孢子暂停生长发育，但转到培养基上能马上恢复正常生长发育。

一种灰霉病菌实验室材料的常备形态的制备与应用方法，制备与应用方法步骤如下：

1.分生孢子的制备培养

用三角瓶作培养器具，装盛马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，该培养基的组分配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；将灰霉病菌的菌丝体移植入三角瓶内的产孢培养基上，在合适的温度下培养，直到培养基面上形成菌落和分生孢子。

2.灰霉病菌材料常备形态的制备

取无菌水注入步骤1培养获得的产孢菌落上，轻轻洗脱菌落上的孢子，获得含有菌丝碎段的孢子液；用灭菌纱布过滤去除该孢子液中的菌丝碎段；将该孢子液进行离心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混杂的菌体代谢产物和培养基组分；剩下的沉淀为纯净的分生孢子；以该纯净分生孢子作为灰霉病菌材料的常备形态；用无菌水将沉淀孢子悬浮，搅动使孢子充分分散，获得灰霉病菌材料的常备孢子液。

3.灰霉病菌材料常备形态的孢子含量标定

用无菌水将步骤2获得的常备孢子液的孢子浓度，调配为10⁶孢子/mL。

4.灰霉病菌材料常备形态的日常存放

在无菌条件下，将步骤3标定的常备孢子液分装到有盖密闭的灭菌容器内，并转移到20℃的暗环境中存放备用。

5.灰霉病菌材料常备形态的应用

将步骤4存放的灰霉病菌材料常备孢子液转到超净工作台，振荡装存常备孢子液的容器，使分生孢子充分悬浮和分散；开盖后用移液器定量吸取孢子液，移植到相关的工作环节或实验程序中；吸液移植操作完毕后回盖密封，将剩余的常备孢子液转回步骤4的存放处存放。

本发明的特色与优点是：

1)常备形态的分生孢子在纯水中暂停生长但能长期保持活力，一旦转到培养基，能马上恢复正常生长。

2)可在相关工作中随时应用，能为需要分生孢子的试验环节直接提供菌体材料，可省去使用菌丝体作为常备材料时，需要反复制备培养孢子的工作程序，工作方便快捷。

3)用三角瓶作培养器具，容易获得无污染的孢子液，制备获得的常备形态质量较高。

4)能标定常备孢子液的孢子含量，应用时可以准确定量取用，利于技术方法标准化。

附图说明

图1是取本发明的灰霉病菌常备孢子液5μl，移植并点到培养平板上，培养2.5天后形成的菌落。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。

在灰霉病的有关研究中，通常采用灰霉病菌的菌丝体材料作常备形态，每次需要分生孢子材料时，均要移植常备菌丝体到新的培养基上扩大培养和制备培养孢子。当前还未见有应用分生孢子作常备移植体的技术思想和技术应用。发明人在研究工作中发现灰霉病菌的分生孢子在纯水中能暂停生长发育，但转到培养基上能马上恢复正常生长发育；利用此有利的的生物学特性，本发明设计灰霉病菌实验室材料的另一种常备形态，就是以灰霉病菌的分生孢子材料作常备形态，以及该常备形态的制备与应用技术。

一般病原菌的孢子形成发育，往往需要良好的通气条件，培养皿通气性良好，因而实验室通常用培养皿作培养器具进行产孢培养；但正是由于培养皿通气良好，造成培养皿内材料容易污染。发明人发现在相对封闭的三角瓶内，灰霉病菌也能正常产孢，而三角瓶阻止污染的效果非常好，因而采用三角瓶作培养器具进行产孢培养。

灰霉病菌可在许多培养基上生长并形成分生孢子，本发明采用实验室常用的马铃薯葡萄糖培养基，其配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL。灰霉病菌在三角瓶装盛的马铃薯葡萄糖培养基上，在温度为23℃的条件下培养7～9天，可在培养基面上形成和布满大量产孢的菌落。

产孢菌落上的分生孢子可用无菌水洗涤收集，用玻棒或小毛刷等工具轻轻抹洗菌落就能将孢子洗涤释放到无菌水中。

收集孢子的洗涤操作会导致培养基组分和菌落菌丝体的外泌代谢物溶解在孢子液中，这些物质可能容易导致孢子的生长或失活，因而需要去除；可采用离心沉淀孢子方式去除这些物质。

作为灰霉病菌材料常备形态的孢子液，孢子浓度可高可低，考虑到过高浓度可能会影响孢子的活性，以及与后续应用的需要匹配，将常备孢子液的孢子浓度调整在10⁶孢子/mL较为适宜，孢子的数量用血球计数板测定。

装存灰霉病菌材料常备孢子液的容器应采用可灭菌及可盖封密闭的器具，如普通冷冻管或离心管等，用5mL冷冻管装存较为实用方便；需要装存量较多的，可用三角瓶或大冷冻管(或大离心管)。

存放环境以室温为宜，发明人发现在温度为20℃的暗环境存放效果好。

使用灰霉病菌常备孢子液前，需要将常备孢子液振荡，使已沉淀的孢子重新悬浮和分散均匀。在无菌条件下用移液器取出常备孢子液，可直接用于相关的试验工作环节，如灰霉病菌的平板培养，或灰霉病的人工接种等。常备孢子液中的孢子分散性好，菌体液的均匀一致性高，加上液体容易准确定量吸取，因而，本发明的常备孢子液特别有利于需要定量移植菌体的培养工作，如测定灰霉病菌生长发育的影响因素，测定药物的抑制作用等。定量移植5μL本发明的常备孢子液于培养平板上培养，3天后灰霉病菌的菌落如图1所示。

为降低实验操作导致常备形态孢子液污染的机率，应尽量减少从装存常备孢子液的容器内反复吸取液体的频率，实际工作可按试验设计的需要，一次性全部吸取够整次试验用的孢子液量，置于另外的灭菌容器内，再从该容器内逐一定量吸取孢子液，移植到各个培养平板、三角瓶培养基、或各个寄主接种部位、等相关的工作环节或实验程序中。

实施例1

应用本发明一种灰霉病菌实验室材料的常备形态及其制备与应用方法，培养制备获得番茄灰霉病菌菌株Bc-1以分生孢子为菌体的实验室常备形态材料；制备与应用菌株Bc-1材料的常备形态按如下步骤实施操作：

1.分生孢子的制备培养

用三角瓶作培养器具，装盛马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，该培养基的组分配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；将灰霉病菌菌株Bc-1的菌丝体移植入三角瓶内的产孢培养基上，在23℃温度下培养7天后，培养基面上的菌落形成大量的分生孢子。

2.灰霉病菌材料常备形态的制备

取无菌水注入步骤1培养获得的产孢菌落上，轻轻洗脱菌落上的孢子，获得含有菌丝碎段的孢子液；用灭菌纱布过滤去除该孢子液中的菌丝碎段；将该孢子液进行离心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混杂的菌体代谢产物和培养基组分；剩下的沉淀为纯净的分生孢子；以该纯净分生孢子作为灰霉病菌材料的常备形态；用无菌水将沉淀孢子悬浮，搅动使孢子充分分散，获得灰霉病菌菌株Bc-1的常备孢子液。

3.灰霉病菌材料常备形态的孢子含量标定

用无菌水将步骤2获得的常备孢子液的孢子浓度，调配为10⁶孢子/mL。

4.灰霉病菌材料常备形态的日常存放

在无菌条件下，将步骤3标定的常备孢子液分装到5mL冷冻管内，并转移到20℃的暗环境中存放备用。

5.灰霉病菌材料常备形态的应用

将步骤4存放的灰霉病菌材料常备孢子液转到超净工作台，振荡装存常备孢子液的容器，使分生孢子充分悬浮和分散；开盖后用移液器吸取孢子液使用；吸液操作完毕后回盖密封，将剩余的常备孢子液转回步骤4的存放处存放。

用移液器定量吸取该常备孢子液5μL，移植到马铃薯葡萄糖培养平板中部，23℃培养2.5天后，生长形成如图1所示的典型菌落。

实施例2

应用本发明一种灰霉病菌实验室材料的常备形态及其制备与应用方法，培养制备获得番茄灰霉病菌菌株Bc-2以分生孢子为菌体的实验室常备形态材料；制备与应用菌株Bc-2材料的常备形态按实施例1的步骤1至步骤5实施操作，不同的只是步骤1所用的菌株是Bc-2，步骤2获得的是菌株Bc-2的常备孢子液。

用移液器吸取常备孢子液5μL，移植到马铃薯葡萄糖培养平板中部，23℃培养2.5天后，生长形成如图1所示的典型菌落。